유방암은 심각한 부정적인 부작용을 동반하는 제한된 예방 전략을 가진 만연하고 치명적인 질병입니다. 부작용이 감소된 방법을 제공하기 위해 우리는 생체 내 영상과 유방암 예방을 동시에 허용하는 쥐 유관 나무에 에탄올 기반 절제 용액을 관내 주사하는 기술을 개발했습니다. 이것은 젖꼭지 개구부에 직접 주사하면 최소한의 부수적 인 조직 손상으로 유방 상피 세포를 표적으로 삼을 수있는 마우스에서의 이전 연구를 기반으로합니다.
생쥐와 쥐 모두 유두 입구에서 유래 한 단일 덕트 나무를 포함하는 유선을 가지고 있습니다. 쥐는 마우스보다 크며 모델의 확장성을 증명하기 위해 절제 성공 연구를 위해 더 많은 양의 에탄올을 주입할 수 있습니다. 이 방법의 또 다른 개선은 절제 용액에 에틸 셀룰로오스를 첨가하는 것입니다.
에틸 셀룰로오스는 이전에 표적화되는 영역에서 에탄올의 확산을 줄이기 위해 다른 임상 접근법에서 사용되었습니다. 이것은 화합물의 성질을 통해 이루어지며, 이는 조직의 체액과 접촉 할 때 겔화됩니다. 이 이미지 검증 유방암 예방 방법에는 5 가지 주요 단계가 있습니다.
우리는 먼저 실험실에서 준비된 수크랄로스 젤 컵을 사용하여 경구로 carprofen으로 동물을 투여하기 시작해야합니다. 이 확장 된 항 염증 치료는 절차 적으로 전후에 유지됩니다. 다음으로, 우리는 젖꼭지 주변 영역에서 모피를 제거하여 탈모 크림을 주입하여 주사를 위해 동물을 준비합니다.
그런 다음 바늘 삽입을 위한 젖꼭지 개구부의 시각화를 돕는 입체경으로 관내 주사를 수행합니다. 동물은 주사의 성공을 결정하기 위해 주사 후 microCT 또는 형광 투시로 스캔되거나 평가됩니다. 그런 다음 microCT 스캔을 처리하여 성공적인 충전에 대한 추가 분석을 위해 주입된 유관 나무의 3D 재구성을 생성할 수 있습니다.
스톡 카프로 펜은 먼저 PVS에서 필요한 농도로 희석됩니다. 멸균 식용 염료를 혼합물에 첨가하여 컵의 수크랄로스에 약물의 완전한 혼합을 더 잘 확인할 수 있습니다. 그런 다음 컵을 섭씨 60도의 수조에서 15분 동안 가열합니다.
제거 시 컵을 건조시키고 70% 에탄올로 컵 뚜껑을 청소하면 오염 위험이 줄어듭니다. Carprofen 용액은 뚜껑을 뚫기 위해 주사기를 사용하여 컵에 직접 주입 할 수 있습니다. 이 경우 원하는 결과를 얻으려면 500 마이크로 리터를 주입해야합니다.
컵을 15초 동안 흔든 다음 15초 더 휘젓기 전에 스티커로 구멍을 막습니다. 균질 혼합은 진한 파란색 덩어리를 찾아 평가할 수 있습니다. 그런 다음 필요할 때까지 컵을 냉장 보관할 수 있습니다.
동물은 주사가 일어나기 2-3 일 전에 준비해야합니다. 흡입제 이소 플루 란을 사용하여 동물을 마취하십시오. 마취 된 쥐를 온난화 패드의 코 콘으로 옮깁니다.
코뿔에있는 동안 쥐에게 눈 윤활제를 바르고 동물을 등 뒤에 놓습니다. 탈모 크림은면 팁 애플리케이터로 주사하려는 젖꼭지 부위에 적용 할 수 있습니다. 원하는 부위의 동물 피부를 가로 질러 애플리케이터를 위아래로 문지르면 모피가 더 빨리 풀릴 수 있습니다.
피부를 태우지 않도록 가능한 한 짧은 시간 동안 쥐에게 크림을 두는 것이 중요합니다. 쥐는이 절차에 생쥐보다 훨씬 민감합니다. 10-30 초 도포 후 거즈에 따뜻한 물을 사용하여 크림을 완전히 제거하십시오.
깨끗한 거즈로 피부를 건조시키기 전에 완전히 제거하기 위해 3-4 번의 헹굼을 사용하십시오. 모피 제거 부위의 젖꼭지에 대한 가시성과 접근이 좋은지 확인하십시오. 필요한 경우 탈모 절차를 반복하십시오.
마취에서 회복하기 위해 보온 패드의 깨끗한 회복 케이지에 쥐를 넣으십시오. 회복 후 집 케이지에서 준비된 쥐에게 카프로펜 컵 하나를 줍니다. 흡입제 이소플루란 마취를 사용하여 동물을 마취시키는 것으로 시작하고 쥐가 완전히 유도되면 코뿔로 옮깁니다.
