Name: a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity
Uploaded: 2009-05-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity at JoVE.com

저자 DRS 감사하고 싶습니다. 릭 라이언, Umesh 파텔, 제프까지, 매튜 수의, Jehangir Mistry 이러한 프로젝트 및 프로토콜의 개발 기간 동안 지원 미쉘 Hatler.

셀 준비 : <ol><li> 성장 미디어 분석, 문화 뉴런 / astrocytes에 대한 셀 시딩 이전까지 ~ 70-80%의 합류 (세포 해동하거나 고립에서 직접 시딩 제외). </li><li> 관심 세포 유형에 적절한 방법을 통해 문화 flasks / 접시에서 세포를 분리합니다. 필요한 경우, 폴리 - D - 라이신 또는 세포외 기질 단백질로 코트 분석 플레이트 우물은 세포 접착력을 향상시키기 위해. astrocytes와 뉴런의 공동 문화가 동시에 또는 순차적으로 씨앗을 품고있을 수 있습니다. 순차 seedings 들어, &quot;기초&quot;레이어 첫번째 astrocytes의 도금이 필요한 경우의 연결을 도금과 차별화 뒤에, 권장합니다. 셀 유형, 후속 문화 시간, 관심의 매개 변수에 맞게 셀 밀도를 조절 등 문화 시대에 따라, 세포의 소스와 시딩 밀도는, 기본 문화 확산, GFAP 표현이나 neurite의 파생물의 속도에 크게 차이가있을 수 있습니다 - 그것은 중요합니다 특징과 가장 생물 학적 귀하의 실험 모델 관련뿐만 아니라 HCS를 (그림 1 참조)를 사용하여 효과적인 영상, 세분화 및 분석을 위해 제공을 제공하기 위해 전지 시스템을 최적화합니다. 플레이트 (셀은 다음 3 단계에서 설명한대로 독소의 치료를 촉진하기 위해, 90 μL 언론에 씨앗을 품고있을 수 있습니다)에 세포를 추가한 후에, 플레이트도 휴대폰 유통을 활성화, 15-30 분 실온에서 수준의 표면에 앉을 수 있습니다. 이 기간에 따라, 적어도 24 시간 동안 성장 미디어에 품어 세포 (37 ° C / 5% CO 2) 다음, 차별화 문화 조건으로 전환 (예를 들어, PC12 세포에 대한 낮은 혈청 / NGF), 적절하게. 세포가 세포 유형에 적절한 간격으로 미디어를 변경 합류 또는 분화의 원하는 수준에 도달할 때까지 문화를 계속합니다. </li><li> 세포 치료 (제어 화합물, 시험 화합물 등)의 관심 치료 시간 코스에 따라,이 문화 기간 동안 어느 시점 도입하실 수 있습니다. 아크릴 아미드, 과산화수소와 K - 252A는 neurotoxic 제어 화합물로 제공됩니다. 충분한 시약은 모두 다섯 96 - 웰 플레이트에 대한 중복 12 포인트 선량 반응 곡선 (선량 반응 내의 DH 2 O 또는 DMSO 제어 세트 포함) 제공됩니다. 화합물은 250X 농도 (K - 252A에 대해 1 μm의 최대 치료를 가정) 또는 10X (아크릴 아미드와 과산화수소에 대해 각각 100 MM 10 MM, 최대 트리 트먼트를 가정)에서 제공합니다. 추천 치료 준비 반 로그인 관련 :에 복잡 희석 버퍼에 희석하여 다음 (1 √ 10) DMSO의 250X 화합물의 시리얼 희석을 10X (DH 2 O에서 발생하는 10X 제어 화합물은 순차적으로 살균 DH 2 O에 직접 희석 수 있습니다 또는 복합 희석 버퍼). 각각의 치료 10 μL 그런 다음 최종 1X 농도 (0.4 % DMSO 또는 10% DH 2 O)에 대한 각 우물에 이미 현재 문화 미디어의 90 μL에 추가할 수 있습니다. 샘플 데이터는 ° C 이전에 고정하기 37 복합 치료의 24 또는 96시간 제공됩니다. </li></ol> 세포 고정과 Immunofluorescent 스테 이닝 : 참고 : 스테 이닝 시간이 ~ 2.5 시간 후 고정합니다. 우물은 얼룩 단계 사이 건조하는 것을 허용하지 않습니다. 시약의 열망과 분배는 유체 전단으로 인한 세포 손실을 감소하기 위해 낮은 흐름 속도에서 실시하여야한다. 모든 권장 볼륨 &#39;잘 당&#39;은 96 잘 microplate 잘 하나를 참조하십시오. 볼륨 &#39;96 - 웰 플레이트마다&#39;전체 권장 액체 처리 볼륨 손실 25 % 초과를 포함합니다. 모든 얼룩 단계 실온 (RT)에서 수행됩니다. 모든 버퍼와 항체 솔루션은 RT 적어도 24 시간 동안 안정합니다. <ol start="4"><li> 문화 기간의 끝에, 실온 (RT) 또는 37 º C로 사전에 따뜻한 HCS의 고정 솔루션 (2X) (12 mL/96-well 플레이트) 원하는 경우. 화학 펌 모자 / 물론 직접적인 문화 매체에 100 μL를 추가하고 RT에서 30 분 수정하실 수 있습니다. (MSDS 참조) 정착액 / 독소 함유 미디어를 제거하고 유해 폐기물에 대한 규정에 따라 처리. 얼룩 즉시 진행하는 경우, HCS Immunofluorescence 버퍼 200 μL와 각각 두 번 잘 씻어. 