쥐의 뇌에 있는 약 1억 개의 세포와 테라바이트 규모에 육박하는 전체 뇌 세포 해상도 이미지의 크기로 인해 세포를 정확하게 정량화하려면 고급 이미지 분석 도구가 필요합니다. 당사의 전산 파이프라인은 이미지를 전처리하고 마우스 피질 내의 핵을 정량화하는 동시에 세포 검출 정확도, 이미징 시간 및 계산 리소스 간의 합리적인 절충안을 유지할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생 인 Felix Kyere와 Ian Curtin이 될 것입니다.
시작하려면 UltraMicroscope II 현미경의 정격 작동 거리로 인해 샘플이 z 치수의 깊이가 5.2mm 이하가 되도록 올바른 샘플 크기 홀더에 샘플을 장착하십시오. 그런 다음 홀더의 나사가 크래들의 지지대와 45도 각도가 되도록 홀더를 샘플 크래들에 삽입합니다. 다음으로, 샘플이 광 경로에 수직으로 향하도록 크래들을 배치합니다.
그런 다음 현미경의 줌 바디를 4x 배율 이상으로 설정하여 픽셀당 0.75마이크로미터를 생성합니다. Inspector Pro 소프트웨어에서 개구수 값이 약 0.08인 단일 라이트 시트를 선택합니다. 축 해상도가 이미지 너비를 따라 유지되도록 하려면 수평 동적 초점을 선택하고 레이저 파장에 따라 권장되는 단계 수를 적용합니다.
그런 다음 등록 채널에 대하여 각 채널에 대한 미세 초점을 조정하고 채널 특성에 대하여 채널당 레이저 파워를 조정합니다. 다음으로, 라이트 시트 너비를 약 50%로 조정하여 시트 전력이 샘플 크기에 맞는 y 치수에 최적으로 분배되도록 합니다. 그런 다음 샘플 크기에 따라 타일 수를 타일 간 권장 겹침 15%로 설정하고 지정된 타일 위치에서 각 스택에 대해 각 채널에 대한 이미지를 순차적으로 캡처합니다.
먼저 Linux 및 NuMorph 이미지 처리 도구용 Conda 환경 관리자를 다운로드하여 설치합니다. 명령줄에서 matlab을 실행하고 NM_setup. NuMorph에서 분석에 필요한 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 다운로드하여 설치합니다.
그런 다음 NM_samples.m 파일을 편집하여 샘플 이름, 입력 및 출력 디렉토리, 채널 정보 및 라이트 시트 이미징 파라미터를 지정합니다. 강도 조정의 경우 NMp_template 새 이미지 세트로 작업할 때 강렬한 조정을 true로 설정하고 use_processed_images false로 설정합니다. 다음으로 save_images 및 save_samples true로 설정합니다.
그런 다음 타일 음영을 기본으로 설정하여 기본 알고리즘을 사용하여 음영 보정을 적용하거나 수동으로 설정하여 특정 라이트 시트 너비에서 UltraMicroscope II의 측정값을 사용하여 타일 음영 보정을 적용합니다. 이미지 채널 정렬의 경우 NMp_template에서 channel_alignment true로 설정하고 채널 alignment_method 변환 또는 탄성체로 설정합니다. 그런 다음 sift_refinement true로 설정하고 겹침 값을 0.15로 설정하여 이미징 중 타일 겹침과 일치시킵니다.
MATLAB에서 전처리 단계를 실행하려면 샘플 이름을 지정하고 구성을 샘플 처리NM_config로 설정하십시오. 그런 다음 강도, 정렬 또는 스티치를 사용하여 스테이지를 지정하는 동안 NM_process구성 스티치를 지정하여 전처리 단계를 실행하고 출력 디렉터리에서 각 스테이지의 출력 파일을 확인합니다. 3D Atlas 이미지 및 각 복셀을 특정 구조에 할당하는 관련 주석 이미지로 시작합니다.
