저자가이 작업의 지원에 대 한 국민 건강 및 의료 연구 위원회의 오스트레일리아 프로젝트 그랜트 APP1103176를 인정 하 고 싶습니다.

동물 조직 컬렉션을 포함 하는 모든 실험 절차는 뉴캐슬 대학 동물 관리 및 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 면역 형광 염색 파라핀 끼워 넣어진 Epididymal 섹션 (그림 1 및 2)의
<ol><li>CO2 흡입 (스위스 쥐, 8 주 이상)를 통해 성인 쥐의 안락사, 직후에 신중 하 게 (를 사용 하 여 수술가 위, 핀셋) epididymis 해 부의 결합 조직 및 지방 overlying 자유롭고 Bouin의 정착 액에 젖어 솔루션 (> 10 배 볼륨/조직 무게) 야간 고정을 위한.</li>
	<li>2 일 동안 매일 2 × 변화 70% 에탄올과 조직을 세척 하 고 탈수 등급된 에탄올 (70%, 95% 및 100%)를 통해 침투 하 고 파라핀 블록으로 삽입에 대 한 준비.</li>
	<li>섹션 4-6 µ m 및 면역 형광 염색을 위한 준비에서 슬라이드에 한 두께에 파라핀 블록.</li>
	<li>증기 두건에서 epididymal 파라핀 섹션을 완전히 조직 섹션 (3 × 5 분 각 시간) 담가 슬라이드 항아리에 크 실 렌의 충분 한 금액을 추가 하 여 dewax.</li>
	<li>순화 된 H2O 희석 등급된 에탄올 솔루션에 침수에 의해 조직 단면도 rehydrate (100% 에탄올 5 분, 100% 에탄올 5 분, 1 분, 80% 에탄올 1 분, 70% 에탄올 90% 에탄올 1 분, 그리고 50% 에탄올 1 분).</li>
	<li>슬라이드 단지 충분 한 버퍼링 인산 염 분 완전히 몰입할 전체 조직 섹션 (PBS)와 5 분 동안 한 번에 섹션을 세척 (모든 후속 세척에 대 한 이러한 지침을 따르십시오).</li>
	<li>적절 한 항 원 검색 솔루션을 가만히 따르다 (즉., 10 mmol/L 나트륨 시트르산, 50 mmol/L 트리 스 pH 10.5 또는 다른 항 원 검색 솔루션, 검색 항 원에 따라) 슬라이드 랙 및 끓는까지 마이크로파에. 이 솔루션으로 슬라이드를 담가 그리고 열 유발 항 원 검색 조건 ( 표 1참조) 개별 항 체에 대 한 최적화 된 조직 단면도 주제. 주의: 슬라이드 antigen 검색 과정에서 항 원 검색 솔루션에 완전히 몰입 하 확인 하십시오.</li>
	<li>실내 온도에 전자 레인지와 멋진 슬라이드 컨테이너를 제거 합니다.</li>
	<li>PBS와 슬라이드를 헹 구 고 추적에 액체 방수 제 슬라이드 마커 펜을 사용 하 여 조직 섹션 주위.</li>
	<li>(컨테이너의 기지에서 moistened 조직에 의해 생성), 습도 컨테이너에 슬라이드를 놓고 차단 솔루션 적용 (3 %BSA / PBS, 이전 필터링 0.45 μ m 필터를 통해) 37 ° c.에 1 시간에 대 한</li>
	<li>PBS 한번 슬라이드 린스.</li>
	<li>필터링 된 1%에서 실험적으로 최적화 된 농도를 희석 하는 적절 한 기본 항 체와 섹션을 품 어 하룻밤에 4 ° C에서 BSA/PBS (1:60 안티-DNM1, DNM2 및 DNM3에 대 한 항 체, 안티-ATP6V1B1 항 체에 대 한 1: 100 테이블의 자료를 참조 항 체 세부 사항을 위해). 참고: 구별을 일반적인 항 체 바인딩에서 특정 그것은 엄격한 네거티브를 포함 하는 데 필요한 (즉., 이차 항 체만, 1 차 항 체 펩 티 드 면역에 대 한 preabsorbed)와 긍정적인 컨트롤24.</li>
	<li>30 분 동안 실내 온도에 배치 하 여 슬라이드를 rewarm.</li>
	<li>씻고 10 분 떨고 플랫폼 (60 rpm)에 PBS 가진 슬라이드 3 ×.</li>
	<li>1%에 희석 적절 한 이차 항 체와 섹션을 품 어 BSA/PBS (0.45 μ m 필터를 통해 필터링) 1 시간 동안 37 ° C에서 (1:400 희석 모든 이차 항 체에 대 한 항 체 세부 정보에 대 한 재료의 표 참조). 주의:이 단계 이후부터 어둠 속에서 슬라이드 컨테이너를 유지. 듀얼 라벨에 대 한 2 차 항 체의 호환 조합을 선택 (즉., 2 차 항 체 종에서 제기 되었습니다 해야 합니다).</li>
	<li>씻고 10 분 떨고 플랫폼 (60 rpm)에 PBS 가진 슬라이드 3 ×.</li>
	<li>Propidium 요오드 화물 (PI, 7.48 μmol/L) 또는 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) 세포 핵을 실 온에서 2 분에 대 한 섹션 counterstain</li>
	<li>5 분 동안 떨고 플랫폼 (60 rpm)에 PBS 가진 두 번 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>10 %4-88 Mowiol 0.2 mol/L 트리 (pH 8.5)에 30% 글리세롤의 솔루션에 준비 섹션을 탑재 및 2.5 %1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-옥 탄.</li>
	<li>손톱 광택 coverslip 봉인 하 고 미래 관측을 위해 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다. 주의: 그것은 이미징 슬라이드의 즉시 실용적인 형광의 과도 한 손실을 방지 하기 위해 준비 후 수행 하 고 좋습니다.</li>
</ol>2 절연 마우스 Caput Epididymis (그림 3)에서 Epididymosomes의
