VN은 왕립 학회에 의해 지원됩니다. JPR은 호주 연구위원회 미래 연구원 (FT0992129)입니다. 우리는 비판적으로 원고를 읽는 박사 미리 암 포드 감사합니다.

주 : 달리 명시하지 않는 한 모든 단계는 상온에서 수행됩니다. 1. 식물 재료 및 버퍼의 준비 <ol><li> N.에 대한 benthamiana <ol><li> 아그로 박테 리움 (이 예에서는 PRF-FLAG, PRF-3xHA, PTO-FLAG 및 제어와 같은 빈 벡터) 28에서 액체 배양 (적절한 항생제 L 매체)에 (200 RPM)을 흔들어 일시적 발현에 대한 관심의 변종을 투메 파시 엔스 성장 고정상 때까지 C를 °. </li><li> 수집하고 원심 분리 (5 분 3,000 XG)에 의해 아그로 박테리아 펠렛. 뜨는을 취소하고 침투 버퍼에 펠렛 아그로 박테리아를 재현 탁. </li><li> 600 ㎚의 흡광도에서의 광학 밀도 (OD) 값 (ABS 600 NM)를 획득하여 아그로 박테리아의 양을 측정한다. 0.1 ~ 0.8에 박테리아의 OD를 조정합니다. </li><li> 사주 오래된 N. 침투 한에 의한 아그로 박테리아와 benthamiana 공장 (22 ° C, 16 시간 등)(1 ㎖의 무 바늘 주사기) 또는 진공 (0.02 % V / V의 계면 활성제를 추가)로 D. 주 : 처음으로 거의 완전히 확장 잎을 사용하고, 가장 효과적인 단백질 발현에 대한 두 개의 즉시 오래된 잎. 유비퀴틴 또는 아세틸 화 단백질의 검출을 위해 100 nm의 MG-132 또는 100 NG / ML Trichostatin A, 각각 1에서 2 일째 침투와 잎에 침투. </li><li> 침투 잎 2~5일 후 침투와 액체 질소에 동결을 수확. -80 ° C 냉동고에 샘플을 저장합니다. 참고 : 미리 오일의 시간 과정을 통해 샘플을 채취하고 면역 블 롯팅에 의해 단백질 수준을 검출하여 그 단백질의 발현 수준을 결정 유용한. </li></ol></li><li> A.에 대한 장대 안정 유전자 변형 라인 <ol><li> A. 성장 6 - 웰 플레이트에있는 장대 씨앗이 잘 당 액체 MS 배지 ​​5 ㎖ (V 자당 / W 1 %)로 보충. 유전자 변형 라인의 다섯 씨앗 (살균 및 계층화)에 세 가지를 넣고관심이나 잘 당 변형되지 않은 제어 라인의. 성장 방에 접시를 전송하기 전에 이틀 동안 200 rpm으로 흔들어는 2 주 (22 ° C에서, 10 시간 등)에 둡니다. </li><li> 수확 샘플 및 액체 질소에 동결. 참고 : 컨트롤로 관심의 단백질과 같은 태그로 관련이없는 단백질을 발현하는 형질 전환 라인을 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 버퍼 <ol><li> 1 ~ 2 시간 동안 버퍼 A. 드 가스에게 버퍼를 준비합니다 (RLKs를 들어, 다른 막 결합 단백질과 핵 단백질, 1 %의 v / V의 IGEPAL CA-630 53 추가). 참고 : 무기한 4 ° C에서 버퍼를 유지할 수 있습니다. 당신은 트리톤 대신 IGEPAL CA-360 V / 1 % V를 사용할 수 있습니다. </li><li> 추출하기 전에 차가운 버퍼 B 적어도 1-2 시간의 80 ML을 준비합니다. 참고 : 추출 버퍼 대 조직의 이상적인 비율은 1:4 (W / V)입니다. </li></ol></li></ol> 2. 단백질 추출 <ol><li> 직전 추출에 찬 버퍼 C. 80 ML을 준비 <li> N. 20 g의 갈기 benthamiana 조직 (약 15 잎) 또는 A. 박격포와 유 봉을 사용하여 액체 질소에 장대 모종 (6 잘 플레이트 당 2~4g). </li><li> 지상 조직의 20g에 찬 버퍼 C 80 mL를 넣고 잘 섞어 얼음에 해동. 참고 : 같은 시간 (이자 및 제어의 단백질)에서 모든 샘플을 갈기. </li><li> (4 ° C에서 prechilled) 조직의 균질화와 최고 속도로 10 초마다 3 버스트와 균질화. 4에서 30 분 동안 30,000 XG에 22 ~ 25 ㎛의 조직과 원심 분리기를 통해 필터 ° C. 참고 : 또한, 신선한 prechilled 박격포와 유 봉 균질화. </li><li> 선호도 행렬의 차단 및 세척 단계는 버퍼 D. 20 ㎖를 준비 </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 1 % BSA를 함유하는 냉각 버퍼 D 500 ㎖를 사용하여 적당한 친 화성 기질의 블록 100 ㎖ ° C. 참고 : 기본 AF를finity 행렬은 안티-FLAG M2 아가로 오스, 스트렙 타비 딘 아가로 오스, GFP-Trap_A 및 안티-HA 아가로 오스 (가) 있습니다. </li><li> 1 ㎖ 찬 버퍼 D. 