또는, 접시는 나중에 스테인드 수있다면, 우물과 긴밀하게 얼룩까지 4 º C에서 밀봉 저장 플레이트에서 두 번째 린스 볼륨을두고 다음 씻어 버퍼 200 μL로 두 번 씻어. </li><li> 고정 샘플 전에 얼룩 4 º C에 저장되어있다면, 얼룩 프로토콜하기 전에 200 μL HCS Immunofluorescence 버퍼로 두 번 씻어. </li><li> 다음과 같이 래빗 방지 βIII Tubulin / 마우스 방지 GFAP HCS 차 항체 (6 mL/96-well 판)의 솔루션을 작업 준비 : HCS Immunofluorescence 버퍼의 5.88 ML 각 해동 기본 항체의 60 μL를 추가합니다. 잘 섞는다. 이전 Immunofluorescence 버퍼 린스 제거합니다. 각 잘하는 차 항체 용액 50 μL를 추가하고 RT에서 1 시간 동안 부화. </li><li> 차 항체를 제거솔루션입니다. 200 μL HCS Immunofluorescence 버퍼로 세 번 씻어. </li><li> 다음과 같이 HCS 차 항체 / Hoechst HCS 원자력 스테인 (6 mL/96-well 판)의 작업 솔루션을 준비 : 각 해동 이차 항체의 30 μL 및 해동 Hoechst HCS 원자력의 30 μL HCS Immunofluorescence 버퍼의 5.91 ML에 얼룩을 추가합니다. 빛과 솔루션을 보호, 잘 섞는다. 이전 HCS Immunofluorescence 버퍼가 씻어 제거합니다. HCS 차 항체 / Hoechst HCS 원자력 스테인 솔루션을 50 μL를 추가하고 빛으로부터 보호 RT, 1 시간 동안 부화. </li><li> HCS 차 항체 / Hoechst HCS 원자력 스테인 솔루션을 제거합니다. 200 μL HCS Immunofluorescence 버퍼로 두 번 씻어. </li><li> 이전 HCS Immunofluorescence 버퍼가 씻어 제거합니다. 우물에서 두 번째 린스 볼륨을 떠나, HCS 워시 버퍼 200 μL로 두 번 씻어. </li><li> 4 º C 즉시 인감 판과 이미지 또는 저장 판은 영상에 대한 준비까지 빛으로부터 보호. </li></ol> 이미지 수집 및 분석 : <ol start="12"><li> 스테인드 접시의 이미징 및 분석은 세포 분석기 (GE 헬스케어)를 포​​함 가능 HCS 플랫폼, ArrayScan (ThermoFisher 과학) 또는 오페라 (퍼어킨 엘머)의 다양한시 수행할 수 있습니다. 이미징 및 분석을위한 몇 가지 지침은 표 1에서 제공됩니다 : </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 이미지 수집 가이드 </td></tr><tr><td> 탐지 시약 </td><td> 목표 렌즈 </td><td> 여기 필터 범위 [피크 / 대역폭 (NM)] </td><td> 배출 필터 범위 [피크 / 대역폭 (NM)] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS 핵은 스테인 </td><td> 20X </td><td> 40분의 360 </td><td> 40분의 460 (또는 필요한 경우 50분의 535) </td></tr><tr><td> HCS 차 항체, FITC - 돈키 안티 - 토끼 IgG </td><td> 20X </td><td> 40분의 480 </td><td> 50분의 535 </td></tr><tr><td> HCS 차 항체, Cy3 - 돈키 안티 - 마우스 IgG </td><td> 20X </td><td> 50분의 535 </td><td> 50분의 600 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 이미지 분석 가이드 </td></tr><tr><td> 세포 매개 변수 </td><td> 검색 </td><td> 세그먼트 / 측정 </td><td> 이론적 해석 </td></tr><tr><td> 휴대폰 번호, 핵 특성 </td><td> Hoechst HCS 핵은 스테인 </td><td> 원자력 지역 (460 NM 방출 채널). 핵의 개수를 계산합니다. DNA 내용 (핵 강도) 또는 핵 영역 분석도 가능합니다. </td><td> 별도의 연결 및 astrocytic 셀 카운트 / characterizations를 (권장)을 구하는 βIII - tubulin 또는 GFAP 표현과 관련된들을 위해 핵을 &quot;필터링&quot;할 수 있습니다 셀 손실, 독성 phenotypes 등을 확인하기 위해 휴대폰 번호, 핵 특성을 사용합니다. </td></tr><tr><td> βIII - Tubulin의 표현, Neurite의 파생물 </td><td> HCS 차 항체, FITC - 복합 </td><td> 세포질 영역 (535 nm의 방출 채널). FITC 신호 neurites (예 : 최소 / 평균 셀 신체 영역, 최소 / 최대 neurite의 길이와 넓이를 통해)에서 세포의 연결 기관을 구분하는 데 사용할 수 있습니다. 