Name: invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish
Uploaded: 2017-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

TGF-β 가족 구성원에 대한 연구는 암 유전체학 센터 네덜란드에서 지원됩니다. 시지아 리우와 장 르네는 라이덴 대학에서 공부 4 년 동안 중국 장학위원회에 의해 지원됩니다. 우리는 MCF10A 세포 라인 박사 프레드 밀러 (바바라 앤 Karmanos 암 연구소, 디트로이트, MI, USA)을 감사드립니다.

유전자 변형 형광 제브라 피쉬의 Tg (FLI : EGFP)를 사용하여 모든 연구 녹색 형광 단백질을 강화했다 변형을, (EGFP)의 국제 지침에 따라 수행하고, 주택 및 실험을 포함하여, 혈관 (20) - 표지 및 지역 기관위원회에 의해 승인되었다 라이덴 대학 의료 센터의 동물 복지 (Dier Ethische Commissie (DEC)합니다. 주 : 배아 컬렉션 (도 1A), 미세 주입 (도 1b), 선별 (도 1C), 및 분석 (도 1D)도 1에 요약 된 바와 같이, 프로토콜은 크게 다음 4 단계로 세분화된다. 1. 주사 바늘을 준비 <ol><li> 붕규산 유리 마이크로 캐 필러 리와 주사 바늘을 준비한다. 다음 설정을 마이크로 피펫 풀러 장치에 마이크로 모세관 입력 : 기압, 500; 열 (650); 100 당겨; 속도, 200; 시각,그들이 주입에 사용 될 때까지 40 바늘 홀더 플레이트에 주사 바늘을 유지합니다. </li></ol> 2. 주입을위한 형광, 유전자 레이블이 유방암 세포를 준비 <ol><li> L 글루타민, 10 % 소 태아 혈청 및 1을 포함하는 DMEM - 고 글루코스 배지에서 37 ° C에서 배양 인간 유방암 MDA-MB-231 세포 100 페니실린 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균). </li><li> 배양 5 % 말 혈청, 20 ng / ml의 상피 세포 성장 인자, 10 ㎎ / ㎖와 L- 글루타민을 함유하는 DMEM / F12 배지에서 37 ° C에서 유방 상피 세포주 MCF10A (M1) 및 MCF10A-RAS (M2), 인슐린 100 NG / ㎖ 콜레라 독소, 0.5 ㎎ / ㎖의 하이드로 코르티손, 1 : 100 펜 연쇄상. </li><li> 공동 형질 HEK293T 세포로 PLV-mCherry,을 pCMV-VSVG 21 pMDLg-RRE (개그 / 폴) (22), 및 REV pRSV-22 플라스미드로 mCherry의 렌티 바이러스를 생산한다. 수확 된 세포 상등액 -80 ° C에서 형질 저장 후 48 시간. </li><li> 나는5 NG / ㎖의 폴리 브렌의 존재하에 정상 배지로 1 : nfect 렌티 바이러스 상등액 24 시간 동안 30 % 합류에 MDA-MB-231, M1, M2 및 셀 (1) 희석 하였다. </li><li> mCherry 안정 발현 세포주를 취득 할 때까지 격리 세포 클론의 생장을 허용하는 96 웰 플레이트에 세포를 희석하여 단일 세포 클론을 선택한다. </li><li> 주입을위한 세포 배양 한 T75 플라스크. 0.5 % 트립신 EDTA 처리와 80 % 합류에 세포를 수확. 1X PBS 2-3 시간으로 세포를 씻으십시오. </li><li> PBS의 약 200 μL의 세포를 다시 일시 중지합니다. 