씻을 배 </li><li> 얼음에 새 튜브에 0.45 μm의 주사기 필터를 통해 잎 추출물 및 필터의 상층 액을 제거합니다. 참고 : 추출 색깔은 녹색 또는 노란색이어야한다 샘플이 갈색 설정 한 경우, 삭제하고 다시 시작하십시오. </li><li> , 면역 블롯의 조 추출물의 분취 량을 5 배 SDS-PAGE 로딩 버퍼, 소용돌이를 추가하고 80 ~ 100에서 10 분 동안 끓는 샘플에 의해 변성 열 블록에 C를 °. </li></ol> 3. 단백질 면역 침전 <ol><li> 두 개의 50 ㎖ 튜브에 단백질 추출물을 분할하고 각 튜브에 버퍼 D에 현탁 선호도 행렬의 50 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 2 시간 동안 부드러운 회전을 품다 참고 : 긴 배양 수율을 증가 발견되지 않았습니다. </li><li> 에 추가하여 용출 버퍼 600 μL (친 화성 행렬의 6 배 비드 볼륨)를 준비버퍼 D (최종 농도) : 0.5 % BSA, (항-FLAG M2 아가를위한) 0.25 ㎎ / ㎖의 FLAG 펩티드 또는 (스트렙 타비 딘 아가를위한) 10 mM의 D-비오틴. 참고 : 용출은 GFP-Trap_A 및 안티-HA 행렬의 경우 사용하지 않는 것이 좋습니다, 그래서 1X SDS-PAGE 로딩 버퍼에 끓는 직접 진행, 3.11 단계. </li><li> 4 ° C (1,000 XG에서 5 분)에서 원심 분리하여 친 화성 기질을 침전. </li><li> , 이뮤위한 언 바운드 추출물의 분액을 상청액의 나머지를 폐기, 튜브의 저부에 약 500 μl를두기. </li><li> 넓은 구멍 팁 슬러리 용액을 재현 탁. </li><li> 하나의 1.5 ML 튜브에 두 튜브의 혼합 슬러리 용액을 전송합니다. 참고 : 이제부터의 미세 튜브를 결합 1.5 ml의 낮은 단백질을 사용합니다. </li><li> 친 화성 기질을 침전 상층 액을 제거하는 벤치 탑 원심 분리기를 사용하여 5 초 동안 맥박 배. </li><li> 세척 사이에 1 ㎖ 찬 버퍼 D.로 3 배 씻어 선호도 마트 리에게 침전X로 이전에 설명하고 상층 액을 버린다. 마지막 세척에 주사기의 바늘을 초과 버퍼 D를 제거합니다. 주 : 0.1 % IGEPAL와 버퍼 D를 사용하여, 최종 세척은 더 비특이적 결합을 감소시키기 위해 사용될 수있다. </li><li> 일정한 진탕 (항-FLAG M2 또는 스트렙 타비 딘 아가로 오스를 참조 단계 3.2) 적절한 용출 버퍼 200 μl의 3 배, 5 분으로 각각의 시간을 용출. </li><li> 하나의 튜브에 3 용출액 해변. 흡수성 수지의 30 μl를 사용하여 단백질을 집중한다. 소용돌이, 5 분간 방치 수지 (10,000 XG에 2 분)을 침전 할 수 있습니다. 상층 액을 버린다. 참고 : GFP - Trap_A 및 안티-HA 아가로 오스를 들어, 단계 3.9와 3.10를 건너 뜁니다. </li><li> 침전 된 친 화성 기질 또는 흡수 수지에 1X SDS-PAGE 로딩 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 80 ~ 10 분 동안 소용돌이 끓인다 열 블록에 C를 °. </li><li> X g 만에 2 분 동안 삶은 친 화성 기질 또는 수지를 원심 분리기. supernatan의 나누어지는 5 μL면역 블롯을위한 T 및 ~ 10cm 길이 SDS-PAGE 겔 (그림 2)에 다른 분수를 실행합니다. </li><li> 별도의 분리 (그림 2) 필요한 경우 질량 분석에 의한 분리 및 인산화 단백질의 식별을 위해, ~ 19 cm 길이 SDS-PAGE 겔에 나머지 45 μl를로드합니다. 주 : 빈 레인 시료의 오염을 감소시키기 위하여 모든 샘플 사이에 포함 할 수있다. </li></ol> 4. 단백질 소화 <ol><li> 콜로이드 쿠마시 브릴리언트 블루 (CCBB) 얼룩 SDS-PAGE 젤 얼룩. 주 : 각질과 오염을 줄이기 위해 겔의 취급을 최소화. 장비 나 도구 중에 면역 블롯 또는 잔류 단백질 오염을 남아있는 수있는 다른 활동에 사용되지 않았 음을 확인합니다. </li><li> 물에 풍부한 세척, 바람직하게는 O / N.와 젤 Destain 깨끗한 면도날로 젤에서 관심의 밴드를 잘라. 주 : 면역 블롯과 젤을 맞 춥니 경우 necessa올바른 영역을 찾습니다 공예. 인산화는 SDS-PAGE에서 단백질의 이동을 지연시킬 수있는 바로 그 밴드의 위쪽과 아래쪽 영역을 잘라. </li><li> (이것은 젤 피펫 팁을 차단하지 않고 튜브의 솔루션에 포함되는 것을 보장) 2~4mm의 큐브로 겔 슬라이스를 주사위. 