<ol><li>CO2 흡입 (스위스 쥐 8 주 이상)를 통해 성인 쥐의 안락사 후 즉시 (미리 예 열 37 ° C에) epididymal 조직의 혈액 오염을 최소화 하기 위해 PBS를 가진 그들의 맥 관 구조를 perfuse. 주의: 혈장 epididymosomes25비슷한 크기의 exosomes의 다양 한 인구를 포함 합니다. Epididymal 조직에서 혈액 클리어런스의 효능을 액세스할 수 있는 초기 세그먼트의 검사를 통해 매우 vascularized epididymal 세그먼트 caput 세그먼트에 인접 위치 (즉,., 그림 1A에서 1 영역)</li>
	<li>조심 스럽게 표면에 대 한 가능성을 줄이기 위해 overlying 및 결합 조직, 지방과 린스 수정 Biggers, Whitten, 및 Whittingham 매체 (BWW; pH 7.4, 300 mmol/kg 물26,27의 osmolality) 무료로 epididymis 해 부 혈액 오염입니다.</li>
	<li>오 점 제거 초과 미디어, 해 부 caput epididymis epididymal 조직 (즉., 2-5에서 그림 1A지역) BWW 매체를 포함 하는 신선한 페 트리 접시 (35 × 10 m m)에 전송. 매체의 양은 최종 복구에 대 한 충분 한 인지 확인 합니다. 참고: 6 caput epididymides, 그것 것이 좋습니다 ~ 900 µ L 넣고 균일 하 게 분할 (단계 2.9 참조) 2 미리 준비 된 기온 변화도의 위에 적용의 복구에 대 한 허용 하는 매체의 1.1 mL를 사용 하.</li>
	<li>면도날으로 caput 조직으로 작은 incisions의 번호를 확인 합니다. 조직 말하다 하지 고 따라서 과도 한 cytosolic 내용으로 샘플을 오염 하지 마십시오. Luminal 내용을 공개 30 분 동안 37 ° C에서 온화한 동요와 조직을 포함 하는 접시를 품 어.</li>
	<li>세포질 파편을 제거 하려면 70 µ m 세포 막을 통해 결과 정지를 필터링 합니다.</li>
	<li>filtrate 수집 및 세포질 파편을 제거 하기 위하여 속도 증가 함께 4 ° C에서 연속 원심 분리 단계에이 대상 (즉,., 500 × g, 2000 × g, 4000 × g, 8000 × g, 5 분 각; 17000 × g 20 분, 그리고 마지막으로 17000 × g 추가로 10 분 또는 아무 펠 릿은 원심 분리 후 형성 될 때까지). 주의: 그것은 최소한의 혈액 오염 존재가 되도록 초기 500 × g 원심 분리 단계 후 펠 릿의 색상을 평가 하는 것이 중요. 이 펠 릿 핑크 채색을 표시 하는 모든 샘플을 삭제 합니다.</li>
	<li>0.25 mol/L 자당 및 10 mmol/L 트리 (pH 7.5)의 솔루션 (60% (w/v) 수성 iodixanol 함유) 밀도 그라데이션 매체를 diluting 하 여 불연속 iodixanol 그라데이션 (구성 된 40%, 20%, 10%, 5% 레이어)를 준비 합니다.</li>
	<li>450 µ L (그림 3)의 각 일부와 ultracentrifuge 튜브 (11 × 35 m m), 그라디언트를 준비 합니다. 시각 인터페이스는 성공적으로 epididymal 액체 샘플을 로드 하기 전에 각 계층 사이 형성 되도록 각 분수의 신청 후 그라디언트를 검사 합니다. 그러나 각 그라데이션 신선한 사용, 당일 준비, epididymal luminal 액체 샘플 로드 전에 최대 2 h 4 ° C에서 보존 될 수 있습니다.</li>
	<li>신중 하 게 epididymal luminal 유체 (3 epididymides caput에서 수집 된 자료에 해당) 꼭대기의 중단 한 그라데이션의 450 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>Ultracentrifuge 18 h 4 ° C에서 160000 × g 에서 그라디언트. 주의:이 원심 분리는 매우 높은 속도에서 실시 하 고, 이후 모든 ultracentrifuge 튜브 한 쌍이 고 정확 하 게 균형 있습니다. 그들은 그들의 무결성을 손상 시킬 수 있는 어떤 보이는 손상을 무료 수 있도록 튜브를 확인 하십시오.</li>
	<li>(각각 185 µ L의 구성 된) 12 동등한 분수 제거 최상위 계층에서 시작 하 고 그라데이션의 하단 쪽으로 진행. 등가 분수는 해당 하는 경우 각 그라데이션에서 복구 (최대 2 개의 그라디언트) 수영장. 주: epididymosomes는 가장 높은 분수 9-1122, 농축 마우스 그림 4 와 토론을 참조 하십시오.</li>
	<li>복구 및 분수 9-11의 풀링 후 PBS, 그리고 ultracentrifuge의 2 개 mL로 희석 100000 × g h 3 4 ° C에서 (13 × 56 m m 튜브)를 작은 공의 epididymosomes에서 샘플. 주의: epididymosome 펠 릿 볼 하기가 어려울 수 있습니다, 이후 그들은 회전자에 배치 하 고 튜브를 epididymosome 펠 릿의 기대 위치를 나타내는 표시는 튜브의 방향을 지적 했다 확인 하십시오. 각 튜브에 충분 한 볼륨 포함 되어 있는지 확인 (즉., 전체 용량의 50% 초과) 배제 관 붕괴의 위험에.</li>
	<li>신중 하 게 발음 하 고는 상쾌한 epididymosome 펠 렛을 방해 하지 않고 무시.</li>
	<li>Epididymosome 순도 (그림 4)를 평가 합니다.</li>
	<li>다운스트림 응용 프로그램에 따라 원하는 매체로 epididymosome 펠 릿을 resuspend. 예를 들어, BWW 매체 공동 보육 정 충 또는 양자 택일로 SDS-PAGE를 통해 epididymal 프로테옴의 해상도 대 한 준비에 적절 한 세포의 용 해 버퍼와 관련 된 실험에 대 한 일반적으로 사용 됩니다.</li>
</ol>3. 면역 형광 mECap18 세포의 얼룩
<ol><li>(셀 문화 후드에서 실시)을 살 균 coverslips의 준비<ol>
<li>에탄올 램프 위의 높은 온도에서 건조 하 여 소독와 10 분 동안 70% 에탄올에 coverslips (12 × 12 mm)을 담근 다.</li>
