다세포 유기체 내에서 조직은 공간 방향에서 높은 정도를 더 표시합니다. 세포는 형태 발생 의 과정을 통해 먼 거리에서 우선 순위의 범위를 정렬하고 표시합니다. 개발 중에 상피의 평면 배열이 어떻게 도달하는지 이해하려면 생체 내에서 높은 간격 측두성 충실도로 셀의 방향과 성장 역학을 추적하는 것이 중요합니다.
설명된 프로토콜은 drosophila pupal 표피에서 글로벌 및 로컬 수준에서 세포 행동을 심상 분석하고 분석하도록 설계되었습니다. 이 방법론은 연구, 세포 생물학, 형태 발생 및 평면 극성의 다른 이론에 대한 통찰력을 제공 할 수 있으며 다른 조직, 구조 및 모델의 분석에 적용 할 수 있습니다. 모든 단계는 몇 가지 연습 후 쉽게 수행 할 수 있습니다.
그들은 정밀도를 요구합니다. 이 프로토콜의 시각화는 짧은 시간 안에 최적의 결과를 달성하는 데 도움이 됩니다. 푸팔 해부는 복잡합니다.
먼저 촉촉한 페인트브러시를 사용하여 천막된 흰색 프리푸파를 신선한 플라스틱 바이알로 옮기고 섭씨 25도에서 필요한 기간 동안 보관하십시오. 그런 다음, 집게의 도움으로 유리병의 벽에서 각 새끼를 제거합니다. 양면 스티커 테이프로 덮인 유리 슬라이드에 각 강아지의 복부 측면을 붙입니다.
퍼프의 끝과 함께 머리 첨탑과 강아지의 등대 표면을 부드럽게 탭하여 푸팔 케이스의 부착을 테이프에 부착합니다. 포셉으로 퍼파리움에서 오퍼쿨룸을 부드럽게 제거하여 스테레오 현미경으로 해부를 시작합니다. 퍼팔 케이스와 푸파 표면 사이의 얕은 에 집게의 한 끝을 온구 개구부를 통해 삽입합니다.
한 개 이상의 스윙에서 머리에서 꼬리까지 케이스를 찢어 내고 푸파를 꼬지 않도록 하십시오. 금이 간 푸팔 케이스를 뒤쪽 끝으로 계속 진행할 때 측면으로 접습니다. 강아지를 강아지를 강아지밑에 조심스럽게 삽입하고 부드럽게 당겨서 푸팔 케이스에서 제거합니다.
강아지는 집게의 끝에 붙어 있습니다. 강아지를 복부 쪽으로 부드럽게 잡고, 작은 가스 투과성 할로카본 오일 위에 유리 바닥 접시에 강아지를 옮길. 젖은 티슈 페이퍼를 접시 가장자리에 굴려 서 접시를 덮어 습도를 유지합니다.
도메인및 평가 과정에 따라 유리 바닥 접시에 오일 드롭 위에 pupa를 지향한다. 등대 둥지의 초기 확장의 장기 라이브 이미징을 위해, 뒤틀은 pupa를 지향. 그들의 늦은 확장 및 조직 리모델링을 이미지하기 위해, 등등 pupa를 지향.
장착된 푸파를 함유한 유리 바닥 접시를 현미경 단계로 옮기고 전염된 빛을 사용하여 복부 영역의 표면에 초점을 맞춥니다. 복부 상피에서 유전 모자이크를 유도하기 위해 미토틱 재조합을 사용하려면 열 충격 유도 불가 플립카제, 특정 게놈 위치에서FRT 부위를 운반하는 처녀 암컷을 준비하고 FRT 부위에 알 수 있는 세포 마커를 증식한다. 동등한 게놈 위치에서 FRT 사이트를 운반하는 돌연변이 수컷을 준비합니다.