튜브에 넣습니다. </li><li> 젤 잘 잠수를 유지하는 데 필요한 크기를 예측합니다. 유도체, 단백질 분해 효소와 펩타이드 추출과 배양이 금액을 사용하고 세탁 트리플 볼륨에 두 번을 사용합니다. 참고 : 일반적으로, 컷 젤 조각의 약 100 ㎕ 씩 소화 세탁을 500 μL 솔루션, 탈수 2 × 180 μL, 감소, 알킬화 120 μL, 소화 120 ㎕의 150 μl를 사용합니다. </li><li> (50 mM의 중탄산 암모늄, ABC의) 50 % 아세토 니트릴을 추가하여 젤 조각 2 X 20 분 (또는 탈 염색시킨까지)를 씻으십시오. 젤 조각을 제거하지 않도록주의하면서 솔루션을 피펫. </li><li> 100 % 아세토와 탈수5 분 니트릴 무​​료 액체를 제거합니다. 참고 : 젤이 수축과 흰색 나타납니다. 파란색이 지속되면, 아세토 니트릴 / ABC 및 / 또는 높은 온도 (45 ~ 55 ℃)에서 더 이상 품어. </li><li> 물에 10 mM의 DTT를 첨가하여 단​​백질 이황화 결합을 감소 떨고으로 56 º C에서 30 ~ 45 분 동안 품어. 무료 액체를 제거합니다. </li><li> 20 ~ 30 분 (실내 온도, 어두운)에 대한 (50 mM의 ABC에서) 55 밀리미터 클로로 아세트 아미드의 첨가에 의한 킬레이트 시스테인 잔기. 무료 액체를 제거합니다. </li><li> (50 mM의 ABC에서) 50 % 아세토 니트릴로 젤 조각 2 × 10 분을 씻으십시오. 무료 액체를 제거합니다. </li><li> 5 분 동안 100 % 아세토 니트릴로 젤 조각을 탈수 무료 액체를 제거합니다. </li><li> 트립신의 경우, 소화 트립신 작업 용액 40 μL (소화 버퍼 트립신 100 NG : 50 mM의 ABC, 평균 매시 묻은 밴드 5 % 아세토 니트릴)를 추가합니다. 젤 조각을 10 분 동안 재수 할 수 있습니다. 필요한 경우 젤 조각을 충당하기 위해 소화 버퍼를 충분히 추가합니다. 37 º C에서 알을 품다O / N. </li><li> 소화를 중지하고 젤 조각에서 펩타이드를 추출, 5 % 포름산 (50 % 아세토 니트릴) (소화 볼륨과 동일한 볼륨을 추가)를 추가합니다. 5 ~ 10 분 동안 초음파 처리. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 추출 배를 반복합니다. </li><li> 동결 건조 (권장) 또는 (예 : 속도-Vac 또는 학자 등) 진공 농축기에 의해 펩티드를 건조. -20 º C에서 저장 </li><li> 질량 분석을 위해 샘플을 제출합니다. 참고 : 우리는 세 인스 버리 연구소 (노리치, UK)에서 질량 분석 시설에 샘플을 제출했다. 질량 분석 시설에서 프로토콜은 상당히 다양하지만, 일반적으로 펩티드는 탠덤 질량 분석법을 스프레이보기 ELECTRO하도록 결합 된 액체 크로마토 그래피 시스템 상에 로딩하기 전에 2 % 아세토 니트릴과 0.2 % 트리 플루오로 아세트산에 용해 될 것이다. </li></ol>

저자는 (금융 또는 기타) 더 경쟁의 이익이 없다는 것을 선언합니다.

PAMPS과 음향에 의해 수용체 활성화의 메커니즘을 해명하는 식물 면역에 대한 우리의 이해에 크게 기여할 수있다. 지난 20 년 동안, 유전과 효모 두 하이브리드 화면은 PRRS와 NB-LRR 단백질의 발견을위한 수단이되고있다. 더 최근에, 질량 분석 기반 프로토콜은 55-58 시그널링 면역 그들의 PTMS 11,33,59,60 중에 차등 조절 단백질의 식별을 위해 설립 된, 면역 복합체 (61)와 음향의 조성물 (62)을 목표로한다. 여기에서 우리는 면역 복합체의 활성화를 조절 PTMS의 식별을위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 앞서 설명한 프로토콜과 비교하여, 프로토콜 PTMS의 동적 변화의 상세한 식별을 허용한다. 대규모 단백질 체학 접근 방식의 프로토콜은 단백질의 PTMS을 확인하지만 제한으로 인해 PTMS의 사이트 가소성을 공개 할 수없는 수ED는 단백질의 양은. 단백질 인산화의 경우, 대규모 프로테오믹스 접근법은 전형적으로 우세한 인산화 사이트 11,33,59 식별. 단백질 인산화 상태의 상세한 특성화는 목적 단백질의 정제 (47)의 부분을 통해 얻어 질 수있는 단백질의 상당한 양을 필요로한다. 프로토콜은 정제 된 단백질의 질량 분광법 분석으로, 커플 코코 표적 단백질의 상당한 양을 산출 단백질 정제 방법을 설명했다. 이 프로토콜에 따라, PTO의 단일 인산화 이벤트는 이전에 52 설명한대로 빼앗아-198에 주로 기인하지만, 일부 질량 분석 스펙트럼은 THR-195 또는 THR-199에 대한 하나의 인산화 이벤트를 지원했다. PTO의 이중 인산화 이벤트를 관찰 할 때 다른 사이트에 조합도 관찰되었다하더라도, 인산화 아미노산의 주된 조합 (SER-198과 THR-199이었다표 1). 