등 총 neurite의 길이, neurite 카운트 / 휴대폰 등 매개 변수를 결정 </td><td> Neurite의 가지 측정의 연결을 차별화하는 동안이나 화학 부상, 질병 상태 등의 결과로 변조된 수 있습니다 별개의 연결 특성을 (권장)을 구하는 βIII - tubulin 표현과 관련된들을위한 &quot;필터&quot;셀 단체 수있다. </td></tr><tr><td> GFAP의 표현, Astrocyte 지역 </td><td> HCS 차 항체, Cy3 - 복합 </td><td> 세포질 영역 (600 NM 방출 채널). Cy3 신호 astrocytic 세포질 세그먼트를 정의하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 평균 세포질 신호 강도, 셀 영역 등 매개 변수를 결정 </td><td> GFAP의 표현과 astrocyte 세포 영역 astrocyte 개발하는 동안이나 화학 부상, 질병 상태의 결과로 변조된 수 등 독특한 astrocytic 특성화를 (권장)을 구하는 GFAP 표현과 관련된들을위한 세포 기관을 &quot;필터링&quot;할 수도있다. </td></tr></tbody></table> . 표 1 이미지 수집 및 분석 지침 - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (CO - 문화) 어세이 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="그림 3" /> 그림 1. βIII - tubulin과 GFAP immunofluore혼합 쥐의 신경 세포 문화의 카메라는. 기본 쥐 hippocampal 뉴런 또는 쥐 PC12 세포 중 하나와 함께 기본 쥐 hippocampal astrocytes의 공동 문화가의 연결 시딩 다음에 문화에 며칠에 대한 사전 도금 astrocytes에 의해 생성되었습니다. PC12s가 차별화의 조건 (낮은 혈청 / NGF)에서 추가로 2 일간 교양 동안 차 뉴런은 추가 11일에 대한 교양되었습니다. 세포 처리, 고정 및 immunostaining은 HCS222 분석 프로토콜에 따라 수행되었다. 전지는 20X (주 뉴런) 또는 10X (PC12) 객관적인 배율에서 세포 분석기 1000 (3.3)에서 GE에 몇 군데와 세포 분석기 1000 워크 스테이션 (3.4) Neurite의 파생물 및 멀티 타겟 분석 알고리즘에서 GE를 사용하여 분석되었다 톱 패널. : Hoechst HCS 스테인 원자력 (파란색), βIII - tubulin (녹색) 및 GFAP (적색) 형광의 융합 영상. (세포 기관 파란색 (주 뉴런에 명시된) 또는 노란색 (PC12), 그린 (주 뉴런) 또는 하늘색 (PC12)에 neurites 가운데 패널) βIII - tubulin의 형광 채널의 분리 분석 neurite 가지 세분화를위한 수 있습니다. GFAP 채널의 분석 astrocyte 세분화 (핵 녹색 파랑, 세포질에 명시된 하단 패널)에 있습니다. 에 대해 별도의 셀 계산을 지원, (적색) (-) 기본 쥐 hippocampal 신경 / astrocyte 공동 문화 GFAP 세분화는 핵 / 세포 GFAP (+) (녹색 윤곽선)입니다 신체와 GFAP하는 사람을 구별하는 능력을 보여줍니다 혼합 문화 환경에서 뉴런과 astrocytes. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="그림 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="figure4 파트" /> 그림 2. 기본 쥐 선량 반응 hippocampal 신경 / 독성 스트레스에 공동 문화 astrocyte. 기본 쥐 hippocampal astrocytes는 (P6) 성장 미디어 96 - 웰 플레이트에 도금 6 일 동안 교양되었습니다. 기본 쥐 hippocampal 뉴런은 (해동 직접) 다음 사전 도금 astrocytes 위에 씨앗을 11 일 동안 성장 미디어에 교양되었습니다. 세포 문화의 마지막 24 시간 동안 아크릴 아미드 또는 수소 과산화물 (최대 농도 = 100mM 및 10mM, 각각)의 시리얼 dilutions로 치료했다. 세포 처리, 고정 및 immunostaining은 HCS222 분석 프로토콜에 따라 수행되었다. 전지는 20X (물론 10 필드 /)에서 세포 분석기 1000 (3.3)에서 GE에 몇 군데와 세포 분석기 1000 워크 스테이션 (3.4) Neurite의 파생물 및 멀티 타겟 분석 알고리즘에서 GE를 사용하여 (세포질 / 핵 / neurite 세분화) 분석했다. 표시 데이터 굴어요 ± SEM, N = 3. 여러 매개 변수 (neurite 가지, GFAP 강도, astrocyte 지역의 연결 또는 astrocytic 셀 카운트) 선량에 의존 동향에 대해 조사했다.

