이 방법은 초기 인간 소뇌 발달과 신경 정신 장애에서 어떻게 변경 될 수 있는지 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 복잡한 단계를 수행하지 않고 2D 층 구조로 발달 초기 인간 소뇌 세포를 생성한다는 것입니다. 또한 비용 효율적입니다.
당김 피펫을 만드는 것은 처음에는 까다로울 수 있지만 연습과 시간을 통해 작업하기 쉬운 방식으로 피펫을 당기는 것이 더 쉬워집니다. 분젠 버너 위의 목 아래 약 22.9cm 파스퇴르 피펫을 당겨 실험 준비를 시작하여 두 개의 유리 피펫을 만듭니다. 더 얇은 쪽은 다른 쪽보다 약 4cm 짧습니다.
당겨진 쪽의 끝을 화염에 구부려 부드러운 R을 만든 다음 당겨진 피펫을 오토 클레이브 슬리브에 넣고 오토 클레이브에서 멸균하십시오. 0일째에 10마이크로몰 Y-27632 및 SB-431542가 보충된 소뇌 분화 배지 1밀리리터를 6웰 초저 부착물 또는 ULA, 플레이트의 각 웰에 추가하고 들어 올린 콜로니를 웰에 추가할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 넣습니다. 뽑은 유리 피펫을 사용하여 분화된 세포를 세척합니다.
배지를 흡인하고 각 35mm 접시에 1mm의 iPSC 패시징 솔루션을 추가합니다. 섭씨 37도에서 3 분간 배양 한 후 배지를 흡인하고 10 마이크로 몰 Y-27632 및 SB-431542가 보충 된 소뇌 분화 배지 2mm를 추가합니다 투과광 도립 현미경의 4 배 배율에서 당겨진 유리 피펫의 구부러진 가장자리를 사용하여 콜로니를 들어 올립니다. 모든 콜로니가 들어 올려지면 10 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 모든 콜로니를 6 웰 ULA 플레이트의 한 웰로 부드럽게 옮깁니다.
각 iPSC 플레이트에 대해 이 과정을 반복하고 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 배양합니다. 둘째 날에 FGF2를 각 웰에 추가하여 밀리리터당 50나노그램의 최종 농도를 조정합니다. 일곱째 날에는 1 밀리리터의 사용 된 배지를 흡인하고 1 밀리리터의 신선한 소뇌 분화 배지로 교체하여 배지의 1/3을 변경하십시오.
배아체를 7 일 동안 배양하십시오. 14일째에 플레이트를 소용돌이치게 하여 플레이트 중앙에 있는 모든 배아체를 모은다. 그런 다음 플레이트를 기울이고 가장자리에서 1000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 모든 사용 된 매체를 흡인합니다.
중간 양이 감소함에 따라 천천히 판을 평평하게 놓고 계속 흡인하여 배아체가 빠져 나오지 않도록 충분한 배지를 남겨 둡니다. 다음으로, 10 마이크로 몰 Y-27632가 보충 된 신선한 소뇌 분화 배지 3 밀리리터를 첨가하십시오. 그런 다음 10 밀리리터의 혈청 학적 피펫을 사용하여 배아 체를 Poly-L- 오르니 틴 라미닌 코팅 접시로 옮깁니다.
15 일째에 배지를 흡인하고 새로운 소뇌 분화 배지로 교체하십시오. 0일째에 iPSC 콜로니를 세척하고 SB-431542 및 Y-27632를 포함하는 소뇌 분화 배지로 들어 올리고 배아체를 생성하기 위한 초저 부착 플레이트에 넣었습니다. 2일째에 FGF2를 첨가하고 7일째에 배지를 1/3로 변경한 결과, 14일째에 배아체가 확대되었습니다.
세포는 15일째에 코팅된 표면을 따라 배아체로부터 바깥쪽으로 이동하기 시작했다. 21일째부터 배지가 소뇌 성숙 배지로 완전히 변화한 결과 35일째까지 뉴런과 유사한 형태와 복잡성을 가진 세포의 단층이 생성되었습니다. 35일째의 유전자 발현 분석은 세포가 글루타메이트성 전구 마커, ATOH1, GABA 전구 전구 세포, PTF1 알파 및 푸르킨제 전구 세포 마커 KIRREL2 및 SKOR2와 같은 초기 소뇌 전구 마커를 발현한다는 것을 밝혀냈다.
또한, 마름모꼴 립 마커인 OTX2와 대부분 전방 뉴런 특이적 SIX3의 발현도 관찰되었다. 35일째에 수확한 세포의 면역형광 표지는 소뇌 마커 EN2 및 PTF1 알파, 뉴런 마커 베타 튜불린 III 및 증식 마커 KI67에 대해 양성 염색을 나타내었다. 4'6-디아미디노-2-페닐인돌 또는 DAPI를 사용한 핵 염색은 세포핵을 보여주었습니다.
성공적인 차별화를 위해서는 건강하고 미분화된 iPSC 콜로니로 시작하여 가능한 한 신선하게 재구성된 시약을 사용하는 것이 중요합니다.