이러한 결과는 명확 단백질 키나제의 인산화 사이트 가소성 및 세부에서 모든 가능한 인산화 사이트의 특성을 설명하는 프로토콜의 능력을 보여준다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 단백질의 1) 충분한 추출, PTMS 2) 보호하고, 목적 단백질의 3) 충분한 양의. 우선, 단백질의 충분한 추출을 위해, 그것은 액체 질소에서 조직을 분쇄하고이어서 프로토콜에 설명 된대로 조직 균질화기를 사용하는 것이 중요하다. 조직의 균질화를 사용할 수없는 경우, 박격포와 유 봉 사용할 수 있습니다. 그것은 세 (또는 네) 추출 완충액 용적에 조직의 그램의 하나의 비를 사용하는 것 또한 중요하다. 비와 우리가 제안 고강도 버퍼를 버퍼링이 조직은 pH가 추출 과정 동안 중립 남아 있는지 확인한다. 우리는이 A.를 위해 특히 중요하다 발견 장대, 토마토 추가ctions 52. PTMS 보호는 모든 버퍼 PTMS를 제거하는 효소의 적절한 억제제에 포함시킴으로써 달성 될 수있다. 그것은 4 ° C에서 모든 단계를 수행하고 버퍼와 악기를 prechill하는 것이 중요합니다. 목적 단백질의 높은 수율은 충분한 양의 단백질을 발현하는 식물을 이용하여 조직 (약 20 g)의 많은 양을 사용함으로써 달성 될 수있다. 표적 단백질의 충분한 양을 획득하기위한 가장 중요한 단계는 직접 면역 침전에 의해 목적 단백질을 농축한다. 이 단계의 중요성으로 인해 coimmunoprecipitated PTO (그림 2B)의 제한된 양을 PRF 면역 후 PTO의 PTMS를 확인하는 우리의 실패에 의해 강조된다. 대조적으로, PTO의 직접적인 면역는 단백질 서열 및 PTMS (표 1)의 식별의 약 80 % 범위에 이르는 실질적으로 추가 측정 펩티드 (도 2c)를 수득 하였다. 우리는 또한 성rongly 단백질 면역에 대한 에피토프 태그의 사용을 추천합니다. 기본 단백질 에피토프 태그 친 화성 기질에 대해 제기 항체에 비해 부분적으로 정제 된 단백질의 높은 금액을 얻을 수 있습니다. 면역에 대한 기본 PTO 단백질 51 (그림 2A)에 대해 제기 항체를 사용하여, 우리는 PTO의 두 가지 주된 인산화 사이트의 단지 하나의 인산화를 식별 할 수 있었다. 이 프로토콜은 주로 N.의 부분 정제 개발되었다 benthamiana 세포질 단백질과 그들의 인산화 사이트의 후속 식별. 그러나, 본원에 기술 된 변형을 사용하여,이 프로토콜 A. 쉽게 적응 될 수있다 장대 단백질과 막 결합 단백질. 이 프로토콜의 주요 목적은 PTMS의 식별을위한 표적 단백질의 충분한 양을 수득하고 복합체의 높은 순도를 달성 할 수 없습니다. 만약 더 높은 순도복합체가 필요한 정제의 제 2 단계 (52)는이 프로토콜에 부가 될 수있다. 그 경우, 첫 번째 단계는 가혹한 용출 조건을 요구하는 높은 염 또는 산의 사용 및 후속 단계없이 친 화성 기질로부터 목적 단백질의 용출이 행렬을 수반 할 수있다. 그것은 우리가 단지 인산화 사이트의 식별을 위해이 프로토콜을 시험하고 우리는 현재 추가 PTMS의 자세한 식별 능력을 테스트하고 있다는 것을 강조하는 것이 중요하다. 우리의 대표적인 결과가 명확 단백질 키나제의 인산화 사이트 가소성 및 인산화 사이트의 특성을 설명하는 프로토콜의 능력을 보여준다. 가장 중요한 것은, 그들은 질량 분석에 의해 자동 인산화 사이트의 하나의 점 돌연변이에 의해 단백질의 적은 양에 의존하는 인산화 사이트의 식별이 혼란 결과를 얻을 수 있다는 것을 강조. 우리는 여기에서 이전에 보여 47 </sup&gt; 빼앗아-198과 THR-199 PTO의 이중 인산화는 같은 Prf / PTO 단지의 활성화와 연결되어 있습니다. 반면, 이전에 발행 된 결과 47,63가 빼앗아-198과 THR-199의 단일 점 돌연변이 (point mutation)가 복잡한 활성화를위한 전제 조건이 사이트의 인산화를 제안 신호 할 수있다,이 사이트에 인산화되지 않도록하는, 알라닌하는 것으로 나타났습니다 . 이 결과는 지금 차 사이트의 Thr-195의 인산화에 의해 설명 될 수있다. 다른 단백질 키나아제의 인산화 사이트 가소성에 비슷한 통찰력이 프로토콜 다음을 얻을 수있다. 또한, 인산화 사이트를 사용하여 결합 방법은 돌연변이, 단백질 키나아제의 인산화 사이트 가소성의 진화 의미의 더 나은 이해로 이어질 것입니다 단백질의 면역 및 질량 분석 분석과 함께 특정 키나제 (음향)를 억제 할 수있는 단백질을 가리 킵니다.