분사 이전보다 5 시간 동안 그들 4 ° C에서 보관. </li></ol> 3. 주입을위한 Zebrafish의 배아를 준비 <ol><li> 제브라 피쉬의 번식 쌍을 설정하고 로젠 등으로 이전 조브 기사에서와 같이 배아를 수집합니다. (23). </li><li> 미 수정 및 비정상적인 배아를 제거하여 0-4 HPF에있는 배아를 선택합니다. 페트리 창피에서 배아를 유지계란 물 (60 ㎍ / mL의 바다 염 ~ 60 개 배아 / 접시)의 전체 시간 및 28 ° C에서 품어. </li><li> 48 HPF에서 미세 핀셋으로 배아를 Dechorionate. </li><li> 40 ㎍ / ㎖의에 tricaine (3- 아미노 벤조산) 약 2 분간 주입하기 전에, 그러나 더 이상 주입 2 시간 전에보다 달걀 물을 함유로 전송하여 배아 마취. 참고 Tricaine 원액 (4 ㎎ / ㎖, 100X) 7.4 pH를 가진 이중 증류수 97.9 ㎖의 1 M 트리스 -베이스 (PH 9) 2.1 mL에 tricaine 분말 400mg을 같이 제조된다. -20 ° C 냉장고에 보관. </li></ol> 난황 주위 공간에 4를 주입 인간 유방암 세포 <ol><li> 주사 바늘로 세포 현탁액 15 μL로드. 미세 조작기에 니들 마운트 5-10 ㎛의 선단 개구 직경을 얻기 위해 미세 핀셋 바늘 끝을 끊는. </li><li> 마이크로 인젝션을 수행하기 위해 공기 picopump과 조작을 사용합니다. Adju세인트는 picopump 400 셀마다 주사한다. 주입 전에, 1 % 아가로 오스를 함유하는 페트리 접시 위에 세포를 주입하여 직접 세포 수를 계산. </li><li> 10 개 배아마다 주위 라인업 마취 배아 평평하고 1 % 아가로 분사 플레이트 (2-3 일 후 수정 (DPF)). </li><li> 바늘 (즉, 대각선 방향) 삽입하기위한 바람직한 위치에서 배아를 배치 주사 중에 손으로 분사 판의 방향. </li><li> 주사 부위에 바늘 끝 포인트 부드럽게 난황 및 지브라 피쉬 배아 (도 2a)의 주피 사이 난황 주위 공간에 바늘 끝을 삽입한다. </li><li> 약 400 mCherry 표지 종양 세포를 주입한다. 난황은 난황에 주입을 방지하기 위해 파열되지 않았는지 확인합니다. </li></ol> 5. 문서로 인간 유방암 세포를 주입 <ol><li> 난 바와 같이 주사 바늘 및 지브라 피쉬 배아 준비<html> 해당 프로토콜은 1, 2, 3 단계. </li><li> 다큐먼트는 배아의 등쪽에서 접근 할 수 있도록 45 ° 각도로 바늘을 사용한다. </li><li> 다큐먼트 (도 3A)를 기점으로 바늘 단지 덕트 난황 위에 확대 개시 위치로 지느러미, 약 400 세포를 주입 삽입; 덕트 내의 볼륨 펄스 난황 직후 팽창하면 주사가 정확하다. 참고 : 여러 연속 주사는 바늘을 추출하지 않고 수행 할 수 있습니다. </li><li> 계란 물에 주입 된 제브라 피쉬 배아를 전송합니다. 참고로 상당한 차이 개별 피쉬 배아간에 존재하고, 주입 후 배아 발생의 죽음으로 (약 100) 지브라 피쉬의 수정란 비교적 다수의 암 세포를 주사한다. </li><li> 어류 및 포유류 세포에 대한 최적의 온도 조건을 수용하기 위해 33 ° C에서 피쉬 배아를 유지한다. </li></ol>_title &quot;&gt; 6. 