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저자는 Millipore Corporation의 모든 임직원 수 있습니다.

지금까지, 뉴런과 astrocytes의 혼합 문화를 사용하여 neurotoxicity 위험 평가를 공부하기위한 체외 실험에서 제한되었습니다. 그것은 glial 세포가 뉴런에 공간과 신진 대사 지원을 제공 통합하고 있으며,의 연결을 마이 그 레이션, 분화와 시냅스 활동을 포함한 여러 modulating의 연결 기능에 중요한 역할을 것을 잘 허용됩니다. Glial astrocytes 또한 크린 시토킨 많은 독소의 양쪽의 연결 조직을 둘러싼에 불리한 반응을 유도뿐만 아니라 홍보의 연결을 허용 수있는 다른 가용성 요소를 놓습니다. 이러한 항산화 방어하고 세포의 에너지 수준의 유지 보수와 같은 astrocytic 기능의 장애가로 표시되었습니다 반면에의 연결 - glial 상호 작용의 깊이를 보여주는, 공동 문화 연구에 astrocytes은 산화 스트레스의 독성에 대한 뉴런을 보호하기 위해 표시되었습니다 비판적으로의 연결을 생존에 영향을 미칩니다. 최근 연구는 체외의 neurotoxicity 테스트 - 시스템에 astrocytes의 사용 혼자의 연결을 세포보다 인간의 중추 신경계의 구조와 기능 관련성이 될 수 있습니다 것을 제안했습니다. 의 연결 - astrocytic 상호 작용의 생리적 의의의 성장 인식에도 불구하고, 그것은 이전 그대로 세포에서 이러한 상호 작용의 양적 분석을 수행하기 어려운되었습니다. 하이 컨텐츠 스크리닝의 출현은 강력한 새 assays의 개발이이 문제를 해결할 수 있습니다. 본 연구에서는, 우리는 하나의 분석에서 여러의 연결 및 astrocytic phenotypes의 양적 분석은 HCA에 의해 가능하게 한 것을 증명하고있다. 기본 뉴런에서 우리는의 연결 번호, neurite 카운트와 neurite 길이로 neurotoxicity 마커의 양적 측정을 수행했습니다. astrocytes에 반응 gliosis는 GFAP 표현, astrocyte 번호 ​​astrocyte 형태의 변경에 의해 특징 neurotoxicity의 알려진 biomarker입니다. 우리는이 끝점 각각이 쉽게 HCA를 통해 평가 수 증명하고있다. 이 연구는 신경 특정 생체 HCA가 급속하게 neurotoxic 종점에 대한 화학 물질의 큰 숫자를 화면으로 체외 테스트에의 배터리의 일환으로 사용될 수있는 개념을 지원합니다. 뉴런과 astrocytes의 공동 문화 Millipore의 HCS222 하이 컨텐츠 분석 키트는 고품질 탐지 시약 동시에 neurotoxicity의 세포 모델의 다양한 βIII - tubulin과 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)를 프로 파일링을위한 프로토콜로 구성되어 있습니다. 이 키트와 함께 제공되는 높은 유효 시약은 사용자가 assays을 표준화 분석 - 투 - 분석 변화를 최소화하고, reproducibly 높은 신호 대 배경 비율로 이미지를 생성하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Rabbit Anti-&amp;#946;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201672</td><td>1 vial containing 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td><td></td><td>Part No. CS201649</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201671</td><td>1 vial containing 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td><td></td><td>Part No. CS200437</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst HCS Nuclear Stain, 200X</td><td></td><td>Part No. CS200438</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td><td></td><td>Part No. CS200434</td><td>1 bottle containing 100 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td><td></td><td>Part No. CS200435</td><td>1 bottle containing 1000 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Wash Buffer, 1X</td><td></td><td>Part No. 2007643</td><td>1 bottle containing 500 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201679</td><td>1 vial containing 500 &amp;#x03BC;L of 1M acrylamide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201730</td><td>1 vial containing 500 &amp;#x03BC;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>K-252a (Control Compound), 250X</td><td></td><td>Part No. CS201741</td><td>1 vial containing 100 &amp;#x03BC;L of 250 &amp;#x03BC;M K-252a in DMSO&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>DMSO for Compound Serial Dilution</td><td></td><td>Part No. CS200441</td><td>1 bottle containing 10 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Compound Dilution Buffer</td><td></td><td>Part No. CS200442</td><td>1 bottle containing 25 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Plate Sealers</td><td></td><td>Part No. CS200443</td><td>10 each&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCS imaging/analysis system</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