		<li>10 coverslip 쿨 s 12 잘 접시에 전송 하기 전에.</li>
		<li>하는 coverslip 커버 하 고 실 온에서 10 분 동안 정착 멸 균 폴 리-L-리 신 솔루션을 적용 합니다.</li>
		<li>폴 리-L-리 신 솔루션을 삭제 하 고 살 균 H2O coverslip 린스 또는 적절 한 매체.</li>
	</ol>
</li>
	<li>준비 mECap18 셀<ol>
<li>포함 하는 coverslips 12 잘 플레이트의 각 음에 2 × 105 mECap18 셀의 aliquots 통로</li>
		<li>MECap18 셀 중간 (DMEM와 1 %L-글루타민, 1% 나트륨 pyruvate, 1% 페니실린/스, 50l μmol 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 보충) 포함 10% 태아 종 아리 혈 청 (FBS) 분위기 5%에서 37 ° C 배양 기에서 셀 문화 CO2 하룻밤입니다.</li>
		<li>일단 세포는 coverslip 준수, 매체를 삭제 하 고 PBS로 두 번 셀 린스.</li>
		<li>충분 한 양의 4 %paraformaldehyde (PFA) 전체 coverslip 담가 15 분 동안 실 온에서 셀을 수정 하는 PBS에 희석을 추가 합니다.</li>
		<li>PFA 솔루션을 삭제 하 고 두 번 PBS에에서는 coverslips를 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>면역 형광 염색<ol>
<li>0.1%에 침수에 의해 mECap18 세포를 permeabilize 10 분에 대 한 PBS에 트라이 톤 X-100.</li>
		<li>PBS 가진 coverslips 린스.</li>
		<li>3 %BSA mECap18 세포를 차단 하 고 immunolabeling epididymal 조직 섹션에 대 한 설명에 해당 프로토콜을 이용 하 여 세포의 진행.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 조절된 세포 배양 매체에서 단백질의 격리
<ol><li>배양 조건된 셀의 컬렉션<ol>
<li>6의 각 음에 4 × 105 mECap18 셀의 통로 aliquots mECap18 셀 중간 10% 보충 잘 접시 FBS 24 h에 대 한.</li>
		<li>잔여 FBS 및 모든 관련 제거 하 mECap18 셀 매체 (FBS 없이 준비)와 mECap18 셀 세 번 씻어 단백질 오염 물질.</li>
		<li>MECap18 셀 매체 (FBS 없이 준비 하는)의 1.5 mL 각 잘 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 5%에서 12 h에 대 한 mECap18 셀으로 품 어 CO2. 참고:이 단계에서 mECap18 셀 실험적인 디자인에 따라 다른 대상 항 원에 대 한 평가 될 수 있다.</li>
		<li>12 h 배양 후 셀 매체와 모든 세포 파편을 제거 하려면 10 분 2000 × g 에서 원심 분리기를 수집 합니다. 참고: 외피의 기간 및 적용된 여야 하 셀의 허용 오차를 고려 하 여 실험 디자인/끝점 평가 따라 변경 될 수 있다. 최적의 결과 달성을 보장 하기 위해 특정 실험적인 regimens에 따라 보육의 타이밍을 조정 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>표준 trypan 블루 제외 분석 결과28의 응용 프로그램을 통해 mECap18 세포 생존 능력을 평가 합니다. 세포 생존 능력 90% 죽 었 거 나 죽어가는 셀에서 발표 하는 단백질에 의해 소개 하는 바이어스를 제거 하기 위해 거절 했습니다 모든 자료를 삭제 합니다.</li>
		<li>다음과 같이 셀 중간에서 단백질을 분리 또는-80 ° c.에 매체를 보존</li>
	</ol>
</li>
	<li>단백질 절연 (증기 두건에서 실시)<ol>
<li>80% 볼륨 조절된 세포 매체 교양된 mECap18 세포에서 발표 하는 단백질을 침전의 냉장된 100 %trichloroacetic 산 양의 20%를 추가 합니다. 지속적인 혼합으로 하룻밤 4 ° C에서 품 어.</li>
		<li>부 화 후 원심 분리 하 여 침전 된 단백질을 펠 렛 (17, 000 × g, 10 분 동안 4 ° C). 주: 매체에 분 비 될 것으로 예상 하는 단백질의 제한 된 수량에 따라 가능 하다는 펠 릿은 하지 쉽게 시각 수 원심 분리 후. 따라서 올바르게 이전에 원심 분리 관을 찾으시는 기대 펠 릿 위치는 상쾌한의 제거 하는 동안 방해을 않도록 주의 하는 것이 필수적 이다.</li>
		<li>상쾌한 무시 하 고 두 번 다시 원심 분리 전에 냉장된 아세톤으로 펠 릿을 세척 (17, 000 × g, 10 분 동안 4 ° C).</li>
		<li>조심 스럽게 제거 하 고 어떤 잔여 아세톤 증기 두건 내 공기 전에 상쾌한 삭제.</li>
		<li>끝점 분석 완전 분 비 단백질 프로 파일 및/또는 개별 대상 단백질을 검출 하기 위한 준비에 적절 한 추출 버퍼에 단백질 펠 릿 resuspend (예., immunoblotting SDS 페이지).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이러한 연구는 Bouin의 고정된 epididymal 조직 파라핀 포함 및 표준 단면 프로토콜을 받게 되었습니다 했다를 사용 하 여 통합. Bouin의 통 솔루션 각 구성 요소는 특정 하 고 상호 보완적인 기능을가지고 picric 산, 포 름 알 데히드, 초 산의 혼합물을 함유 한다. 따라서, 단백질 상호 링크를 기본 아민과 반응 하는 포름알데히드, picric 산 천천히 소금 형성 조직 침투 하 고 따라서 기본 단백질과 반대로, 초...

