TGF-β 가족 구성원에 대한 연구는 암 유전체학 센터 네덜란드에서 지원됩니다. 시지아 리우와 장 르네는 라이덴 대학에서 공부 4 년 동안 중국 장학위원회에 의해 지원됩니다. 우리는 MCF10A 세포 라인 박사 프레드 밀러 (바바라 앤 Karmanos 암 연구소, 디트로이트, MI, USA)을 감사드립니다.

유전자 변형 형광 제브라 피쉬의 Tg (FLI : EGFP)를 사용하여 모든 연구 녹색 형광 단백질을 강화했다 변형을, (EGFP)의 국제 지침에 따라 수행하고, 주택 및 실험을 포함하여, 혈관 (20) - 표지 및 지역 기관위원회에 의해 승인되었다 라이덴 대학 의료 센터의 동물 복지 (Dier Ethische Commissie (DEC)합니다. 주 : 배아 컬렉션 (도 1A), 미세 주입 (도 1b), 선별 (도 1C), 및 분석 (도 1D)도 1에 요약 된 바와 같이, 프로토콜은 크게 다음 4 단계로 세분화된다. 1. 주사 바늘을 준비 <ol><li> 붕규산 유리 마이크로 캐 필러 리와 주사 바늘을 준비한다. 다음 설정을 마이크로 피펫 풀러 장치에 마이크로 모세관 입력 : 기압, 500; 열 (650); 100 당겨; 속도, 200; 시각,그들이 주입에 사용 될 때까지 40 바늘 홀더 플레이트에 주사 바늘을 유지합니다. </li></ol> 2. 주입을위한 형광, 유전자 레이블이 유방암 세포를 준비 <ol><li> L 글루타민, 10 % 소 태아 혈청 및 1을 포함하는 DMEM - 고 글루코스 배지에서 37 ° C에서 배양 인간 유방암 MDA-MB-231 세포 100 페니실린 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균). </li><li> 배양 5 % 말 혈청, 20 ng / ml의 상피 세포 성장 인자, 10 ㎎ / ㎖와 L- 글루타민을 함유하는 DMEM / F12 배지에서 37 ° C에서 유방 상피 세포주 MCF10A (M1) 및 MCF10A-RAS (M2), 인슐린 100 NG / ㎖ 콜레라 독소, 0.5 ㎎ / ㎖의 하이드로 코르티손, 1 : 100 펜 연쇄상. </li><li> 공동 형질 HEK293T 세포로 PLV-mCherry,을 pCMV-VSVG 21 pMDLg-RRE (개그 / 폴) (22), 및 REV pRSV-22 플라스미드로 mCherry의 렌티 바이러스를 생산한다. 수확 된 세포 상등액 -80 ° C에서 형질 저장 후 48 시간. </li><li> 나는5 NG / ㎖의 폴리 브렌의 존재하에 정상 배지로 1 : nfect 렌티 바이러스 상등액 24 시간 동안 30 % 합류에 MDA-MB-231, M1, M2 및 셀 (1) 희석 하였다. </li><li> mCherry 안정 발현 세포주를 취득 할 때까지 격리 세포 클론의 생장을 허용하는 96 웰 플레이트에 세포를 희석하여 단일 세포 클론을 선택한다. </li><li> 주입을위한 세포 배양 한 T75 플라스크. 0.5 % 트립신 EDTA 처리와 80 % 합류에 세포를 수확. 1X PBS 2-3 시간으로 세포를 씻으십시오. </li><li> PBS의 약 200 μL의 세포를 다시 일시 중지합니다. 분사 이전보다 5 시간 동안 그들 4 ° C에서 보관. </li></ol> 3. 주입을위한 Zebrafish의 배아를 준비 <ol><li> 제브라 피쉬의 번식 쌍을 설정하고 로젠 등으로 이전 조브 기사에서와 같이 배아를 수집합니다. (23). </li><li> 미 수정 및 비정상적인 배아를 제거하여 0-4 HPF에있는 배아를 선택합니다. 페트리 창피에서 배아를 유지계란 물 (60 ㎍ / mL의 바다 염 ~ 60 개 배아 / 접시)의 전체 시간 및 28 ° C에서 품어. </li><li> 48 HPF에서 미세 핀셋으로 배아를 Dechorionate. </li><li> 40 ㎍ / ㎖의에 tricaine (3- 아미노 벤조산) 약 2 분간 주입하기 전에, 그러나 더 이상 주입 2 시간 전에보다 달걀 물을 함유로 전송하여 배아 마취. 참고 Tricaine 원액 (4 ㎎ / ㎖, 100X) 7.4 pH를 가진 이중 증류수 97.9 ㎖의 1 M 트리스 -베이스 (PH 9) 2.1 mL에 tricaine 분말 400mg을 같이 제조된다. -20 ° C 냉장고에 보관. </li></ol> 난황 주위 공간에 4를 주입 인간 유방암 세포 <ol><li> 주사 바늘로 세포 현탁액 15 μL로드. 미세 조작기에 니들 마운트 5-10 ㎛의 선단 개구 직경을 얻기 위해 미세 핀셋 바늘 끝을 끊는. </li><li> 마이크로 인젝션을 수행하기 위해 공기 picopump과 조작을 사용합니다. Adju세인트는 picopump 400 셀마다 주사한다. 주입 전에, 1 % 아가로 오스를 함유하는 페트리 접시 위에 세포를 주입하여 직접 세포 수를 계산. </li><li> 10 개 배아마다 주위 라인업 마취 배아 평평하고 1 % 아가로 분사 플레이트 (2-3 일 후 수정 (DPF)). </li><li> 바늘 (즉, 대각선 방향) 삽입하기위한 바람직한 위치에서 배아를 배치 주사 중에 손으로 분사 판의 방향. </li><li> 주사 부위에 바늘 끝 포인트 부드럽게 난황 및 지브라 피쉬 배아 (도 2a)의 주피 사이 난황 주위 공간에 바늘 끝을 삽입한다. </li><li> 약 400 mCherry 표지 종양 세포를 주입한다. 난황은 난황에 주입을 방지하기 위해 파열되지 않았는지 확인합니다. </li></ol> 5. 문서로 인간 유방암 세포를 주입 <ol><li> 난 바와 같이 주사 바늘 및 지브라 피쉬 배아 준비<html> 해당 프로토콜은 1, 2, 3 단계. </li><li> 다큐먼트는 배아의 등쪽에서 접근 할 수 있도록 45 ° 각도로 바늘을 사용한다. </li><li> 다큐먼트 (도 3A)를 기점으로 바늘 단지 덕트 난황 위에 확대 개시 위치로 지느러미, 약 400 세포를 주입 삽입; 덕트 내의 볼륨 펄스 난황 직후 팽창하면 주사가 정확하다. 참고 : 여러 연속 주사는 바늘을 추출하지 않고 수행 할 수 있습니다. </li><li> 계란 물에 주입 된 제브라 피쉬 배아를 전송합니다. 참고로 상당한 차이 개별 피쉬 배아간에 존재하고, 주입 후 배아 발생의 죽음으로 (약 100) 지브라 피쉬의 수정란 비교적 다수의 암 세포를 주사한다. </li><li> 어류 및 포유류 세포에 대한 최적의 온도 조건을 수용하기 위해 33 ° C에서 피쉬 배아를 유지한다. </li></ol>_title &quot;&gt; 6. 주입 된 배아를 화면 <ol><li> 난황 주위 공간에 주입 2 시간 후 분사 (HPI) (도 2)에서, 형광 실체 현미경을 이용하여 각 물고기 화면 또는 문서 주입 (도 2)에 대한 2-24 HPI에서 배아 모두가 주입되도록 종양 세포의 유사 수. 이러한 파열 (도 2b) 또는 난황 주사 (도 3b)과 같은 주입의 오차와 배아를 제거하고, 주입 된 다음 셀 (도 2C 및도 3b), 또는 상기 (도 2D 및 3B)와 임계 값 배아를 골라. 문화에 약 400 셀 만 배아를 유지합니다. </li><li> 세포가 이미 순환 세포와 배아를 제거하여 주입 과정에서 순환에 직접 도입 가능성을 배제. 또한, 문서에 대한 질량 가까운 셀 (도 2D 어떠한 배아를 제거 </strong&gt;). </li></ol> 7. 이미지와 전이성 프로세스 분석 <ol><li> 다양한 팁 파스퇴르 피펫으로 여러 마취 배아를 수집하고 폴리스티렌 접시의 유리 바닥에 전송할 수 있습니다. </li><li> 여분의 물을 제거하고 계란 물을 제한된 양을 유지합니다. 모발 루프 도구 위치로 배를 조작하고, 유리의 위에 커버를 배치했다. </li><li> 물에 침수 또는 장거리 건조 목표와 함께 거꾸로 공 초점 현미경을 사용합니다. 관심 영역은 가능한 한 목표에 가깝게되도록 배아를 놓습니다. </li><li> 때문에 액체 증발로 죽음의 위험을 줄이기 위해 마취 후 즉시 이미징을 수행합니다. <ol><li> 배아의 동일 위치 EGFP 표지 혈관계 및 mCherry 표지 된 종양 세포에서 캡처 신호 공동 레지스터 개의 영상 채널을 병합하여 혈관과 세포를 주사한다. </li><li> 각 지브라 피쉬 배아를 들어, 이미지의 두 개의 다른 세트를 수집머리 부분과 꼬리 지역. </li></ol></li><li> 전파 세포의 수를 정량화. <ol><li> 난황 주위 공간 주사제, 머리와 꼬리 영역 (4), (15) 내의 어류 배아 체를 향해 균체로부터 전파 한 각 물고기 세포의 수를 계산; 영역은 부레의 등쪽의 위에, 정면 중심 공동의 경계를 넘어, 그리고 비뇨 방구 미부. </li><li> 다큐먼트 충전 용 개별 순환 (MDA-MB-231)에서 tailfin의 콜라겐 섬유가 침입 한 세포 또는 꼬리 조혈 조직 (CHT)의 셀 집합 적 (M2)에 의해 형성된 클러스터의 개수 수를 카운트 각 19 제브라 피쉬. </li></ol></li><li> 공 초점 현미경을 사용하여 더 자세히 침략과 전이를 공부 (추천). <ol><li> 이미지 전체에 낮은 배율 (4X 목표)를 사용하여본체는 종양 세포의 확산 패턴의 개요를 얻고. 참고 : 높은 배율 (20 배와 40 개 배 목표는) 수술 중 사망시에 종양 혈관 신생 및 배아 본문에 전파 세포의 정확한 현지화를 공부하기에 적합하다. </li><li> 빨간색 형광 표시 이식 종양 세포를 스캔 제브라 피쉬 배아 혈관과 543 nm의 레이저를 스캔하기 위해 488 nm의 레이저를 사용합니다. 8-10 단계에서 각 배아를 스캔하여 높은 품질의 이미지를 얻습니다. 스캔 및 각 단계를 여섯 번 평균. </li></ol></li><li> 이 추가 실험에 필요한 경우 조심스럽게 달걀 물에 다시 배아를 놓습니다. </li></ol> 8. 사후 분석으로 이어 분산 (ANOVA)의 분석을 사용하여 통계 분석을 수행

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저자가 공개하는 게 없다.

난황 주위 공간과 문서와 주사 피쉬 배아 : 여기서는의 Tg (EGFP fli1) 유방암 세포의 침입 문제를 조사하기 위해 두 가지 방법을 설명했다. 형질 전환 지브라 피쉬 배아에 화학 염료 또는 형광 단백질 표지 암세포를 주입하여, 침윤 및 전이의 동적 및 공간 특성이 명확하게 형광 현미경 하에서 단일 셀 또는 클러스터 레벨에서 실시간으로 추적 될 수있다. 대부분의 경우, 제브라 피쉬의 ?...

병원에서 명백한 암 전이는 &quot;전이성 폭포&quot;로 알려진 복잡하고 여러 단계의 일련의 사건을 포함한다. 캐스케이드는 광범위하게 검토하고 연속적인 단계로 해부 할 수 있습니다 : 지역 침공, intravasation, 보급, 체포, 넘쳐, 그리고 식민 1, 2. 암 전이의 기전 및 생체 내에서 잠재적 인 치료 전략의 개발의 더 나은 이해는 암 세포 확산의 강력한 호스트 모델을 필요로한다. 설치류 모델은 잘 확립되어 널리 전이 3을 평가하는 데 사용되지만, 이러한 접근 방식은 낮은 효율성과 윤리적 한계를 가지고 특정 조작이 전이성 표현형에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하기 위해 최전선 모델로 비용이 많이 든다. 다른 효율, 신뢰성, 저가의 모델은 신속하게 (에피) 유전 적 변화 나 pharmacolog의 잠재적 영향에 액세스하는 데 필요한iCal의 화합물. 때문에 높은 유전 적 인간 상동과 배아의 제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio))의 투명성에 중요한 척추 모델로 등장하고 점점 발달 과정, 미생물 - 호스트 상호 작용, 인간의 질병, 약물 검사 등의 연구에 적용되고 . 사. 제브라 피쉬 년에 설립 된 암 전이 모델은 설치류 모델 5, 6의 단점에 대한 답변을 제공 할 수 있습니다. 자연 종양이 거의 야생 제브라 피쉬 7에서 본 적이 있지만, 제브라 피쉬에서 원하는 암을 유발하는 여러 가지의 오랜 기술이있다. 발암 성 물질에 의한 유전자 돌연변이 또는 신호 전달 경로의 활성화는 조직 학적 및 분자 모델 발암, 제브라 피쉬 7, 8, 9, 인간의 질병을 모방 할 수 있습니다. 탁으로암 유전자 또는 종양 억제 유전자 조작을 앞으로 다양한 활용을 보내고 및 역방향 (유전자 변형) 제브라 피쉬는 암의 형성과 유지 보수 (6), (10)의 잠재적 인 연구를 활성화. 제브라 피쉬 유도 암 모델 소화, 생식, 혈액, 신경계, 6 상피 세포를 포함하는 광범위한 스펙트럼을 커버한다. 암 연구에 제브라 피쉬의 사용으로 인해이 유기체 인간 종양 세포의 이종 이식 모델의 설립에 최근에 확장했다. 이 작업은 처음 성공적으로 2005 (11)의 포배 단계에서 제브라 피쉬 배아에 접목 된 인간의 전이성 흑색 종 세포로보고되었다. 여러 독립적 인 실험실은 다양한 사이트 및 발달 단계에서 제브라 피쉬으로 포유 동물의 암 세포 라인의 다양한 범위를 도입하여이 선구적인 작업의 타당성을 검증 한 5 &lt;/ SUP&gt;. 예를 들어, 상기 blastodisc 포배 단계의 배반포 근처 주사; 5 일 된 배아 난황낭, 난황 주위 공간 퀴비에 (독)의 덕트, 6-H-의 후방 기수 정맥 주사; 30 일된 면역 애벌레의 복강에 주사 12 5 수행되었다. 또한, 동종 종양 이식은 제브라 피쉬 (12), (13)에보고되었다. 이종 이식을 사용의 가장 큰 장점 중 하나는 접목 암 세포가 쉽게 형광 표지와 정상 세포를 구별 할 수 있다는 것입니다. 따라서, 14 microtumor 형성 세포 침윤 및 전이 15, 16, 17, 종양 - 유도 된 혈관 형성 (15), (1)의 동적 거동에 조사8, 암 세포와 호스트 사이의 상호 작용은 형질 전환 제브라 피쉬 라인 5를 적용 특히, 17 분명히 활어 몸으로 시각화 할 수 있습니다 요인. 문서 주사 (16)을 통해 제브라 피쉬 배아 : 전이를 평가하기 위해 제브라 피쉬 이종 이식 모델의 높은 잠재력에 의해 영감을, 우리의 Tg (EGFP FLI)의 tailfin 영역에 다른 유방암 세포 라인의 transvascular 혈관 외 유출 특성을 보여 주었다. 성장 인자 β (TGF-β) (16)과 뼈 형태 형성 단백질 변형의 역할은 (BMP)을 / 프로 안티 - 유방암 세포 침윤과 전이 19 신호 전달 경로도이 모델에서 조사 하였다. 또한, 우리는 또한 난황 주위 공간 주사와 이종 이식 제브라 피쉬 모델을 사용하여 혈액 순환에 다양한 유방암 세포주의 intravasation 능력을 효과적으로 요약. <p claSS = &quot;jove_content는&quot;&gt;이 문서에서는 난황 주위 공간 또는 문서에 인간의 유방암 세포의 주입에 따라 제브라 피쉬의 이종 이식 모델에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 고해상도 형광 이미징을 사용하여, 우리는 혈관에 intravasation와 무 혈관 tailfin 영역으로 혈관에서 이동 다른 인간의 유방암 세포의 침략 행위를 대표하는 과정을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>AGAF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>300038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera enterotoxin&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>227035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5 STED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose media containing L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 media containing L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21041025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>01-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>227035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>I-6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A (M1) cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10Aras (M2) cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F276456I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSVG plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLV-mCherry plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 4 software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-REV plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fli:EGFP) zebrafish strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base&#160;</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>11814273001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (3-aminobenzoic acid)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (60 &#215; 15 mm)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene dish with glass bottom</td>
			<td>WillCo</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish

대부분의 경우, 암 환자는 오히려 때문에 전이, 차 종양으로 사망하지 않습니다. 수많은 설치류 모델은 생체 내에서 암 전이를 공부 할 수 있지만, 다른 효율, 신뢰성, 저가의 모델은 신속하게 (에피) 유전 변경 또는 약리 화합물의 잠재적 인 효과에 액세스하는 데 필요합니다. 따라서, 우리는 설명하고이 목표를 지원하기 위해 제브라 피쉬 배아에 주입 인간의 유방암 세포를 이용한 이종 이식 모델의 타당성을 설명합니다. 현미경, 형광 단백질 또는 화학적 표지 된 인간 유방암 세포를 형질 전환 지브라 피쉬 수정란에 이식되고, Tg는 (FLI : EGFP), 48 시간 수정 후의 난황 주위 공간 또는 퀴비에 (독)의 덕트로. 그 직후, 살아있는 물고기의 몸에 암 세포 침공, 보급 및 전이의 시간적 공간적 과정은 형광 현미경으로 시각화됩니다. 즉, 서로 다른 주사 부위를 사용하여 모델, 당ivitelline 공간 또는 문서는 초기 (intravasation 공정) 및 후기 이벤트 전이성 다단계 캐스케이드 (넘쳐 공정)을 반영하여 서로 상호 보완 적이다. 또한 peritumoral 및 종양 혈관 신생 난황 주위 공간으로 주입하여 관찰 할 수있다. 전체 실험 기간은 더 이상 팔일 이상 없습니다. 이 두 모델은 유전 및 약리 조작에 대한 응답으로 암 전이의 신속한 평가를 가능하게 셀 라벨, 마이크로 이식, 형광 이미징 기술을 결합한다.

난황 주위 공간 분사 배아 제브라 이종 이식 모델에서, 물고기 체내 표지 암세포의 혈행 보급 활성 이동으로 간주된다. 이 과정은 상기 검출 방법에서 설명한 바와 같이 형광 현미경으로 정량화 할 수있다. 이러한 이종 이식 모델을 설명하기 위해 전위 (없거나) 공지의 침입 / 전이가 HRAS 변태 암성 관내 및 양성 정상적인 유방 상피 M1 세포를 비롯한 생체 내 마...

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Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

여기, 우리는 침략 행위를 조사하고 각각 인간의 유방암 세포의 intravasation 및 혈관 외 유출 가능성을 평가하기 위해, 두 개의 서로 다른 주사 부위, 즉, 난황 주위 공간과 퀴비에의 덕트를 사용하여 이종 이식 제브라 피쉬 모델을 설명합니다.

배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

invasive-behavior-of-human-breast-cancer-cells-in-embryonic-zebrafish

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.5K 조회수.  Leiden University Medical Center.  여기, 우리는 침략 행위를 조사하고 각각 인간의 유방암 세포의 intravasation 및 혈관 외 유출 가능성을 평가하기 위해, 두 개의 서로 다른 주사 부위, 즉, 난황 주위 공간과 퀴비에의 덕트를 사용하여 이종 이식 제브라 피쉬 모델을 설명합니다. 

비디오: Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

연구

암 연구학

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

유방암 관련 림프 부종의 초음파 평가

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트<em&gt; 다니오 레 리오</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal models are required for bridging the nanotechnology to its biomedical application. The mouse represents the traditional animal model for preclinical testing; however, mice are relatively expensive to keep and have long experimental cycles due to the limited progeny from each mother. The zebrafish has emerged as a powerful model system for developmental and biomedical research, including cancer research. In particular, due to its optical transparency and rapid development, zebrafish embryos are well suited for real-time in vivo monitoring of the behavior of cancer cells and their interactions with their microenvironment. This method was developed to sequentially introduce human cancer cells and functionalized nanoparticles in transparent Casper zebrafish embryos and monitor in vivo recognition and targeting of the cancer cells by nanoparticles in real time. This optimized protocol shows that fluorescently labeled nanoparticles, which are functionalized with folate groups, can specifically recognize and target metastatic human cervical epithelial cancer cells labeled with a different fluorochrome. The recognition and targeting process can occur as early as 30 min postinjection of the nanoparticles tested. The whole experiment only requires the breeding of a few pairs of adult fish and takes less than 4 days to complete. Moreover, zebrafish embryos lack a functional adaptive immune system, allowing the engraftment of a wide range of human cancer cells. Hence, the utility of the protocol described here enables the testing of nanoparticles on various types of human cancer cells, facilitating the selection of optimal nanoparticles in each specific cancer context for future testing in mammals and the clinic.

Described here is a method for utilizing zebrafish embryos to study the ability of functionalized nanoparticles to target human cancer cells in vivo. This method allows for the evaluation and selection of optimal nanoparticles for future testing in large animals and in clinical trials.

제브라피시에 기능성 형광 실리카 나노입자를 가진 제노이식 인간 암세포의 생체 내 표적화

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...