Atlas 이미지와 주석 파일을 모두 정렬하여 올바른 방향으로 올바르게 일치하는지 확인합니다. 정렬 후 NuMorph에서 파일을 처리하여 명령을 실행하여 원고에 설명된 대로 입력을 지정합니다. NMa_template에서는 resample_images true로 설정하고 resample_resolution Atlas와 일치하도록 설정합니다.
그런 다음 resample_channels를 사용하여 리샘플링할 채널 번호를 지정합니다. 그런 다음 register_images true로 설정하고 Atlas 디렉터리의 파일과 일치하도록 atlas_file 지정한 다음 기본값으로 registration_parameters 설정합니다. 그런 다음 save_registered_images true로 설정합니다.
핵 검출, 세포 계수 및 분류의 경우 count_nuclei과 classify_cells 모두 true로 설정합니다. 그런 다음 count_method 3dunet으로 설정하고 min_intensity하여 감지된 객체에 대한 최소 강도 임계값을 정의합니다. 다음으로, classify_method 중심 위치에서 비지도 형광 강도를 기반으로 하는 임계값 또는 감독된 선형 서포트 벡터 머신 분류기를 모델링하는 SVM으로 설정합니다.
MATLAB에서 분석 단계를 수행하려면 샘플 이름을 지정하고 구성을 NM_config 분석 샘플로 설정하십시오. 그런 다음 리샘플링, 레지스터, 카운트 또는 분류를 사용하여 단계를 지정하는 동안 NM_analyze구성 단계를 지정하여 분석 단계를 실행하고 출력 디렉터리에서 각 단계의 출력 파일을 확인합니다. NMe_template에서 업데이트를 true로 설정하고 compare_structures_by 인덱스 중 하나로 설정합니다.
그런 다음 셀 계수 및 셀 유형 분류를 지정하는 동안 평가할 가능한 모든 구조 인덱스 및 구조를 지정하는 템플릿 파일 및 구조 테이블을 설정합니다. iDISCO+프로토콜과 뉴런 층 특이적 핵 마커를 사용한 조직 청소는 등피질에서 상층 및 하층 뉴런의 명확하게 정의된 세포 그룹을 생성했습니다. NuMorph를 사용한 세포 계수는 강도 조정, 채널 정렬 및 스티칭과 관련된 성공적인 전처리 단계에 따라 달라졌습니다.
그러나 전처리 단계에서 오류가 발생하면 부적절한 스티칭이 발생하여 정렬 및 스티칭이 잘못되어 초점이 맞지 않고 초점이 맞지 않는 패턴이 이미지가 생성될 수 있습니다. 특정 뇌 영역의 핵을 계산하기 위해 스티칭된 이미지에 Atlas를 사용하여 주석을 달아 뇌 영역에 주석을 겹칠 수 있습니다. 핵의 중심은 약 260만 개의 뇌-2-양성 핵과 160만 개의 CTIP2 양성 핵이 있는 등피질에서 TO-PRO-3 양성인 약 1,200만 개의 총 핵이 있는 NuMorph에서 훈련된 3D U-Net 모델로 감지되었습니다.
기저핵 및 해마 동종 피질에서 각각 약 3.7 및 290 만 개의 TO-PRO-3 양성 총 핵이 검출되었다. 그러나이 두 뇌 영역에서 검출 된 뇌 2 양성 세포는 무시할 수 있었으며 기저핵과 해마 allocortex에서 각각 백만 개 미만의 CTIP2 양성 세포에서 약 1.5 개만 검출되었습니다. 획득 중에 시각적 품질 검사를 수행하여 우수한 세분화를 달성합니다.
또한 다운스트림 분석에서 오류가 발생하지 않도록 Conda 환경을 올바르게 설정합니다. 세포 계수 외에도 이 파이프라인을 사용하면 세포 크기와 모양을 측정하는 다른 분할 도구와 통합하여 유전자형 그룹 간에 비교할 수 있습니다. 우리의 파이프라인을 통해 우리는 세포 분해능에서 뇌 해부학이 어떻게 변하는지 식별할 수 있으며, 이는 질병 위험에 중요한 세포 유형과 뇌 영역을 식별하는 데 도움이 됩니다.