면역 경로를 신속하게 신호를 형질 도입 및 면역 반응 1을 활성화하는 단백질의 다양한 번역 후 변형 (PTMS)에 의존하고 있습니다. PTMS 단백질 형태, 활성, 안정성, 지역화 및 단백질 - 단백질 상호 작용에 영향을 미칠 수있는 2-4 단백질 구조의 급속한 리버시블, 높은 특정 화학 변화이다. 식물에서 PTMS의 300 개 이상의 종류가 유비퀴틴, sumoylation, 황산, 당화 및 인산화 2,5 등의 확인되었습니다. 증거의 성장 몸은 식물 면역 1,5,6의 다양한 측면에 PTMS의 중요성을 강조한다. 단백질 인산화는 세린에 인산염 그룹의 가역 첨부, 트레오닌 또는 티로신 잔류 물은 많은 세포 기능의 조절과 당연히 가장 높은 폭포에게 5-11 신호 식물 방어에 PTM을 공부했다. 인산화에 의존하는 신호는 식물 defe의 중요한 부분입니다NSE 활성화는 멀티 도메인 저항 단백질 5,8로 횡단 수용체에 의해 미생물의 세포인지, 또는 세포 내 인식 한 후 시작했습니다. 식물에 침입하면, 미생물은 패턴 인식 수용체 (PRRS) 12이라고 세포막 수용체에 의해 검출된다. 알려진 PRRS는 수용체와 같은 단백질 (RLPs) 또는 수용체 같은 키나제 (RLKs), 두 리간드 결합 ectodomain 들고와 싱글 패스 (single-pass) 횡단 도메인이 있습니다. RLPs 달리 RLKs는 세포 내 키나아제 도메인을 가지고 13-15. PRRS의 ectodomain는 RLKs의 경우, 세포 내 도메인 6, 16 내 인산화 및 transphosphorylation에, 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPS) 선도라는 보존 된 미생물 elicitor 분자에 결합한다. PRRS의 인식에 의한 인산화의 하류, 키나제 (17)를 포함하여 세포질 단백질의 인산화 이후, </su&gt; 18 (P)는, E3 19 리가 제, 미토 겐 활성화 단백질 키나제 (MAPKs) 20, 21, 칼슘 - 의존성 단백질 키나제 (CDPK) PAMP 트리거 내성 (PTI) 22, 23, 전사 24 요인 25 리드. PRRS에 의한 세포 인식 이외에, 병원체의 세포 인식은 세포질 수용체를 통해 달성된다. 이러한 멀티 도메인 저항 (R) 단백질이 변수 N-말단 도메인, 중앙 염기 결합 (NB) 모티브, 및 C-말단 류신 - 풍부 반복 (LRR)가 포함되어 있으므로 NB-LRR 단백질 (26, 27)라고. R 단백질이 직접 또는 간접적으로 또한 PRRS 및 면역 시스템의 다른 노드를 대상으로 공지 된 음향이라는 병원체 유래 독성 분자를 인식한다. 인식 이펙터 트리거 면역 (ETI) 28 ~ 31에 이르는 강력한 방어를 유도한다. NB-LRR 단백질은 requisi있을테 NB 도메인 (30, 32)에서 모티브를 ATP 결합하지만, 그들은 키나제 도메인이 부족합니다. NB-LRRs의 보존 된 도메인의 인산화는 대규모 프로테오믹스 조사 (33)에보고되었지만, ETI 대한 관련성은 명확하지 않다. 마찬가지로 PTI에, NB-LRR 단백질의 활성화는 MAPKs 34 ~ 37과 38 ~ 40 CDPKs 등의 세포질 단백질의 인산화에 이르게한다. 가장 중요한 것은, 음향 인식은 NB-LRR 단백질 (41)와 직접 상호 작용 액세서리 단백질의 인산화로 이어질 수 있습니다. 몇 가지 예는 NB-LRR 단백질과 상호 작용하는 단백질을 RIN4 (애기 장대)과 PTO (토마토, 까 lycopersicum)를 포함, RPM1 (42), (43)와 각각 같은 Prf 44. 모나스 syringae 세균에 의한 감염 동안, 이펙터 단백질 AvrB는 수용체 같은 키나제 RIPK (45)에 의해 대부분, RIN4 인산화를 유도 <sup&gt; 46. 이와 유사하게, 토마토의 P. syringae는은 AvrPto 및 AvrPtoB은 PTO (47)의 인산화를 유도 이펙터. 키나아제 도메인이 결여 및 트랜스 - 인산화이어야 RIN4 달리, PTO는 자동 인산화 (48)과 기판 (49), (50)의 트랜스 - 인산화 가능한 활성 키나아제이다. PTO는 신호의 음향 의존 개시에 대한 키나제 활성을 필요로하지만, 키나제 죽은 PTO 돌연변이는 여전히 음향 독립적 인 방법 (51)에 신호 할 수 있습니다. 우리는 최근 같은 Prf / PTO의 복잡한 여러 같은 Prf을 포함, 올리고머이며, PTO (52) 분자와 같은 단지 내 PTO 분자는 47 서로 트랜스 - 인산화 할 수 있다는 것을 보여줌으로써 이러한 관측을 설명했다. 우리는 PTO (센서)의 한 분자가 다시 두 번째 PTO 분자 (도우미) 기지를 활성화하는 NB-LRR 단백질 (같은 Prf)로 형태 변화를 일으키는 원인이되는 이펙터 단백질과 상호 작용하는 모델을 제안복잡한 힌. 그 후, 도우미 PTO는 분자 센서 PTO 복잡한 저항 (47)의 전체 활성화에 선도적 인 트랜스 - 인산화. 이러한 예는 이펙터의 인식 시점에 면역 복합체 구성 요소와 잠재적 PTMS의 식별 신호가 다운 스트림 대상에 이펙터 인식에서 형질 도입하는 방법의 더 나은 이해로 이어질 수 있다는 것을 보여줍니다. 여기에서 우리는 NB-LRR 상호 작용하는 단백질과 그들의 PTMS의 후속 식별을위한 단백질 정제 방법을 설명합니다. 우리 모델로는 담배 benthamiana 및 토마토 같은 Prf / PTO 착체를 사용하지만, 동일한 프로토콜 간단 N. RLKs에서 적용 할 수있다 benthamiana와 A. 작은 수정을 장대 (53) 우리는 프로토콜 내에서 기술하는.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1108">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:296px;">MgCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">M8266</td>
