이 프로토콜은 초파리 어레이를 모델 시스템으로 사용하여 세포내 트래피킹 및 기저막 단백질의 분비의 특성화를 허용한다. 우리 기술의 가장 큰 장점은 내인성 태깅 단백질과 Airyscan 초해상도 현미경을 사용하여 기저막 단백질의 세포 내 밀매에 대한 고해상도 이미징을 허용한다는 것입니다. 이 프로토콜은 기저막 단백질의 세포 내 트래피킹을 이미지화하기 위해 개발되었지만, 관심있는 다른 단백질 및 세포 배양 및 오가노이드를 포함한 다른 생물학적 시스템의 밀매를 연구하기 위해 확장 될 수 있습니다.
시작하려면 해부 범위에서 PBS의 초파리 난소를 해부 한 후 1 밀리리터의 고정 용액을 추가하고 난소를 15 분 동안 영양가있는 플랫폼에 고정시킵니다. 고정 용액을 제거하고 각각 한 밀리리터의 PBST로 두 번의 빠른 세척을 수행하십시오. 마이크로원심분리 튜브를 다섯 번 내지 여섯 번 부드럽게 반전시켜, 영양가 플랫폼 로커 상에서 PBST의 밀리리터로 각각 10분의 네 번의 긴 세척을 수행한다.
고정 및 세척을 수행 한 후 PBST를 제거한 다음 한 밀리리터의 블로킹 용액을 추가하고 최소 한 시간 동안 영양가있는 플랫폼 로커에서 난소를 차단하십시오. 다음으로, 블로킹 용액을 제거하고 블로킹 용액에 적절한 농도로 희석된 일차 항체를 포함하는 일차 항체 용액 300 마이크로리터를 첨가한다. 섭씨 4도의 영양가있는 플랫폼 로커에서 밤새 배양하십시오.
일차 항체 용액을 제거한 후, 이전에 입증된 바와 같이 두 번의 빠른 세척과 네 번의 긴 세척을 수행한 다음, PBST를 제거하고 사용된 일차 항체를 검출할 형광 이차 항체를 포함하는 이차 항체 용액 500 마이크로리터를 첨가한다. 이차 항체 용액의 난소를 실온에서 두 시간 동안 영양화 플랫폼 로커 상에서 인큐베이션한 다음, 영양가 플랫폼 로커 상에서 이전에 입증된 바와 같이 PBST에서 두 번의 빠른 세척과 네 번의 긴 세척을 수행한다. 마지막 세척 후 P-1000 피펫을 사용하여 난소를 튜브에서 위아래로 부드럽게 피펫하여 계란 챔버를 분리하십시오.
튜브를 5 ~ 10 분 동안 똑바로 세운 상태로 유지하여 달걀 챔버가 바닥으로 가라 앉도록하십시오. 다음으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBST를 제거하고 약 50 마이크로리터를 남긴다. 그런 다음 P-200 피펫을 사용하여 나머지 PBST를 최대한 제거하고 커버 슬립에 고르게 퍼질 정도로 장착 매체 두 방울을 추가하십시오.
점성 장착 매체를 마이크로 원심분리 튜브에서 슬라이드로 쉽게 옮길 수 있도록 P-200 피펫 팁의 끝을 차단하십시오. 다음으로, 장착 매체의 모든 달걀 챔버를 천천히 유리 슬라이드로 옮겨 거품이 생기지 않도록하십시오. 해부 현미경으로 새로운 P-200 피펫 팁 또는 포셉을 사용하여 장착 매체를 부드럽게 펼치고 분리 된 달걀 챔버를 커버 슬립 크기의 영역을 덮습니다.
포셉을 사용하여 조심스럽게 덮개 슬립을 달걀 챔버에 비스듬히 올려 거품을 피하고 슬라이드를 어둠 속의 평평한 표면에 실온에서 이틀 동안 보관하여 중합하십시오. 장착 매체가 경화되면 슬라이드를 이미징을 위해 몇 주 동안 어둠 속에서 섭씨 4도에 보관할 수 있습니다. 기저막 단백질의 세포 내 국소화를 시각화하려면 목표를 63x로 설정하고 렌즈에 침지 오일 한 방울을 부드럽게 놓은 다음 표지 슬립이 대상을 향하도록 슬라이드를 대물점에 위치시켜 표본을 찾습니다.
에피형광 현미경의 아이피스를 사용하여 관심 영역을 찾은 다음, 원고에 설명된 대로 형광단을 이미지에 대한 적절한 설정으로 구성하여 선택합니다. 구성이 설정되면 수집 모드에서 라이브를 선택하여 샘플을 이미지화하고 2와 4x 사이의 확대/축소를 조정하여 샘플의 스캔 영역을 최적화합니다. 각 개별 채널에 대해 채널에서 트랙을 선택하고 라이브를 클릭합니다.