하이 컨텐츠 분석 (HCA) assays은 단일 분석에서 여러 세포 phenotypes의 측정을 수 있도록 자동 이미징과 강력한 이미지 분석 알고리즘 세포 검출 시약을 결합. 본 연구에서는, 우리는 neurotoxicity에 대한 소설 분석을 개발하는 HCA를 활용. Neurotoxicity 평가는 중요한 약물 안전 평가의 일부뿐만 아니라, 환경 보호 노력의 중요한 초점이되고를 나타냅니다. 또한, neurotoxicity는 잘 접수<em&gt; 체외에서</em등 알츠하이머와 파킨슨병의 질병으로 neurodegenerative 질병의 개발&gt; 마커. 최근의 연결을 검사하기 위해 HCA의 신청이보고되었습니다. βIII - tubulin로의 연결을 세포를 분류하여, HCA의 assays은의 연결 번호, neurite 개수 및 neurotoxic 효과를 나타낼 수있는 모든있는 neurite의 길이로 매개 변수의 높은 처리량이 아닌 주관적인, 양적 측정을 제공할 수 있습니다. 그러나, astrocytes의 역할은이 모델에서 미개척 남아 있습니다. Astrocytes는 중추 신경계 (CNS) 항상성의 유지에 중요한 역할을 가지고 있고, 그들이 독성 물질 또는 질병 상태에 대한 응답으로 활성화됩니다 neuroprotection 및 neurodegradation 모두와 관련됩니다. GFAP는 CNS의 astrocytes에 주로 표현 중간 필라멘트 단백질이다. Astrocytic 활성화 (gliosis)은 일반적으로 증식과 비대 astrocyte 함께 GFAP의 upregulation에 연결됩니다. 반응 gliosis의이 과정은 신경계 손상의 초기 마커로 제안되었습니다. GFAP의 quantitation에 대한 전통적인 방법은 면역입니다. 이러한 접근 방식은 셀룰러 현지화, 형태학 및 휴대폰 번호에 대한 정보를 제공하는 무능력에 의해 제한됩니다. 우리는 HCA 이러한 한계를 극복하기 위해 동시에 gliosis와 관련된 여러 기능을 측정하는 데 사용될 수 있다고 결정 - GFAP 표현의 변화, astrocyte 비대하고, astrocyte 확산 - 단일 분석 이내에 있습니다. 공동 문화 연구에서, astrocytes는 독성 모욕 여러 종류에 대해 신경을 보호하고 비판적으로의 연결을 생존에 영향을 보여왔다. 최근 연구 제안했다고에서 astrocytes의 사용<em&gt; 체외에서</em&gt; neurotoxicity 테스트 시스템은 혼자의 연결을 세포보다 인간 CNS 구조와 기능 관련성이 될 수 있습니다. βIII - tubulin과 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)를 프로 파일링을위한 따라서, 우리는, 뉴런과 astrocytes의 공동 문화 HCA 분석을 개발 프로토콜의 구성과 검증 있고, 타겟 특정 검색 시약. 이 분석은 neurotoxicity 평가가 아닌 주관적인, 높은 처리량 분석 소설을 대표하는 neurotoxicity의 동시 분석, neurite의 파생물, gliosis, 세포 모델의 다양한의 연결 및 astrocytic 형태학 및의 연결 및 astrocytic 개발을 수 있습니다. 분석은 신경 과학 연구 및 약물 발견에 neurotoxicity와 생산성 향상의 향상된 검출을위한 잠재력을 보유하고 있습니다.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