			<td style="width:436px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>toxic - 1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1mL sterile</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2525R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silwet L-77 (surfactant)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td>1 M stock in DMSO, store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MS salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td>oxidizing, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>toxic - 0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVPP (polyvinylpolypyrrolidone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>do not confuse with PVP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT (DL-dithiothreitol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>toxic - 1 M stock, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>corrosive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calyculin A</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920</td>
			<td>toxic - 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Molybdate (Na2MoO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;">Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td>toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kinematica Polytron tissue homogeniser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-451-320&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855-1R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-FLAG M2 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-agarose</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>20347</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFP-Trap_A</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gta-20</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-HA-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2095</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>513-1902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">StrataClean resin</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714</td>
			<td>this absorption resin is recommended for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>this stain is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein low-binding tubes (LoBind)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.116</td>
			<td>these tubes are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83639</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>irritant, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14265</td>
			<td>toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-bath sonicator</td>
			<td>Ultravawe</td>
			<td>Ultra BT Ultrasonic Bath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LTQ-Orbitrap XL</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trichostatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8552</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of post-translational modifications of plant protein complexes

식물은 인식을 정교로 인한 환경 변화 및 ​​시스템 신호에 신속하게 적응. 병원체 공격하는 동안, 식물이 빠르게 면역 복합체의 모집 및 활성화를 통해 감염에 반응한다. 면역 복합체의 활성화는 이러한 인산화, 당화, 또는 유비퀴틴 같은 단백질의 번역 후 변형 (PTMS)와 연결되어 있습니다. 이러한 PTMS가 안무하는 방법을 이해하는 것은 저항을 달성하는 방법의 더 나은 이해로 이어질 것입니다. 여기에서 우리는 염기 결합 류신이 풍부한 반복 (NB-LRR) - 상호 작용하는 단백질을 자신의 번역 후 변형 (PTMS)의 후속 식별을위한 단백질 정제 방법을 설명합니다. 작은 변형으로, 프로토콜은 다른 식물 단백질 복합체의 정제에 적용될 수있다. 이 방법은 이후에 부분적으로 정제 관심의 단백질, B의 에피토프 태그 버전의 표현을 기반으로Y의 면역과 상호 작용하는 단백질과 PTMS의 식별을위한 질량 분석을 실시. 이 프로토콜은 그 방법을 보여줍니다 : I). 이러한 인산화 등 PTMS의 동적 변경은 질량 분석법에 의해 검출 될 수 있으며, II). 그것은 또한 단백질의 충분한 양을 가지고, 이것은 면역 침전의 순도의 부족을 보상 할 수있는 것이 중요하다; III). 또한 단백질의 PTMS을 검출하기 위해,이 단백질은 단백질의 충분한 양을 얻을 면역 침전되어야한다.