주입 된 배아를 화면 <ol><li> 난황 주위 공간에 주입 2 시간 후 분사 (HPI) (도 2)에서, 형광 실체 현미경을 이용하여 각 물고기 화면 또는 문서 주입 (도 2)에 대한 2-24 HPI에서 배아 모두가 주입되도록 종양 세포의 유사 수. 이러한 파열 (도 2b) 또는 난황 주사 (도 3b)과 같은 주입의 오차와 배아를 제거하고, 주입 된 다음 셀 (도 2C 및도 3b), 또는 상기 (도 2D 및 3B)와 임계 값 배아를 골라. 문화에 약 400 셀 만 배아를 유지합니다. </li><li> 세포가 이미 순환 세포와 배아를 제거하여 주입 과정에서 순환에 직접 도입 가능성을 배제. 또한, 문서에 대한 질량 가까운 셀 (도 2D 어떠한 배아를 제거 </strong&gt;). </li></ol> 7. 이미지와 전이성 프로세스 분석 <ol><li> 다양한 팁 파스퇴르 피펫으로 여러 마취 배아를 수집하고 폴리스티렌 접시의 유리 바닥에 전송할 수 있습니다. </li><li> 여분의 물을 제거하고 계란 물을 제한된 양을 유지합니다. 모발 루프 도구 위치로 배를 조작하고, 유리의 위에 커버를 배치했다. </li><li> 물에 침수 또는 장거리 건조 목표와 함께 거꾸로 공 초점 현미경을 사용합니다. 관심 영역은 가능한 한 목표에 가깝게되도록 배아를 놓습니다. </li><li> 때문에 액체 증발로 죽음의 위험을 줄이기 위해 마취 후 즉시 이미징을 수행합니다. <ol><li> 배아의 동일 위치 EGFP 표지 혈관계 및 mCherry 표지 된 종양 세포에서 캡처 신호 공동 레지스터 개의 영상 채널을 병합하여 혈관과 세포를 주사한다. </li><li> 각 지브라 피쉬 배아를 들어, 이미지의 두 개의 다른 세트를 수집머리 부분과 꼬리 지역. </li></ol></li><li> 전파 세포의 수를 정량화. <ol><li> 난황 주위 공간 주사제, 머리와 꼬리 영역 (4), (15) 내의 어류 배아 체를 향해 균체로부터 전파 한 각 물고기 세포의 수를 계산; 영역은 부레의 등쪽의 위에, 정면 중심 공동의 경계를 넘어, 그리고 비뇨 방구 미부. </li><li> 다큐먼트 충전 용 개별 순환 (MDA-MB-231)에서 tailfin의 콜라겐 섬유가 침입 한 세포 또는 꼬리 조혈 조직 (CHT)의 셀 집합 적 (M2)에 의해 형성된 클러스터의 개수 수를 카운트 각 19 제브라 피쉬. </li></ol></li><li> 공 초점 현미경을 사용하여 더 자세히 침략과 전이를 공부 (추천). <ol><li> 이미지 전체에 낮은 배율 (4X 목표)를 사용하여본체는 종양 세포의 확산 패턴의 개요를 얻고. 참고 : 높은 배율 (20 배와 40 개 배 목표는) 수술 중 사망시에 종양 혈관 신생 및 배아 본문에 전파 세포의 정확한 현지화를 공부하기에 적합하다. </li><li> 빨간색 형광 표시 이식 종양 세포를 스캔 제브라 피쉬 배아 혈관과 543 nm의 레이저를 스캔하기 위해 488 nm의 레이저를 사용합니다. 8-10 단계에서 각 배아를 스캔하여 높은 품질의 이미지를 얻습니다. 스캔 및 각 단계를 여섯 번 평균. </li></ol></li><li> 이 추가 실험에 필요한 경우 조심스럽게 달걀 물에 다시 배아를 놓습니다. </li></ol> 8. 사후 분석으로 이어 분산 (ANOVA)의 분석을 사용하여 통계 분석을 수행

