고처리량 스크리닝 칼슘 형광 이중 첨가 분석을 통해 세포 내 칼슘 캐스케이드를 통해 신호를 보내는 G 단백질 결합 수용체의 새로운 소분자 리간드를 식별할 수 있습니다. 이중 첨가 분석의 주요 이점은 2분 동안 형광 신호가 제공된 동일한 세포로 단일 분석에서 작용제 및 길항제 HTS를 검출하는 것입니다. 이 방법은 칼슘 캐스케이드를 통해 신호를 보내는 임의의 GPCR에 적용될 수 있으며, 이는 대부분의 절지동물 뉴런 펩티드 패밀리, GPCRs를 포함한다.
분석 재현성을 위해, 제2판에 대해 공지된 작용제의 세포 밀도, 주입 속도 및 농도를 최적화하는 것이 중요하다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사후 연구원 인 Bianca Henriques-Santos가 될 것입니다. 70 내지 90% 컨플루언트 BMLK 3개의 세포를 함유하는 T-75 플라스크로부터 폐배지를 제거함으로써 칼슘 형광 분석을 시작한다.
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 또는 DPBS 10ml로 세포를 씻으십시오. DPBS를 제거한 후 0.25% 트립신 에틸렌디아민 테트라아세트산 또는 EDTA 2밀리리터를 사용하여 세포를 분리하고 섭씨 37도에서 3-5분 동안 배양합니다. 8 밀리리터의 선택적 배지를 추가하고 세포 현탁액을 15 밀리리터의 원추형 튜브로 옮깁니다.
세포 현탁액을 1000 x g에서 3분 동안 원심분리하기 전에. 상청액을 버리고 10% 태아 소 혈청 또는 FBS와 밀리리터 G418 황산염당 400마이크로그램을 포함하는 F-12K 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 추가 희석을 위해 현탁액의 세포 밀도를 결정하려면 20 마이크로 리터의 세포 현탁액을 20 마이크로 리터의 0.4 % 트리 판 블루에 혼합 한 다음 20 마이크로 리터 혼합물을 세포 계수 챔버에로드하여 세포 밀도에 대한 세포 카운터에서 읽습니다.
동일한 F-12K 배지를 사용하여 세포 현탁액을 희석하고 밀리리터당 5번째 세포에 10 내지 4배의 밀도로 최종 부피를 15 밀리리터로 구성한다. 세포를 폴리-D 라이신 또는 PDL 코딩된 384 웰 플레이트에 시드하였다. 액체 처리 시스템을 사용하여 25 마이크로리터의 희석된 세포 현탁액을 플레이트의 384웰에 추가합니다.
가습 인큐베이터에서 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날, 90% 합류 384웰 플레이트를 빠르게 뒤집습니다. 사용된 배지를 제거하고 멸균 종이 타월에 2 내지 3회 부드럽게 블롯팅하여 플레이트로부터 모든 액체를 제거하였다.
생물 안전 캐비닛 내부의 부드러운 희미한 조명에서 다음 단계를 수행하십시오. 다음으로, 초당 3.8 마이크로리터의 흡인 및 분배 속도로 각 웰에 12.5 마이크로리터를 분주함으로써 액체 처리 시스템을 사용하여 25 마이크로리터의 로딩 염료를 각 웰에 첨가한다. 이 피펫팅 단계를 반복하여 각 웰에서 25마이크로리터의 최종 부피에 도달합니다.
완료되면 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 주변광으로부터 보호하고 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 또 다른 30분 동안 덮인 플레이트를 평형화시킨 후, 세포는 고처리량 스크리닝 또는 HTS를 위한 준비가 된다. 다음으로, 약물 플레이트를 1분 동안 플레이트 원심분리기에서 1200 x g으로 원심분리한다.
Rhimi-K-1의 10x 작용제 펩타이드 용액을 150 밀리리터 자동 친화적 인 저장소로 옮깁니다. 플레이트 판독기에서 프로토콜 관리를 클릭합니다. 그런 다음 종말점 형광 강도 프로토콜에서 Flow Forte 사전 읽기를 선택하고 측정 시작을 클릭하여 전체 HTS 분석에 대한 배경 신호를 측정합니다.
셀 플레이트를 플레이트 리더에 삽입합니다. 계기판에서 플레이트의 임의의 우물을 클릭한 다음 새 초점 높이를 클릭합니다. 초점 조정을 클릭합니다.
게인 조정을 클릭합니다. 측정 가능한 최대 형광 값의 5%에서 10%로 할당합니다. 조정 시작을 클릭합니다.
측정 시작을 클릭하여 배경 형광 신호에 대한 전체 플레이트를 상대 형광 단위 또는 RFU로 읽습니다. 플레이트가 읽는 동안 현재 상태를 클릭하여 실시간 판독값 값을 확인합니다. 이중 첨가 분석을 위해, 액체 처리 시스템을 사용하여 10 마이크로리터의 약물 용액을 위아래로 3회 위아래로 피펫팅하고 초당 1.0 마이크로리터의 흡인 속도로 약물 플레이트의 각 웰로부터 1.5 마이크로리터를 흡인한다.
0.5 마이크로 리터의 화합물을 세포 분석에 분주하여 0.2 % 디메틸 설폭 사이드 또는 DMSO에서 2 마이크로 몰의 최종 농도에 도달합니다. 스크리닝 화합물을 추가한 후 분석 플레이트를 플레이트 리더에 즉시 놓습니다. 사전 설정된 읽기 프로그램을 클릭하고 정방향 및 역방향 읽기 방향으로 플레이트를 읽습니다.
팁을 약 50ml의 DPBS가 들어있는 150 밀리리터의 폐기물 저장소에 담그면 팁에 남아있는 1 마이크로 리터의 약물 용액을 폐기하십시오. 스크리닝 화합물을 세포와 함께 인큐베이션하고, 플레이트리더 내부의 시간을 포함하여 생물안전 캐비닛에서 불이 꺼진 상태로 배양한다. 다음으로, 384 12.5 마이크로리터 팁을 사용하는 액체 처리 시스템을 사용하여 저장소로부터 3개의 작용제 펩티드 Rhimi-K-1을 분석 플레이트에 첨가한다.
플레이트를 플레이트 리더에 즉시 놓습니다. 사전 설정된 읽기 프로그램을 클릭하고 정방향 및 역방향 읽기 방향으로 플레이트를 읽습니다. 일단 수동으로 완료되면 각 플레이트 분석의 품질 관리를 위한 Z'factor를 계산합니다.
온라인 HTS 데이터 플랫폼의 히트 맵에서 히트 분자를 수동으로 선택하고 활성제 히트 및 길항제 히트에 대한 정규화된 활성화 퍼센트 또는 NPA 및 억제 활성, 또는 I0를 계산합니다. 320개의 무작위 소분자로 구성된 사내 약물 플레이트 SAC2-34-6170을 사용하여 이 HTS 분석을 시연했습니다. HTS는 0.7의 Z'factor로 우수한 분석 품질을 가졌으며, 이는 분석 품질이 시험된 화합물과 무관하다는 것을 반영합니다.
형광 신호가 수명이 짧기 때문에 작용제를 첨가한 직후 플레이트를 읽는 것이 필수적입니다. 이 절차 후에, 확인된 히트 분자는 용량 반응 분석을 통해 검증되고 표적 외 히트를 배제하기 위해 표적 GPCR을 발현하지 않는 세포에서 테스트되어야 합니다.