주사를 위해 동물을 등 뒤로 눕히기 전에 눈 윤활제를 바르십시오. 주입 할 젖꼭지 근처의 다리를 테이프로 붙이는 것이 도움이 될 수 있지만 반드시 필요한 것은 아닙니다. 원하는 양의 주사액으로 주사기를 준비한 후에는 가능하면 끝이 가는 집게를 사용하여 눈에 보이는 각질을 제거하여 젖꼭지를 준비합니다.
가장 일반적인 관심사는 젖꼭지 개방 자체입니다. 쥐는 종종 개구부에서 튀어 나온 플러그를 가지고 있습니다. 이 플러그를 제거하면 더 나은 캐뉼러에 도움이 될 수 있습니다.
바늘의 경사가 보이면 끝이 가는 집게의 안내를 받아 바늘을 젖꼭지 끝에 삽입합니다. 젖꼭지 입구의 경로를 따르도록주의하십시오. 쥐 젖꼭지는 개구부 주변에 더 많은 지방이 있는 경향이 있어 이 지방을 더 쉽게 뚫을 수 있으며 바늘의 전진으로 인해 캐뉼러를 달성했다고 잘못 생각합니다.
바늘 경사가 젖꼭지로 완전히 둘러싸이면 천천히 용액을 주입하기 시작합니다. 원하는 속도는 쥐에서 분당 약 100 마이크로 리터입니다. 덕트 나무의 손상을 방지하기 위해 이보다 더 빨리 주입하지 마십시오.
주사가 끝나면 집게의 도움을 받아 젖꼭지에서 바늘을 제거하기 전에 30 초 동안 기다리십시오. 이렇게하면 젖꼭지에서 누출 될 가능성이 줄어 듭니다. 누출이 발생하면 축축한 거즈 또는 에탄올 천을 사용하여 용액을 청소하십시오.
콘트라스트 및 유출된 용액은 획득한 이미지를 왜곡할 수 있습니다. 여기에서 방금 표시된 주입 시퀀스의 확대 비디오를 볼 수 있습니다. 동물의 호흡으로 인해 젖꼭지를 단일 초점면에 유지하기가 어렵습니다.
이것은 젖꼭지가 일정한 위치에 남아 있지 않기 때문에 주입을 더 어렵게 만들 수 있습니다. 이 문제는 흉곽과 상위 3 개의 샘 쌍에 근접하여 악화됩니다. 이제 더 나은 캐뉼러를 위해 젖꼭지 입구의 플러그가 제거되었습니다.
바늘은 이제 집게의 도움으로 젖꼭지로 전진하도록 비스듬한 방향으로 향할 수 있습니다. 경사가 완전히 삽입되면 주입을 시작할 수 있습니다. 젖꼭지의 왼쪽을주의 깊게 보면 주사액이 덕트 나무를 통해 퍼지는 것이 약간 보이는 푸른 색조가 증가하는 것을 볼 수 있습니다.
이것은 두꺼운 피부 때문에 쥐에서 훨씬 덜 보입니다. 여기서 우리는 주입이 완료된 후 30 초 후에 바늘을 제거하고 결과 용액이 젖꼭지에서 쏟아지는 것을 볼 수 있습니다. 여분의 용액을 제거하여 젖꼭지에 외상이나 지방 패드 주사를 나타내는 부위의 돔이 보이지 않는 부위를 평가할 수 있습니다.
에탄올을 함유 한 용액을 주사하는 경우 알코올 중독을 피하기 위해주의를 기울여야합니다. 이를 위해서는 한 세션에서 얼마나 많은 에탄올을 주입 할 수 있는지 알고 시술 중에 자당 함유 용액 IP를 투여하여 효과를 상쇄해야합니다. 주사 후, 동물은 가열 패드의 깨끗한 케이지에서 회수되거나 주사 성공의 이미징을 위해 microCT로 이동할 수 있습니다.
주사 된 동물을 microCT 기기로 옮긴 후 이미징 중에 마취를 유지하기 위해 이소 플루 란을 계속 투여하십시오. 쥐의 크기가 커지면 좋은 이미지를 얻기 위해 추가적인 위치 조작이 필요합니다. 이미징할 부위 근처의 다리를 테이핑하기 전에 척추를 곧게 펴면 일관된 이미지를 생성하는 데 도움이 됩니다.
다리를 확장 된 위치로 테이핑하면 뼈가 이미지의 초점이되는 것을 방지 할 수 있습니다. 우리는 또한 쥐의 복부를 가로 지르는 테이핑이 하부 땀샘의 호흡 인공물을 줄이는 데 도움이 될 수 있음을 발견했습니다. 덕트 치료의 시각화를 위해 여러 스캔 매개 변수가 허용됩니다.
그러나 매개 변수를 선택할 때 항상 방사선 량을 고려해야합니다. 이러한 스캔으로 인한 방사선 량은 주어진 쥐 균주에 대한 방사선 한계를 초과해서는 안됩니다. 이미지 획득이 아닌 형광 투시 분석은 전반적인 방사선 부담을 크게 줄일 수 있습니다.
모든 스캔 또는 평가가 완료되면 동물을 온난화 패드의 깨끗한 회복 케이지로 되돌릴 수 있습니다. 동물은 완전히 회복되어 집 케이지로 돌아올 때까지 모니터링해야합니다. Carprofen 컵은 주사 후 최소 7 일까지 제공되어야합니다.
우리가 사용하는 microCT 기기의 소프트웨어를 사용하면 공식 분석 없이 주입의 성공을 평가하기 위해 빠른 변환을 생성할 수 있습니다. 이 기능에는 합리적인 신호 대 노이즈 감소를 허용하는 간단한 대비 슬라이더가 있습니다. 이러한 변환의 주요 결함은 전체 이미지를 동시에 임계값으로 지정해야 한다는 것입니다.
이것은식이 요법의 철분과 같이 덕트 나무의 일부가 아닌 밝은 신호가 이미지에 남아있게합니다. 경우에 따라 여기에 표시된 실제 신호는 배경처럼 어둡고 이미지에서 쉽게 임계값을 벗어날 수 있습니다. 관심 영역을 세분화 할 수있는보다 정교한 분석 소프트웨어를 사용하여 더 나은 공식 변환을 만들 수 있습니다.
주입 된 덕트 트리의 최상의 표현을 얻기 위해 추가 이미지 처리를 위해 유방 지방 패드를 분할하는 것이 가장 좋습니다. 유방 지방 패드의 어두운 경계는 이러한 분할을 달성하기 위해 동물의 전체 두께에 걸쳐 스플라인 추적될 수 있다. 세 번째 슬라이스마다 추적하고 물체를 전파하는 것만으로도 우리의 경험에서 덕트 전체를 포착하기에 충분합니다.
이 시점에서, 유방 지방 패드 내에 포함된 콘트라스트만을 표시하기 위해 주어진 분노를 사용하여 렌디션을 임계마킹할 수 있다. 여기에는 덕트 트리 내의 용액과 바로 근처의 누출이 포함되어야합니다. 산화탄탈륨 용액은 일반적으로 300 내지 3000 HU의 범위에서 잘 표시된다. 덕트 나무의 재구성을 만든 후에 추가 분석을 형성 할 수 있습니다.
종방향 이미징이 바람직하지 않은 경우, 덕트 트리의 복잡한 아키텍처를 더 잘 캡처하는 고해상도 이미지가 획득될 수 있습니다. 동물의 차이로 인해 주사가 다소 어려워 질 수 있습니다. 우리는 현재 Sprague Dawley 쥐와 독점적으로 작업하기 때문에 변형 가변성에 대해 말할 수 없습니다.
일부 동물은 여기 그림과 같이 낮은 프로파일의 젖꼭지를 가지고있어 성공적인 캐뉼러를 조작하고 달성하기가 어렵습니다. 다른 사람들은 여기에 표시된 것과 같이 더 높은 프로필의 젖꼭지를 가지고있어 캐뉼러에 더 적합합니다. 성공적으로 캐뉼러 된 젖꼭지가 여기에 묘사되어 있습니다.
캐뉼러가 어려우면 여기에 표시된 것처럼 젖꼭지에 외상을 입을 수 있습니다. 주입 직후 microCT 이미지를 획득하면 연구자에게 주입의 성공 여부를 더 잘 알릴 수 있을 뿐만 아니라 특정 용액의 충진 특성을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서 우리는 100 밀리몰 탄탈륨 산화물에 의해 제공되는 대조적으로 70 % 에탄올을 함유 한 동일한 부피의 절제 용액을 주사 한 동일한 쥐의 복부 땀샘의 다른 측면을 봅니다.
표시된 상단 글 랜드에 사용 된 용액에는 1 % 에틸 셀룰로오스도 포함되어 있습니다. 우리는 덕트 가지의 끝에서 벽과 같은 구조를 봅니다. 이들은 용액으로 채워지고 넘치지 않는 말단 끝 버드입니다.
맨 아래 줄에는 덕트 나무에서 용액이 빠져 나가는 것을 나타내는 덜 정의 된 덕트 끝이 있습니다. 이것은 조직 검사에서보다 제한된 부수적 손상과 함께. 에틸 셀룰로오스를 함유 한 용액이 덕트 트리에 더 잘 머무름 함을 나타내는 것으로 보입니다.
이 방법은 예방적 유방 절제술을 위한 대안을 제공하기 위해 덜 침습적인 유방암 예방 방법의 확장성을 향한 단계를 제공합니다. 더 큰 설치류 모델에서 성공적인 상피 절제는 동물에 대한 최소한의 부작용으로 입증되었습니다. 절제 용액에 에틸 셀룰로오스를 첨가하면 주사 부위에 용액을 더 잘 유지할 수있어 부수적 인 손상이 줄어 듭니다.
임상적으로 입증된 솔루션을 새롭게 사용하고 일반적인 이미징 방식으로 전달 성공을 시각화하는 기능이 추가되어 임상으로 즉시 번역할 수 있습니다.