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저자가 공개하는 게 없다.

난황 주위 공간과 문서와 주사 피쉬 배아 : 여기서는의 Tg (EGFP fli1) 유방암 세포의 침입 문제를 조사하기 위해 두 가지 방법을 설명했다. 형질 전환 지브라 피쉬 배아에 화학 염료 또는 형광 단백질 표지 암세포를 주입하여, 침윤 및 전이의 동적 및 공간 특성이 명확하게 형광 현미경 하에서 단일 셀 또는 클러스터 레벨에서 실시간으로 추적 될 수있다. 대부분의 경우, 제브라 피쉬의 ?...

병원에서 명백한 암 전이는 &quot;전이성 폭포&quot;로 알려진 복잡하고 여러 단계의 일련의 사건을 포함한다. 캐스케이드는 광범위하게 검토하고 연속적인 단계로 해부 할 수 있습니다 : 지역 침공, intravasation, 보급, 체포, 넘쳐, 그리고 식민 1, 2. 암 전이의 기전 및 생체 내에서 잠재적 인 치료 전략의 개발의 더 나은 이해는 암 세포 확산의 강력한 호스트 모델을 필요로한다. 설치류 모델은 잘 확립되어 널리 전이 3을 평가하는 데 사용되지만, 이러한 접근 방식은 낮은 효율성과 윤리적 한계를 가지고 특정 조작이 전이성 표현형에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하기 위해 최전선 모델로 비용이 많이 든다. 다른 효율, 신뢰성, 저가의 모델은 신속하게 (에피) 유전 적 변화 나 pharmacolog의 잠재적 영향에 액세스하는 데 필요한iCal의 화합물. 때문에 높은 유전 적 인간 상동과 배아의 제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio))의 투명성에 중요한 척추 모델로 등장하고 점점 발달 과정, 미생물 - 호스트 상호 작용, 인간의 질병, 약물 검사 등의 연구에 적용되고 . 사. 제브라 피쉬 년에 설립 된 암 전이 모델은 설치류 모델 5, 6의 단점에 대한 답변을 제공 할 수 있습니다. 자연 종양이 거의 야생 제브라 피쉬 7에서 본 적이 있지만, 제브라 피쉬에서 원하는 암을 유발하는 여러 가지의 오랜 기술이있다. 발암 성 물질에 의한 유전자 돌연변이 또는 신호 전달 경로의 활성화는 조직 학적 및 분자 모델 발암, 제브라 피쉬 7, 8, 9, 인간의 질병을 모방 할 수 있습니다. 탁으로암 유전자 또는 종양 억제 유전자 조작을 앞으로 다양한 활용을 보내고 및 역방향 (유전자 변형) 제브라 피쉬는 암의 형성과 유지 보수 (6), (10)의 잠재적 인 연구를 활성화. 제브라 피쉬 유도 암 모델 소화, 생식, 혈액, 신경계, 6 상피 세포를 포함하는 광범위한 스펙트럼을 커버한다. 암 연구에 제브라 피쉬의 사용으로 인해이 유기체 인간 종양 세포의 이종 이식 모델의 설립에 최근에 확장했다. 이 작업은 처음 성공적으로 2005 (11)의 포배 단계에서 제브라 피쉬 배아에 접목 된 인간의 전이성 흑색 종 세포로보고되었다. 여러 독립적 인 실험실은 다양한 사이트 및 발달 단계에서 제브라 피쉬으로 포유 동물의 암 세포 라인의 다양한 범위를 도입하여이 선구적인 작업의 타당성을 검증 한 5 &lt;/ SUP&gt;. 예를 들어, 상기 blastodisc 포배 단계의 배반포 근처 주사; 5 일 된 배아 난황낭, 난황 주위 공간 퀴비에 (독)의 덕트, 6-H-의 후방 기수 정맥 주사; 30 일된 면역 애벌레의 복강에 주사 12 5 수행되었다. 또한, 동종 종양 이식은 제브라 피쉬 (12), (13)에보고되었다. 이종 이식을 사용의 가장 큰 장점 중 하나는 접목 암 세포가 쉽게 형광 표지와 정상 세포를 구별 할 수 있다는 것입니다. 따라서, 14 microtumor 형성 세포 침윤 및 전이 15, 16, 17, 종양 - 유도 된 혈관 형성 (15), (1)의 동적 거동에 조사8, 암 세포와 호스트 사이의 상호 작용은 형질 전환 제브라 피쉬 라인 5를 적용 특히, 17 분명히 활어 몸으로 시각화 할 수 있습니다 요인. 문서 주사 (16)을 통해 제브라 피쉬 배아 : 전이를 평가하기 위해 제브라 피쉬 이종 이식 모델의 높은 잠재력에 의해 영감을, 우리의 Tg (EGFP FLI)의 tailfin 영역에 다른 유방암 세포 라인의 transvascular 혈관 외 유출 특성을 보여 주었다. 성장 인자 β (TGF-β) (16)과 뼈 형태 형성 단백질 변형의 역할은 (BMP)을 / 프로 안티 - 유방암 세포 침윤과 전이 19 신호 전달 경로도이 모델에서 조사 하였다. 또한, 우리는 또한 난황 주위 공간 주사와 이종 이식 제브라 피쉬 모델을 사용하여 혈액 순환에 다양한 유방암 세포주의 intravasation 능력을 효과적으로 요약. <p claSS = &quot;jove_content는&quot;&gt;이 문서에서는 난황 주위 공간 또는 문서에 인간의 유방암 세포의 주입에 따라 제브라 피쉬의 이종 이식 모델에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 고해상도 형광 이미징을 사용하여, 우리는 혈관에 intravasation와 무 혈관 tailfin 영역으로 혈관에서 이동 다른 인간의 유방암 세포의 침략 행위를 대표하는 과정을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>MP Biomedicals</td><td>AGAF0500</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300038</td><td></td></tr><tr><td>Cholera enterotoxin&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>227035</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP5 STED</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose media containing L-glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 media containing L-glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21041025</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Merck Millipore</td><td>01-107</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent stereo microscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>SigmaAldrich</td><td>227035</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>SigmaAldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A (M1) cell line</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MCF10Aras (M2) cell line</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Manual micromanipulator&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>F276456I</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VSVG plasmid</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PLV-mCherry plasmid</td><td>Addgene</td><td>36084</td><td></td></tr><tr><td>pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td></tr><tr><td>Pneumatic picoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>SigmaAldrich</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Prism 4 software</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRSV-REV plasmid</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Tg (&lt;em&gt;fli:EGFP&lt;/em&gt;) zebrafish strain</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>SigmaAldrich</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (3-aminobenzoic acid)</td><td>SigmaAldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes, polystyrene (60 &amp;times; 15 mm)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene dish with glass bottom</td><td>WillCo</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish

대부분의 경우, 암 환자는 오히려 때문에 전이, 차 종양으로 사망하지 않습니다. 수많은 설치류 모델은 생체 내에서 암 전이를 공부 할 수 있지만, 다른 효율, 신뢰성, 저가의 모델은 신속하게 (에피) 유전 변경 또는 약리 화합물의 잠재적 인 효과에 액세스하는 데 필요합니다. 따라서, 우리는 설명하고이 목표를 지원하기 위해 제브라 피쉬 배아에 주입 인간의 유방암 세포를 이용한 이종 이식 모델의 타당성을 설명합니다. 현미경, 형광 단백질 또는 화학적 표지 된 인간 유방암 세포를 형질 전환 지브라 피쉬 수정란에 이식되고, Tg는 (FLI : EGFP), 48 시간 수정 후의 난황 주위 공간 또는 퀴비에 (독)의 덕트로. 그 직후, 살아있는 물고기의 몸에 암 세포 침공, 보급 및 전이의 시간적 공간적 과정은 형광 현미경으로 시각화됩니다. 즉, 서로 다른 주사 부위를 사용하여 모델, 당ivitelline 공간 또는 문서는 초기 (intravasation 공정) 및 후기 이벤트 전이성 다단계 캐스케이드 (넘쳐 공정)을 반영하여 서로 상호 보완 적이다. 또한 peritumoral 및 종양 혈관 신생 난황 주위 공간으로 주입하여 관찰 할 수있다. 전체 실험 기간은 더 이상 팔일 이상 없습니다. 이 두 모델은 유전 및 약리 조작에 대한 응답으로 암 전이의 신속한 평가를 가능하게 셀 라벨, 마이크로 이식, 형광 이미징 기술을 결합한다.