모든 포유류 종의 정 충 취득 표시 앞으로 진보적인 운동 잠재력 epididymis 수 남성 외 고환 덕트 시스템의 전문된 영역을 통해 그들의 장기 하강 동안 한 ovum를 기름 지 게 (종)에 따라 이동 7-14 일1. 아버지 chromatin의 극단적인 응축 및 testes에서 정 충의 cytodifferentiation와 함께 제공 되는 세포질의 대부분의 흘리기, 그들의 후속 기능 성숙의 상호 작용에 의해 독점적으로 구동 됩니다. 와 함께 epididymal microenvironment. 이 환경, 차례 차례로, 라이닝 epididymal 소마의 분 비 및 흡수 활동에 의해 만들어지고 세그먼트 세그먼트 변형1의 뛰어난 수준을 표시. 따라서, 단백질 합성 및 분 비 활동적인 세그먼트 epididymis (즉, 증 류 및 코 퍼스)2의 근 위 부분에 있는 있습니다. 이 활동 거울 기능 능력의 표시 셀 첫 처음으로 정 충의 기능 프로 파일 (즉,., 진보적인 운동 및 산 solubilized zona glycoproteins 바인딩할 수) 다음 그들의 caput epididymis3통로입니다. 이러한 기능적인 특성 정자 도달 원심 epididymal 세그먼트 (cauda), 어떤 점에서 그들은 사정에 대 한 준비에는 무부하 상태에 저장 됩니다로 서 최적의 수준에 도달 하기 전에 개발을 계속 합니다. 형성 및이 정자 저장 저수지의 유지 보수는 라이닝 상피는 cauda에서 강한 흡수 활동4,5에 의해 지배 되는에 또한 밀접 하 게 연관 됩니다. 비록 해부학 적 차이 보고6,7,8, 이러한 지역적인된 분업이 나타납니다 포유류 종의 대부분 공유 되 epididymis의 특성 날짜, 우리 자신의9,10를 포함 하 여 공부 했다. 실제로, 임상의 관점에서 그것은 알려져 그 epididymal 부전 남성 요인 불 임11, 따라서이 전문된 조직의 규칙을 이해의 중요성을 강조 표시의 병 인에 중요 한 기여를 하 게.
그것은 그러므로 유감 epididymal 생리학의 우리의 이해 및 정자 성숙 및이 조직 내에서 스토리지의 순차적 단계를 조절 하는 메커니즘 완전 해결 될 남아 있다. 기여 요인 들 중 epididymal 연구에서 제한 발전이 조직의 전반적인 복잡성과 규제 제어할 자사의 luminal microenvironment 메커니즘의 지식이 있습니다. 해부학, 우리는 caput, 코 퍼스 및 cauda 세그먼트의 구별을 넘어는 epididymis 여러 영역 (그림 1A)로 더 세분화 될 수 있습니다, 알고 각 septa12 으로 구분 하 고 개별 프로필 유전자/단백질의 특징 식13,14,15,,1617,18. 실제로, 상세한 transcriptional 프로 파일링에 epididymis 단편 유전자 발현의 기준으로 6 하 고 9 가지 epididymal 영역 각각19,20마우스와 쥐 모델에서 보고 되었습니다. 이러한 복잡성은 아마도 epididymal 소마, 수많은 다른 세포 유형; 구성 pseudostratified 상피의 구성 반영 각 관의 길이 따라 그들의 풍부, 유통 및 분 비 흡수 성 활동에 대해 서로 다른. 따라서, 주 세포는 지금까지 가장 풍부한 epididymal 셀 유형 구성 모든 상피 세포의 80% 이상. 따라서, 주 셀 epididymal 단백질 생 합성 및 분 비5의 대량에 대 한 책임이 있습니다. 대조적으로, epididymal 소마 내에서 두 번째로 가장 풍부한 셀 형식으로 순위, 명확한 세포 인구는 주로 luminal 구성 요소의 선택적 흡수와이 microenvironment5의 산성화에 참여. 복잡성의 또 다른 계층을 추가, androgens 및 다른 lumicrine 요인 고환 근원의 이러한 epididymal 종류의 세포는 따라 그들의 위치에 따라 각 차동 제어를 발휘 한다.
이러한 복잡성에 의해 부과 된 한계에도 불구 하 고 뜻깊은 침해 epididymal 함수의 기계적으로 해결로 만들 수 계속. 이러한 연구를 키 고급 질량 분석 전략의 응용 프로그램 이러한 초기 설문 조사 중에서 선택 하는 개별 단백질의 상세한 분석에 epididymal 프로테옴의 대규모 재고 설정 되었습니다. 이 방법의 그림은 마우스 모델21에 mechanoenzymes의 DNM 가족의 우리의 최근 특성화. DNM에 우리의 초기 관심 및 endocytotic 프로세스의 결합에서의 듀얼 액션에 의해 연료 했다. 이러한 관측에 건물, 우리 DNM (DNM1-DNM3)의 세 정식 isoforms 높은 마우스 epididymis 표현 되며 단백질 분 비 및 흡수21에서 규제 역할을 수행 하기 위해 적절 하 게 위치를 보여줄 수 있었다 . 또한, 우리 수 있었다 명확 하 게 그들의 세포질 부 세포 현지화 기준 각 DNM isoform를 차별화 하는 따라서 그들은 보완, epididymal 상피21내 중복 활동 반대로 소유 제안.
우리가 희망이 정보 대체 epididymal 단백질의 특성에서 광범위 한 응용 프로그램을 찾을 것입니다 및 따라서 기여할 마우스 epididymis DNM 식의 연구에 대 한 고용 실험 방법론을 설명 하는 여기, 우리의 남성 생식 관의이 중요 한 요소의 기능의 이해. 특히, 우리는 면역 형광 라벨 파라핀 끼워 넣어진 epididymal 섹션에서 대상 단백질과 면역 형광 검사를 통해 이러한 단백질의 공간 배급의 후속 검색에 대 한 강력한 방법론의 개발을 설명 현미경 검사 법입니다. 우리는 더 격리 및 epididymosomes;의 특성화에 대 한 우리의 최근 최적화 된 프로토콜22 문서 epididymal 분 비 프로필의 핵심 요소를 구성 하 고 정자 성숙23홍보에 저명한 역할을 표시 하는 작은 exosome 같은 소포 상호 보완적인 접근, 우리 또한 설명 하는 불멸 하 게 마우스 caput epididymal 상피 (mECap18) 셀 라인에서 대상 단백질의 면역 형광 탐지 및 epididymal의 규정을 탐험 하는 모델로이 리소스를 사용 하 여 분 비 활동 체 외

<table><tbody><tr><td>Dynamin 1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab108458</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Dynamin 2 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6400</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Dynamin 3 antibody</td><td>Proteintech</td><td>14737-1-AP</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>ATP6V1B1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21206</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>CD9 antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553758</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: monoclonal</td></tr><tr><td>Flotillin-1 antibody</td><td>Sigma</td><td>F1180</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>ALOX15 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab80221</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>TUBB antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5274</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Mouse, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: monoclonal</td></tr><tr><td>PSMD7 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11436</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11008</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11055</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Donkey, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11058</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Donkey, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11007</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rabbit HRP</td><td>Millipore</td><td>DC03L</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rat HRP</td><td>Millipore</td><td>DC01L</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Mouse HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>4&#039;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Thermo</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;alpha;-androstan-17&amp;beta;-ol-3-oneC-IIIN</td><td>Sigma</td><td>A8380</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Thermo</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Astral</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-gysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>78787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Ajax Finechem</td><td>A6-2.5 L GL</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poly (vinyl alcohol)</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Ajax Finechem</td><td>783-500G</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axio Imager A1</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Optima Max-XP</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuges</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Heracell</td><td>150</td><td></td></tr><tr><td>Large Orbital Shaker</td><td>Ratek</td><td>OM7</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>LG</td><td>MS3840SR /00</td><td></td></tr><tr><td>Lab pH Meter</td><td>MeterLab</td><td>PHM220</td><td></td></tr><tr><td>Liquid-repellent slide marker</td><td>Daido Sangyo</td><td>Mini</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo</td><td>586</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>CELLSTAR</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Mikro-Glass</td><td>SF41296PLMK</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m filter</td><td>Millox-HV</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Dustfree Paper</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 &amp;times; 35 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>347356</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 &amp;times; 56 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &amp;micro;m Nylon</td><td>FALCON</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 &amp;times; 10 mm with cams</td><td>SARSTED</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Slide jar</td><td>TRAJAN</td><td>#23 319 00</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of epididymal protein synthesis and secretion