이 문서는 소설 프로토콜 및 시약 높은 컨텐츠 분석을 사용하여 뉴런과 astrocytes의 공동 문화 화합물과 치료의 neurotoxic 효과 민감한 측정을위한 설정에 대해 설명합니다. 결과는 높은 컨텐츠 분석 neurotoxicity 평가에 대한 흥미 진진한 소설 기술을 대표하는 것을 보여줍니다.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Research

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Biology

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비디오: A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

새 Coculture 방법을 사용 액슨 성장에 대한 연구 Glial 세포 이질 영향

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

연구

신경과학

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

생물학

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides reliable analysis of neuronal morphology together with quantitative measurements of modifications on neurite length and synaptic protein localization and abundance upon treatment with small molecule compounds. In addition to the application of the presented method in neurite outgrowth studies, neurotoxicity assessment can be performed to assess, distinguish and rank commercial chemical compounds based on their potential developmental neurotoxicity effect.
Even though cell lines are nowadays widely used in compound screening assays in neuroscience, they often differ genetically and phenotypically from their tissue origin. Primary cells, on the other hand, maintain important markers and functions observed in vivo. Therefore, due to the translation potential and physiological relevance that these cells could offer neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment can considerably benefit from using human neural progenitor cells (hNPCs) as the primary human cell model.
The presented method herein can be utilized to screen for the ability of compounds to induce neurite outgrowth and neurotoxicity by taking advantage of the human neural progenitor cell-derived neurons, a cell model closely representing human biology.&#34;

The presented protocol describes a method for a neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment of small molecule compounds.

인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 Neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

발생학

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

이혈증에서 신경 신경-Glia 상호 작용의 역할을 공부 하기 위한 세포 배양 모델

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to study the process of neuronal survival upon cytotoxic stress. Most methods are based on biochemical approaches that do not allow single-cell resolution or involve complex and costly methodologies. Presented here is a versatile, inexpensive, and effective experimental paradigm to study neuronal survival. This method takes advantage of sparse fluorescent labeling of the neurons followed by live imaging and automated quantification. To this aim, the neurons are electroporated to express fluorescent markers and co-cultured with non-electroporated neurons to easily regulate cell density and increase survival. 
Sparse labeling by electroporation allows a simple and robust automated quantification. In addition, fluorescent labeling can be combined with the co-expression of a gene of interest to study specific molecular pathways. Here, we present a model of stroke as a neurotoxic model, namely, the oxygen-glucose deprivation (OGD) assay, which was performed in an affordable and robust homemade hypoxic chamber. Finally, two different workflows are described using IN Cell Analyzer 2200 or the open-source ImageJ for image analysis for semi-automatic data processing. This workflow can be easily adapted to different experimental models of toxicity and scaled up for high-throughput screening. In conclusion, the described protocol provides an approachable, affordable, and effective in vitro model of neurotoxicity, which can be suitable for testing the roles of specific genes and pathways in live imaging and for high-throughput drug screening.

Here, we present a simple, potent, and versatile methodology to investigate neuronal survival upon cytotoxic stress in primary cortical neurons with cellular resolution in real time or in fixed material.

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to ...

 CNS 상호작용 연구를 위한 1차 미세아교세포 및 뉴런 공동 배양 프로토콜

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

저자 스포트라이트: 질병 상태에서 미세아교세포-신경 세포 상호 작용을 연구하기 위한 체외 공동 배양 모델

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

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새 Coculture 방법을 사용 액슨 성장에 대한 연구 Glial 세포 이질 영향

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 Neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가

간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :

이혈증에서 신경 신경-Glia 상호 작용의 역할을 공부 하기 위한 세포 배양 모델

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons