이 방법은 운동 신경 극성, 축축기 지도, 축축한 인신 매매 및 신경 퇴행성 메커니즘과 같은 신경 생물학의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 분 애정으로 우리의 녹다운 단백질을 표현하는 동안 고도로 농축 된 운동 신경 문화를 얻는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 실리콘으로 코딩 된 해부 미디어 접시에 하나의 배아를 놓습니다.
현미경의 밑에, 집게로 실리콘에 대하여 복부로 태아를 붙들기. 두 번째 집게를 사용하여 로스트라드 척수의 중앙 운하에 팁 중 하나를 삽입합니다. 그런 다음 집게를 닫아 등조직을 약간 찢습니다.
전체 척수가 열릴 때까지 코넬 측으로 이 수술을 반복합니다. 다음으로, 열린 척수가 실리콘에 대항할 수 있도록 배아를 배치합니다. 그 후, 몸에서 척수의 로스트라드 부분을 분리.
척수의 로스트라드 부분을 꼬집어 머리에 배아를 당겨 척수를 추출합니다. 척수에 부착된 남은 수막과 DRG를 조심스럽게 꺼냅니다. 실리콘에 척수를 평평하게하고 메스를 사용하여 각 면의 중간을 따라 절단하여 코드의 등쪽 절반을 제거합니다.
중간 부분을 10개로 자르고 새로운 튜브로 옮습니다. 척수 세포 현탁액을 준비하려면 튜브 바닥에 있는 척수 조각을 수집하십시오. HBSS를 Ham F-10 배지 의 1밀리리터로 대체하고 트립신 10마이크로리터를 추가합니다.
37도에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 효소 소화를 막기 위해 조각을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고, 전체 L-15 배지 800마이크로리터, 4%BSA의 100마이크로리터, DNA 및 티타테산 100마이크로리터를 2회 나타낸다. 신선한 15 밀리리터 튜브에서 상체를 수집하기 전에 파편이 2 분 동안 정착하게하십시오.
상체 튜브 의 바닥에 4 %BSA의 2 밀리리터를 부드럽게 추가합니다. 센트로는 470 x 중력으로 5분간 융합합니다. 5 분 후, 상체를 제거하고 완전한 L-15 배지의 2 밀리리터로 셀 팔레트를 다시 중단하십시오.
모토뉴런 농축을 위해 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브 2개로 나눕힙시다. 그런 다음 각 튜브에 L-15 PH 배지 의 2 밀리리터를 추가합니다. 6개의 태아로 시작하는 경우에, 관 당 3개의 태아및 매체의 3개의 밀리리터의 동등한를 이용합니다.
밀도 그라데이션 용액 2 밀리리터를 각 튜브의 바닥에 천천히 추가하여 선명한 인터페이스를 얻습니다. 다음으로, 센트로는 실온에서 15 분 동안 830 x 중력으로 융합합니다. 이 단계 후, 작은 세포는 튜브의 바닥에 있어야하는 반면, 모토뉴런과 같은 큰 세포는 밀도 그라데이션 용액/중간 인터페이스에 있어야 한다.
아스페라에 1 ~ 2 인터페이스에서 세포의 밀리리터와 신선한 15 밀리 리터 튜브로 전송. L-15 PH 배지로 10밀리리터로 볼륨을 조정합니다. 그 후, 두 개의 튜브의 바닥에 4 %BSA 쿠션의 두 밀리리터를 추가합니다.
그리고 센트로는 실온에서 5 분 동안 470 x 중력에서 융합됩니다. 5분 후, 상류체를 제거하고 팔레트와 완전한 L-15 배지 3밀리리터를 다시 중단합니다. 원심분리기를 470 x 중력에서 실온에서 5분간 반복합니다.
그런 다음, 상체를 제거하고 셀 팔레트와 완전한 배양 배지의 2 밀리리터를 다시 중단한다. 운동 뉴런을 배양하기 위해, 24웰 플레이트에서 잘 배양 배지의 500 마이크로리터에 5, 000-10, 000 세포로 희석한다. 그런 다음 P-1, 000 파이펫 팁으로 라미네 솔루션을 제거합니다.
배양 배지에서 희석된 모터 뉴런을 즉시 이송합니다. 건조를 피하기 위해 코딩 플레이트에. DNA를 준비하기 위하여는, 신경 배양 배지의 50의 마이크로리터에 있는 DNA의 1 마이크로그램을 다시 중단합니다.
그리고 5 초 동안 소용돌이. B 튜브를 준비하려면, 뉴런 배양 배지의 50 마이크로 리터에서 구슬의 1.5 마이크로 리터를 다시 중단합니다. 50 마이크로리터의 비드 용액을 DNA 용액 50마이크로리터에 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
이 잠복기 동안, 전형될 우물에서 배양 배지의 100 마이크로리터를 철회한다. 그 후, DNA 비드 믹스의 100 마이크로리터를 각각 양으로 전달한다. 그리고 24 웰 플레이트, 37섭씨에서 자기 판에 20-30 분을 배양합니다.
여기에 표시된 모뎀 뉴런 형태는 4 일간의 배양 후 내인성 비 인성 신경 필라멘트 무거운 사슬의 서서에 의해 밝혀지는 모뎀 뉴런 형태입니다. 이러한 이미지에서, 체외에서 4일 후 모뎀 뉴런 형태를 보여주고 둘째 날에 자기에 의해 EGFP 트랜스 유전자에 대한 형질전환. 모토 뉴런은 마커 SMI-32 또는 범신경 마커 TUJ-1로 반염색되었고 화살표는 뉴런의 소마를 나타낸다.
이들은 자기 감염 모터 뉴런의 그들의 공초점 심상입니다, 야생 모형 또는 돌연변이 EGFP NEFH 구조물을 표현하고 그들의 자기 변색 마커 LC-3B를 위해 염색됩니다. 화살표는 또한 LC-3B 양성 돌연변이 EGFP NEFH 단백질 골재가 이 절차에 따라, 몬톨다 큐차는 축슨 인신 매매를 시각화하고 몇 가지 지침을 추가하기 위해 비디오 현미경 검사법에 의해 분석 될 수있다. 신경 생물학에 있는 근본적인 질문을 해결하기 위하여 그것의 초기 발달 후에, 이 기술은 또한 독성 충격 증후군 질병, 새뮤얼 트로피측 경화증, 또는 척추 근육 위축과 같은 motoneuron 무질서의 스펙트럼을 연루하는 물리 병리학 적인 기계장치를 탐구하는 강력한 공구인 것을 증명합니다.