난황 주위 공간 분사 배아 제브라 이종 이식 모델에서, 물고기 체내 표지 암세포의 혈행 보급 활성 이동으로 간주된다. 이 과정은 상기 검출 방법에서 설명한 바와 같이 형광 현미경으로 정량화 할 수있다. 이러한 이종 이식 모델을 설명하기 위해 전위 (없거나) 공지의 침입 / 전이가 HRAS 변태 암성 관내 및 양성 정상적인 유방 상피 M1 세포를 비롯한 생체 내 마...

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Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

여기, 우리는 침략 행위를 조사하고 각각 인간의 유방암 세포의 intravasation 및 혈관 외 유출 가능성을 평가하기 위해, 두 개의 서로 다른 주사 부위, 즉, 난황 주위 공간과 퀴비에의 덕트를 사용하여 이종 이식 제브라 피쉬 모델을 설명합니다.

배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.5K 조회수.  Leiden University Medical Center.  여기, 우리는 침략 행위를 조사하고 각각 인간의 유방암 세포의 intravasation 및 혈관 외 유출 가능성을 평가하기 위해, 두 개의 서로 다른 주사 부위, 즉, 난황 주위 공간과 퀴비에의 덕트를 사용하여 이종 이식 제브라 피쉬 모델을 설명합니다. 

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Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트<em&gt; 다니오 레 리오</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

연구

암 연구학

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

제브라피시 종양 이종이식에서 숙주 혈관조형성 반응의 생체 내 이미징 및 정량화

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal models are required for bridging the nanotechnology to its biomedical application. The mouse represents the traditional animal model for preclinical testing; however, mice are relatively expensive to keep and have long experimental cycles due to the limited progeny from each mother. The zebrafish has emerged as a powerful model system for developmental and biomedical research, including cancer research. In particular, due to its optical transparency and rapid development, zebrafish embryos are well suited for real-time in vivo monitoring of the behavior of cancer cells and their interactions with their microenvironment. This method was developed to sequentially introduce human cancer cells and functionalized nanoparticles in transparent Casper zebrafish embryos and monitor in vivo recognition and targeting of the cancer cells by nanoparticles in real time. This optimized protocol shows that fluorescently labeled nanoparticles, which are functionalized with folate groups, can specifically recognize and target metastatic human cervical epithelial cancer cells labeled with a different fluorochrome. The recognition and targeting process can occur as early as 30 min postinjection of the nanoparticles tested. The whole experiment only requires the breeding of a few pairs of adult fish and takes less than 4 days to complete. Moreover, zebrafish embryos lack a functional adaptive immune system, allowing the engraftment of a wide range of human cancer cells. Hence, the utility of the protocol described here enables the testing of nanoparticles on various types of human cancer cells, facilitating the selection of optimal nanoparticles in each specific cancer context for future testing in mammals and the clinic.

Described here is a method for utilizing zebrafish embryos to study the ability of functionalized nanoparticles to target human cancer cells in vivo. This method allows for the evaluation and selection of optimal nanoparticles for future testing in large animals and in clinical trials.

제브라피시에 기능성 형광 실리카 나노입자를 가진 제노이식 인간 암세포의 생체 내 표적화

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

발생학

효율적인 In Vivo 종양 연구를 위한 유충 제브라피시 활용

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

저자 스포트라이트: 제브라피시에서 종양 이종장기이식을 사용한 암 치료의 발전

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동

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Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

제브라피시 종양 이종이식에서 숙주 혈관조형성 반응의 생체 내 이미징 및 정량화

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

제브라피시에 기능성 형광 실리카 나노입자를 가진 제노이식 인간 암세포의 생체 내 표적화

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법