우리는 안정적인 형질 전환 A.에서 태그 단백질의 정제를 위해 여기 프로토콜을 설명 장대 선 또는 N.에있는 단백질의 일시적 발현 후 benthamiana. 도 1에 나타낸 바와 같이 표적 단백질의 정제는 단백질과 상호 작용하는 표적 단백질의 PTMS의 식별을 허용하기 위하여 질량 분석계에 연결되어있다. 프로토콜은 식물 내성 및 그들의 PTMS의 식별에 관련된 단백질의 정제를 위해 설계되었지만 어떤 태그 식물 단백질의 정제에 적용될 수있다. 예를 들어 우리는 N.에서 같은 Prf / PTO 단지의 정화를 사용 benthamiana. 형질 전환 N. 35S을 표현 benthamiana 라인 38-12 (54) : PTO는 일시적 35S로 형질 전환 된 : PRF-FLAG하고 복잡한 안티-FLAG M2 아가로 오스 (그림 2A)로 면역 침전되었다. 그림 2A의 면역 블롯 (IB)대상 단백질 (같은 Prf)의 대부분이 면역 침전 된 것을 보여줍니다. PTO와 상호 작용하는 효과기 단백질 AvrPtoB는 같은 Prf로 copurified하고 (도 2A 및 2B) 항체 및 질량 분광 분석을 이용하여 검출 하였다. 은 AvrPto 및 35S : AvrPtoB (그림 2A)를 우리는 이펙터 35S를 구성과 함께 동시 발현 할 때 같은 Prf와 copurified PTO는 SDS-PAGE 젤에 느린 마이그레이션 것으로 나타났습니다. 두 이펙터 단백질은 PRF-상호 작용 PTO (그림 2A)의 느린 이동을 유도. 이 인산 (44)로 처리하여 제거 할 수 있기 때문에 PTO이 이펙터 인식 의존 느린 이주는 이전에 인산화에 기인했다. PTO의 느린 이동에 기여 인산화 사이트를 검출하기 위해, 우리는 질량 분광법 분석을 PRF copurifying PTO를 실시. PTO의 높은 발현과 면역 블롯과의 쉬운 탐지에도 불구하고 우리는 펩티드에게 C를 검색 할 수PTO 순서의 단지 57 %를 overing 우리는 어떤 인산화 사이트 (그림 2B)를 식별하는 데 실패했습니다. 그 후, 우리는 안티-FLAG. N.과 PTO 단백질을 표적으로하는 전략을 변경 PRF-3HA 및 35S : PTO-FLAG, 또는 35S없는 :은 AvrPto 및 35S : benthamiana WT 식물은 일시적 35S로 형질 전환 하였다. AvrPtoB PRF-복합체와 자유로운 형태를 모두 포함하는 PTO 단백질의 총량이 면역 침전했다 항-FLAG M2 아가로 오스와 SDS-PAGE 분별있는 젤 트립신 소화와 질량 분석 분석 (그림 2C)를 실시와 함께. 이 방법으로 우리는 순서의 약 80 %와 알 수없는 100 kDa의 단백질 상호 작용에 걸쳐 PTO 펩티드를 확인했다. 우리는 PTO 펩티드 187-202 및 188-202 (표 1)에 대한 단일 및 이중 인산화 사이트 집합을 확인했다. SER-198과 THR-199 주된 인산화 사이트 있지만, 다른 검사하고 있었다sphorylation 사이트도 검출되었다 (표 1). 빼앗아-198 및 THR-199에서 가장 중요한 두 인산화는 효과기 단백질 (표 1) 중 하나의 존재 확인되었다. 우리는 최근 PTO 인산화 사이트의 유사한 세트를 확인하고 47 신호에 대한 이중 인산화 이벤트의 중요성을 보여줍니다. 여기에 설명 된 프로토콜 다음 우리는 표적 단백질의 인산화 상태에서의 동적 변화를 식별 할 수 있었다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" /> 그림 1. 일반 실험 설계. 표적 단백질 면역 (IP)에 대한이 일시적으로는 담배 benthamiana 또는 안정적으로 애기 장대에서, 란타에 태그를 표현한다. 단백질 추출에 따라표적 단백질은 친 화성 기질과 면역 침전된다. 단백질은 전기 영동으로 아크릴 아마이드 겔에서 분리된다. 젤 밴드는 절제되어있다. 단백질은 겔 밴드로부터 추출 및 질량 분석을 실시한다. 인산화 사이트와 상호 작용하는 단백질은 확인된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" /> 그림 2. 같은 Prf 및 PTO의 면역. A). 구조 35S가 : PRF-FLAG가 일시적으로 38-12 라인 (35S : PTO)에 표현 된 빈 벡터 (EV)와 함께, 35S :은 AvrPto 또는 35S : AvrPtoB. 사흘 후 침투 같은 Prf는 항-FLAG 친 화성 기질을 사용하여 면역 침전되었다. 면역PRF : AvrPtoB과 PTO에 대한 noblots (IB)을 수행 하였다. PTO의 면역 블롯 패널의 맨 아래에있는 화살표가 가리키는 바와 같이,은 AvrPto 및 AvrPtoB)는 PTO. B의 느린 이동을 유도한다. 구조 35S가 : PRF-FLAG가 일시적으로 38-12 라인 (35S : PTO)에 표현 된 빈 벡터 (EV)와 함께, 35S :은 AvrPto 또는 35S : AvrPtoB. 사흘 후 침투 같은 Prf는 항-FLAG 아가로 오스를 사용하여 면역 침강 및 SDS-PAGE에서 분리 하였다. 젤 콜로이드 쿠마시 브릴리언트 블루 (CCBB)와 가시 같은 Prf로 염색하고, PTO 및 AvrPtoB 단백질 밴드는 겔에서 절제와 질량 분석기로 분석 하였다. 질량 분석에 의해 확인 PTO와 같은 Prf 시퀀스의 비율 펩타이드 범위가 표시됩니다. C를). 구조의 35S : PRF-3xHA 및 35S : PTO-FLAG는 일시적 35S와 함께 표현했다 : AvrPtoB, 35S :은 AvrPto 또는 N. 빈 벡터 (EV) benthamiana. 세 일 총 금액의 사후 침투PTO-FLAG는 아가 로스 안티 - 플래그를 사용하여 면역 침강 및 SDS-PAGE에 해결되었습니다. 가시 PTO 및 PTO-상호 작용 단백질 밴드는 겔로부터 절제 질량 분석법에 의해 분석 하였다. 같은 Prf가 (화살표로 표시된) 약간 덜 보이는 반면, PTO 및 100 kDa의 PTO 상호 작용하는 단백질 밴드, 콜로이드 쿠 매시 브릴리언트 블루 (CCBB) 스테인드 젤에 명확하게 볼 수 있습니다. IP : 면역 침전, IB : 면역 블롯, CBB : 쿠마시 브릴리언트 블루 염색, CCBB : 콜로이드 쿠마시 브릴리언트 블루 염색. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> PRF </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> EV </td><td rowspan="2"> 은 AvrPto </td><td rowspan="2"> AvrPtoB </td></tr><tr><td> PTO 펩타이드 188-202 </td></tr><tr><td> GTELDQ [P의 T 195] HLSTVVK </td><tD&gt; 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [P의 S 198] TVVK </td><td> 10 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLS [P의 T 199] VVK </td><td> 8 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> G [P의 T 190] ELDQTHLS [P의 T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [P의 S 