이전에 사용된 시험관내 또는 생체외 모델은 진피 세포 성분과 피부 조직의 복잡성이 결여되어 있다. 이 전 현장 SCAD 분석은 설정된 한계를 극복하고 상처 입은 동물 외부의 흉터 발달을 연구 할 수있게합니다. SCAD 분석은 피부 미세 환경에서 섬유아세포 이동 및 흉터 형성을 시각화할 수 있게 해줍니다.
그것은 활성화제 또는 억제제의 스크리닝 라이브러리가 흉터 형성의 기계론적 기초를 이해할 수있게합니다. SCAD 모델을 사용하여 상처 복구에 관여하는 분자 과정과 기본 과정을 이해하는 편평한 라이브러리의 고처리량 스크리닝 분석. SCAD 분석은 피부 외식편을 사용하여 수행하기 쉽습니다.
일관된 흉터를 얻으려면 출생 후 제로 또는 하루 한 피부를 선택하는 것이 좋습니다. 출생 후 0 일 또는 신생아 새끼를 희생 한 후 멸균 외과 용 메스를 사용하여 골격근층까지 1.5 x 1.5 센티미터의 전체 두께의 등쪽 등 피부를 조심스럽게 소비하십시오. 멸균 곡선 포셉을 사용하여 피부를 벗겨 내고 표면 근막이 기본 panniculus carnosus 근육과 손상되지 않도록하십시오.
적출된 조직을 50 내지 100 밀리리터의 차가운 DMEM F-12 배지로 세척하여 오염된 혈액을 제거한다. 그런 다음, 행크스 균형 소금 용액으로 조직을 세척하여 조직 및 세포 생존력을 유지한다. DMEM F-12 배지가 들어있는 10cm 페트리 접시에 표면 근막으로 피부를 거꾸로 놓습니다.
그런 다음 일회용 두 밀리미터 생검 펀치를 사용하여 전체 두께의 둥근 피부 조각을 소비하여 딱지가있는 조직을 생성하여 표피까지 기본 panniculus carnosus 근육으로 표면 근막이 손상되지 않도록하십시오. 페놀 레드가 없는 신선한 DMEM F-12 완전 배지 200마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 멸균 포셉을 사용하여 딱지가 달린 개별 조직을 거꾸로 96웰 플레이트의 웰로 옮기고 완전히 잠급니다.
플레이트를 표준 조건 하에 유지된 세포 배양 배양기로 옮긴다. 배양 이틀 및 네 번째 날에, 웰에 10 마이크로리터를 남기고 신선한 미리 가온된 DMEM F-12 완전 배지를 치료 화합물과 함께 첨가하여 지속적인 세포 및 조직 생존력 조건을 유지한다. SCAD의 라이브 이미징을 위해, 마이크로파에서 가열하여 유리 병에 PBS에 2 내지 3%의 저융점 아가로스 용액 30밀리리터를 준비한다.
끓인 후, 즉시 병을 옮기고 액체 아가로스 용액을 섭씨 40도 수조에서 식히십시오. 다음으로, 근막 또는 흉터가 위쪽을 향하도록 SCAD 조직을 35mm 접시의 중앙으로 옮깁니다. 그런 다음 1000 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 섭씨 40도 액체 아가로스를 천천히 부어 실온에서 SCAD를 내장하였다.
아가로스는 두 분 안에 중합된다. 중합 후, 미리 예열된 DMEM F-12 완전 배지 2밀리리터를 첨가한다. 그런 다음 원고에 설명 된 적절한 인큐베이션 시스템을 갖춘 공초점 또는 다중 광자 현미경을 사용하여 제로 일에서 첫날까지의 시간 경과 이미지를 획득하십시오.
조직 수확을 위해, 배지를 멸균 PBS로 교체함으로써 관련 시점에서 조직을 세척한다. 멸균 포셉을 사용하여 각 SCAD를 2% 파라포름알데히드 500마이크로리터가 들어있는 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 섭씨 네 도에서 하룻밤 사이에 조직을 고정시킵니다. 다음날, 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 두 가지 또는 입체 면역형광 염색을 진행하기 전에 PBS로 조직을 세 번 세척한다.
0일과 다섯 일째에 SCAD의 대표적인 전체 마운트 밝은 필드 이미지가 여기에 표시됩니다. 수직 조직 절편의 Masson의 삼색 염색은 조직 흉터, 조직 수축 및 흉터 코어에서 세포 외 매트릭스의 축적의 시그니처를 보여줍니다 0 및 다섯 일. SCADs의 면역형광 염색을 제로 및 오일째에 나타내었다.
초기 및 후기 단계 흉터에서, 뿌리 내린 양성 섬유 아세포는 녹색으로, 뿌리 내린 부정적인 섬유 아세포는 빨간색으로 표시됩니다. 입체 영상화를 위해, 조직을 아가로스 용액에 포매하고 PBSGT로 얹었다. 대표적인 이미지는 하루 다섯 SCAD의 흉터 부위에서 N-cadherin 단백질의 배타적 국소화를 입증한다.
인큐베이션 챔버가 장착 된 입체 시간 경과 이미징 설정은 처음 12 시간 또는 흉터 발달의 초기 단계에 걸쳐 섬유 아세포 떼의 진행의 초기 사건을 표시했습니다. 흉터 발달에 대한 개별 섬유아세포의 단일 세포 추적 세포 궤적의 그래픽 표현이 여기에 제시된다. SCAD 조직을 우물 플레이트 안쪽에 거꾸로 배치하여 근막이 위쪽을 향하도록 하는 것이 중요합니다.
이렇게 하지 않으면 마이그레이션 패턴이 불가피하게 변경됩니다. 이 절차를 통해 화학적 조절제, 중화 항체 또는 바이러스 방법을 사용하여 치료 또는 배양을 위해 진피층을 검사 할 수 있습니다. 이것은 다양한 의료 환경에서 병리학 적 섬유성 반응을 평가하는 데 도움이됩니다.
우리는 상처시 근막 동원에 관여하는 핵심 분자로서 connexin-43과 N-cadherin의 발현을 보여주었습니다. SCAD 방법론은 흉터와 섬유증을 줄이기위한 새로운 치료 전략의 식별을 가능하게합니다.