범위 표시기 도구를 사용하는 동안 마스터 게인과 레이저 파워를 조정하고 모든 지침에 따라 원고에 설명된 포화 픽셀을 피하면서 각 채널에 대해 동일한 것을 반복하십시오. 획득 모드 토글 창의 이미지 크기에서 SR을 클릭하여 감지기의 기능을 최대화하고 프레임 크기를 자동으로 조정합니다. Airyscan 모드에서는 일반적으로 필요하지 않으며 스캔 시간이 줄어들 것이므로 평균을 None으로 유지하십시오.
그러나 경우에 따라 평균 2x를 사용하면 신호 대 잡음비가 향상될 수 있으며, 스냅을 클릭하여 이미지를 획득할 수 있습니다. Z-스택을 획득하려면 획득 탭 아래의 Z-스택 체크상자를 클릭하십시오. 다음으로, 시편을 관찰할 원하는 채널을 선택하십시오.
예를 들어, DAPI 채널은 라이브를 클릭하고 라이브를 클릭하여 라이브 스캔을 시작한 다음 현미경의 미세 조정 노브를 사용하여 Z 스택의 범위를 설정합니다. 그런 다음 먼저 설정 및 마지막 설정을 클릭하여 Z 스택의 끝점을 설정합니다. 최적의 3D 재구성을 위해 Z 스택의 간격을 0.5마이크로미터보다 낮게 설정하여 단계 크기를 할당하고 실험 시작을 클릭하여 Z-스택 수집을 시작합니다.
이미지 또는 Z 스택을 얻은 후 처리, 방법 옵션을 클릭하고 Airyscan 처리를 선택하십시오. 자동 필터를 수행하여 시작하고 필요한 경우 초해상도 값을 변경하여 추가 수동 처리를 수행하여 샘플에 가장 적합한 결과를 얻습니다. 최적의 SR 값이 결정되면 적용을 클릭하여 처리된 이미지를 생성합니다.
Z 스택 이미지의 경우 3D 처리 상자를 클릭하여 하나의 Z 슬라이스 또는 전체 Z 스택으로 처리합니다. Z-스택 획득 후 3D로 단백질 밀매를 시각화하려면 Airyscan 처리 이미지의 디스플레이 제어 섹션에 나타나는 미리보기 창에서 3D 아이콘을 클릭하여 3D 이미지를 생성합니다. 다양한 3D 보기 옵션에서 소포의 구조를 볼 때 서피스 또는 혼합 뷰를 사용합니다.
최고 품질의 이미지를 얻으려면 가장 빠른 설정이 정확도가 떨어지고 3D 렌더링이 불량해지므로 정밀 설정을 선택합니다. 이미지가 생성되면 원하는 위치에 초점을 맞추기 위해 확대/축소 및 회전하여 3D 이미지를 조작합니다. 뷰를 얻은 후 3D 탭에서 표시된 해상도를 선택한 다음 이미지 만들기를 클릭하면 이미지를 본 것과 동일한 방향으로 이미지의 스냅 샷이 생성되고 다양한 파일 형식으로 저장 및 내보낼 수 있습니다.
공초점 현미경은 획득 파라미터가 최적화될 때 바이킹-GFP와 같은 기저막 단백질의 세포내 국소화 및 침착을 시각화하는데 사용될 수 있다. 획득 및 이미지 처리가 제대로 수행되면 초해상도 현미경은 공초점 현미경에 비해 이미지 해상도를 증가시킵니다. 바이킹과 같은 기저막 단백질의 세포내 밀매에서 더 잘 정의된 이미지에 의해 예시된 바와 같이.
직교 투영은 공초점 또는 초해상도 이미징을 사용하여 단일 이미지에서 기저막 단백질을 포함하는 소포 및 구획의 전체 분포를 시각화 할 수있게합니다. 공초점 또는 초분해능 이미징에 의해 취해진 광학 Z-절편의 스택을 조립하여 3D 재구성을 사용하여 세포 내 기저막 단백질의 국소화 및 분포를 평가했습니다. 초분해능 이미징은 돌연변이 조건에서 기저막 단백질의 정확한 국소화를 결정하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, Crag 녹다운 상피 세포에서, 기저막 단백질은 정점과 기저로 모두 축적되어, 기저막 단백질의 편광된 분비를 조절한다는 것을 나타낸다. 공초점 및 초분해능 현미경 검사는 또한 공동 국소화 실험에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이 그림은 바이킹-GFP와 골지 마커인 GM-130의 부분적인 공동-국소화를 보여주며, 바이킹이 분비되기 전에 골지로 분류됨을 확인한다.
초분해능 현미경을 사용하여 기저막 단백질의 밀매를 효율적으로 이미지화하려면 난소를 조심스럽게 장착하고 획득 및 컨볼루션 매개 변수를 설정할 때 특히주의를 기울이는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 기저막 단백질의 세포 내 밀매 및 분비를 시각화하도록 최적화되어 있습니다. 그러나, 관심있는 다른 단백질의 밀매를 효율적으로 이미지화하기 위해 쉽게 변형될 수 있다.