포유류 epididymis 후 고환 성숙과 정 충의 저장소를 지원 하기 위해 모든 내 분 비 동맥의 가장 복잡 한 intraluminal 체액 중 하나를 생성 합니다. 이러한 복잡성 라이닝 상피 세포의 결합된 분 비 및 흡수 성 활동으로 인해 발생합니다. 여기, 우리 dynamin (DNM) mechanoenzymes;의 모델 단백질 가족에 초점을 맞춤 으로써 epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석을 위한 기법을 설명 양방향 멤브레인 밀매 이벤트 규제 가능성이 있는 큰 GTPases Epididymal 조직에서 단백질 식의 연구를 위해 우리는 면역 형광 라벨 파라핀 포함 섹션에서 대상 단백질과 통해이 단백질의 공간 배급의 후속 검색에 대 한 강력한 방법론을 설명 면역 형광 검사 현미경 검사 법입니다. 우리는 또한 격리 및 소포, 정자 세포를 성숙 세포 통신에 참여할 수 epididymal 루멘으로 은닉 되는 epididymosomes로 알려진 같은 exosome의 특성화에 대 한 최적화 된 방법론을 설명 합니다. 상호 보완적인 접근, 우리 또한 SV40 불후 마우스 caput epididymal 상피 (mECap18) 셀 라인에서 대상 단백질의 면역 형광 탐지 설명. 또한, 우리는 모델을 적합 한 생체 외에서 epididymal 분 비 활동의 규칙을 탐구 하는 mECap18 셀 라인의 유틸리티 설명. 이 목적을 위해 우리는 mECap18 세포 선 및 그들의 분 비 단백질 프로 파일에 영향을 미치는 수 있는 선택적 약리 억제 요법의 사용의 유지 보수에 대 한 자란 요구 사항을 설명 합니다. 후자는 쉽게 수확 바른된 문화 매체, trichloroacetic 산/아세톤 강 수를 통해 분 비 단백질의 농도 및 SDS 페이지 및 immunoblotting 통해 그들의 후속 분석을 통해 평가 합니다. 우리는이 결합 된 메서드는 정자 성숙 및 저장에서 그들의 기능적인 역할을 결정 하는 전주곡으로 대체 epididymal 단백질 목표의 분석에 적합 다 투 다.