198] [P의 T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 8 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLSTVVK </td><td> 46 </td><td> 26 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> PTO 펩타이드 187-202 </td><td colspan="3"></td></tr><tr><td> KGTELDQ [P의 T 195] HLS TVVK에게 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [P의 S 198] TVVK </td><td> 17 </td><td> 17 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLS [P의 T 199] VVK </tD&gt; <td> 4 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KGTELDQ [P의 T 195] HLS [P의 T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [P의 S 198] [P의 T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLSTVVK </td><td> 21 </td><td> 37 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> 펩티드 187-202 및 188-202 </td><td> 83 </td><td> 88 </td><td> (50) </td></tr><tr><td> 두 인산화 이벤트와 펩티드의 비율 </td><td> 0 % </td><td> 26.9 % </td><td> 11.2 % </td></tr><tr><td> PTO 순서 적용 범위 </td><td> 78 % </td><td> 79 % </td><td> 82 % </td></tr></tbody></table> 표 1 35S 신호의 활성화에 따라 PTO 펩타이드의 이중 인산화 :.. PRF-3xHA 및 35S를 : PTO-FLAG는 일시적으로 그들과 함께 표현했다PTY 벡터 (EV), 35S :은 AvrPto 또는 35S : N.에 AvrPtoB benthamiana. 사흘 후 침투 PTO-FLAG 단백질의 총량은 항-FLAG 친 화성 기질을 사용하여 면역 침강 및 SDS-PAGE에 해결되었습니다. 콜로이드 쿠 매시 화려한 푸른 스테인드 젤에 PTO의 가시 대역은 질량 분석기와 절제 분석 하였다. PTO를 0으로 식별 펩타이드, 1 및 2의 인산화 사건의 개수가 표시된다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 버퍼의 표 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L 매체 </td><td> 트립 톤 </td><td> 10g / L </td></tr><tr><td></td><td> 효모 추출물 </td><td> 5g / L </td></tr><tr><td></td><td> 염화나트륨 </td><td> 5g / L </td></tr><tr><td></td><td> D-글루코오스 </td><td> 1g / L </td></tr><tr><td> 농업 침투 버퍼 </td><td> MgCl2를 </td><td> 10 mM의 </td></tr><tr><td></td><td> MES &lt;/ TD&gt; <td> 10 mM의 </td></tr><tr><td></td><td> pH를 5.5로 조정 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 아세토 시린 곤 (선택 사양) </td><td> 150 μM </td></tr><tr><td> 버퍼 </td><td> 트리스 - 염산 pH를 7.5 </td><td> 150 밀리미터 </td></tr><tr><td></td><td> 염화나트륨 </td><td> 150 밀리미터 </td></tr><tr><td></td><td> EDTA </td><td> 5 mM의 </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 2 ㎜ </td></tr><tr><td></td><td> 글리세린 </td><td> 5 % (V / V) </td></tr><tr><td> 버퍼 B </td><td> 버퍼 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PVPP </td><td> 2 % (W / V) </td></tr><tr><td> 버퍼 C </td><td> 버퍼 B </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 디티 오 트레이 톨 (DTT) </td><td> 10 mM의 </td></tr><tr><td></td><td> 식물 프로테아제 억제제 칵테일 </td><td> 1 % (V / V) </td></tr><tr><td></td><td> 페닐 메틸 술 포닐 플루오 라이드 (PMSF) </td><td> 0.5 ㎜ </td&gt; </tr><tr><td></td><td> 칼리 큐린 </td><td> 50 nM의 </td></tr><tr><td></td><td> 불화 나트륨 (NaF로) </td><td> 50 mM의 </td></tr><tr><td></td><td> 몰리브덴 산 나트륨 (나 2 무 4) </td><td> 10 mM의 </td></tr><tr><td></td><td> 나트륨 오르토 바나 데이트 </td><td> 1 ㎜ </td></tr><tr><td></td><td> Okadaic 산 </td><td> 100 nm의 </td></tr><tr><td> 버퍼 D </td><td> 버퍼 C PVPP없이 </td><td></td></tr><tr><td> 배 SDS-PAGE 로딩 버퍼 </td><td> 트리스 - 염산 pH를 6.8 </td><td> 60 mM의 </td></tr><tr><td></td><td> SDS </td><td> 2 % </td></tr><tr><td></td><td> 글리세린 </td><td> 0.15 % </td></tr><tr><td></td><td> 브로 모 페놀 블루 </td><td> 0.10 % </td></tr><tr><td></td><td> DTT (사용 직전에 추가) </td><td> 50 mM의 </td></tr></tbody></table> 표 2. 버퍼와 미디어 조리법.

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Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

연구

생물학

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

성장 저해 Phenotypes의 확인은 효모에서 세균의 종류 III Effectors 표현에 의해 유도된

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

식물 잎에서 히스톤 수정을 감지

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...