4~5일 동안 25도의 플라스틱 바이알에서 3~1비율로 여러 여성과 남성을 교차합니다. 히스토아스트에서 체세포 클론을 생성하려면, 45분에서 1시간 동안 37도의 수조에 동물이 함유된 플라스틱 바이알을 침수하여 십자가의 자손의 세 번째 인스타 애벌레 단계에서 열 충격 처리를 수행한다. 이미지 J 소프트웨어에서 최대 강도 프로젝션 기능을 사용하여 공초점 현미경 검사법에 의해 획득한 Z 스택 조각을 2D로 보호합니다.
둥지는 왼쪽과 등쪽의 앞쪽에 평면 좌표 계측기에서 방향을 지정하는 특징적인 모양을 가지고 있습니다. 이 분석을 통해 최적의 결과를 얻으려면 입력 이미지를 고해상도로 획득해야 합니다. 로컬 셀 가장자리에서 정성적 방향 값을 얻으려면 플러그인 메뉴를 클릭하고 방향 J 배포 옵션을 선택합니다.
가우시안 창 시그마를 1픽셀로 설정하고, 입방스스라인을 그라데이션으로, 최소 응고도를 20%로, 최소 에너지를 1%로 설정합니다. 플러그인의 색상 측량 옵션을 사용합니다. 색조를 방향, 채도에 대한 채도 및 입력 이미지에 밝기로 설정합니다.
이 색상은 세트 평면 좌표 계를 기준으로 셀 에지 방향을 코드로 합니다. 다음으로 플러그인 메뉴에서 방향 J 측정 옵션을 사용하여 셀룰러 방향 방향과 방향 셀을 셀 정렬로 정량화합니다. 히스토아스트가 점유하는 영역 내에서 20 마이크로미터 배 20 마이크로미터 정도의 균일한 무게에 대한 관심의 작고 인접한 비 중첩 영역을 생성합니다.
누르면 ROI에서 지배적인 로컬 방향과 일관성이 계산됩니다. 이 연구에서는, 사용되는 방법론은 상당한 사진 표백이나 사진 독성없이 최대 48 시간 동안 개발 강아지의 고해상도 영화를 생성 할 수 있습니다. puparium 형성 후 26 시간에 RFP NLS와 쌍둥이 반점이 없는 것으로 표시된 야생 형 클론의 예가 여기에 표시됩니다.
클론은 세그먼트 경계를 따라 길어졌다. 트윈 클론은 병렬 또는 병렬로 배열. 푸파리움 형성 후 26시간 47시간 후 야생형 클론의 형태는 두 단계에서 복잡한 국경 형태를 나타낸다.
푸파리움 형성 후 26시간 47시간 후기하학적 매개변수에 대한 상자 및 수염 플롯은 이 시간 창에서 평균 면적과 둘레가 크게 증가함을 보여줍니다. 클론의 방향은 확장 및 리모델링 중에 유지되었습니다. puparium 형성 후 26 시간 및 47 시간에서 모양 매개 변수는 야생 형 클론에서 거의 변경 된 거칠기, 둥글림 및 원형을 나타냅니다.
그렇지 않으면 몇 시간 이내에 죽을 것이다, 강아지를 손상시키지 않도록해야합니다, 라이브 이미징에 영향을 미치는. 이 프로토콜은 사투스 시약이나 계측기를 사용할 필요가 없습니다. 해부 할 때 자신을 꼬집지 마십시오.
이러한 방법론을 적용하여 다른 상상 기술을 사용하여 장기간 고해상도 영화를 생성할 수 있습니다. 광자 또는 회전 디스크에 초점을 합니다. 클로랄 분석은 임의의 세포가 교차 회담 또는 세포 통신 메커니즘의 식별에서 용이하게하기 때문에 비 자율적 반응을 탐구하기 위해 사용될 수있다.
이러한 방법은 변태, 근육 및 변형 시 신경 발달의 조정을 포함하여 형태 유전학 현상의 전체 범위를 연구하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.