그림 1 그리고 그림 2 마우스 caput epididymis DNM의 면역 형광 지역화의 대표적인 결과 보여줍니다. 각각 3 DNM isoforms의 디스플레이 별개 지역화 프로필 조사. 따라서, DNM1 (그림 2A) 초기 세그먼트 및 caput epididymis 걸쳐 epididymal 셀의 상대적으로 겸손 한 확산 라벨 특징 이다. 대조적으로, DNM2 isoform 처?...

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Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

여기, 우리 보고 dynamin 파라핀 끼워 넣어진 마우스 epididymal 섹션에 있는 단백질의 검출 및 불멸 하 게 epididymal 셀 라인 (mECap18)의 프로토콜을 설명 하기 위해의 면역 형광 지역화 합니다. 우리는 또한 epididymal 액체 및 조건된 셀 미디어에서 분 비 단백질의 격리에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

Epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K 조회수.  University of Newcastle. 여기, 우리 보고 dynamin 파라핀 끼워 넣어진 마우스 epididymal 섹션에 있는 단백질의 검출 및 불멸 하 게 epididymal 셀 라인 (mECap18)의 프로토콜을 설명 하기 위해의 면역 형광 지역화 합니다. 우리는 또한 epididymal 액체 및 조건된 셀 미디어에서 분 비 단백질의 격리에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

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Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

연구

생화학

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

발생학

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

생물학

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

의학

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

설치류 부고환 정자의 포스 포 분석

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석

요약

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