이 방법을 사용하면 SAMHD1에 의해 가수분해되는 화학 요법 약물을 특성화할 수 있으며 이 효소의 저분자 억제제를 식별하기 위한 스크리닝 분석법으로 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하고 저렴하며 다양한 소분자가 이 효소와 어떻게 상호 작용하는지에 대한 방대한 양의 정보를 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 그룹의 박사 후 연구원인 Miriam입니다.
먼저 Tween-20 및 TCEP를 각각 0.005% 및 0.3mmol의 최종 농도에 첨가하여 완전한 SAMHD1 반응 완충액을 준비합니다. 완전한 SAMHD1 반응 완충액에서 최종 농도 7.9mmol에 EDTA를 첨가하여 EDTA 정지 용액을 준비합니다. MG 원액 10 부와 7 % 몰리브덴산 암모늄 2.5 부 및 11 % 트윈 -20 0.2 부를 혼합하여 공작석 녹색 또는 MG 작업 용액을 준비합니다.
멀티채널 피펫을 사용하여 투명하고 둥근 바닥 폴리프로필렌 96웰 플레이트에서 최종 농도의 100배로 관련 용매의 테스트 화합물을 순차적으로 희석합니다. 최종 용매 농도를 1% 미만으로 유지하기 위해 완전한 SAMHD1 반응 완충액을 사용하여 이러한 화합물을 최종 농도의 25배로 더 희석합니다. 5 마이크로리터의 희석된 성분을 투명한 384웰 평평한 바닥 분석 플레이트의 적절한 웰로 옮기고 용매만 대조 샘플로 절차를 반복합니다. 효소 마스터 믹스 준비를 위해 재조합 인간 SAMHD1 단백질과 재조합 피로포스파타제를 완전한 SAMHD1 반응 완충액에 희석하여 원하는 최종 농도의 4배로 희석합니다.
50 마이크로몰 농도를 얻기 위해 용액을 완전한 SAMHD1 반응 완충액에 희석하여 활성제 또는 기질 dGTP를 준비합니다. 화합물 희석액과 용매 전용 대조군이 포함된 웰에 5마이크로리터의 SAMHD1 피로포스파타제 마스터 믹스를 분주하고, 효소가 없는 제어 웰에 5마이크로리터의 완전한 SAMHD1 반응 완충액을 추가합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 dGDP 용액을 모든 웰에 분주하여 반응을 시작하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
반응을 멈추려면 20 마이크로 리터 EDTA 정지 용액을 추가하십시오. 모든 웰에 10마이크로리터의 MG 작동 용액을 첨가한 후 궤도 마이크로웰 플레이트 셰이커를 사용하여 내용물을 혼합하고 플레이트를 1000 x g에서 1분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 실온에서 20분 동안 배양하고 마이크로웰 플레이트 리더에서 630나노미터에서 흡수를 판독합니다.
양성 대조군의 표준 편차를 계산한 다음 평균을 계산합니다. 마찬가지로 음성 대조정의 경우에도 표준 편차를 계산한 다음 평균을 계산합니다. Z 계수를 계산하면 분석 품질의 지표가 됩니다.
각 흡광도 값을 양성 대조군과 음성 대조군의 평균값으로 정규화합니다. 포지티브 대조군을 100% SAMHD1 활성으로 설정하고 음성 대조군을 0%SAMHD1 활성으로 설정합니다. SAMHD1 활성 플롯은 화합물 농도의 함수이며 4개의 파라미터 가변 기울기 용량 반응 곡선에 적합하여 화합물의 절반 최대 억제 농도를 측정할 수 있습니다.
뉴클레오티드 유사체 스톡을 희석하고 SAMHD1 반응 완충액을 최종 농도의 4배로 희석하고 5마이크로리터를 384웰 분석 플레이트의 적절한 웰로 옮깁니다. 효소 SAMHD1 또는 피로포스파타제 마스터 믹스를 제조하기 위해 재조합 인간 SAMHD1 단백질과 대장균 피로포스파타제를 완전한 SAMHD1 반응 완충액에 희석하여 원하는 최종 농도의 두 배로 희석합니다. 재조합 대장균 피로인산가수분해효소를 완전한 SAMHD1 반응 완충액에서 원하는 최종 농도의 2배로 희석하여 피로포스파타제 용액만 준비합니다.
마찬가지로, 완전한 SAMHD1 반응 완충액의 스톡을 최종 농도의 4배로 희석하여 활성제 GTP 및 dGTP 알파 S를 준비합니다. 5마이크로리터의 활성제(GDP 또는 dGTP alpha S 또는 완전한 SAMHD1 반응 완충액)를 뉴클레오티드 유사체가 포함된 384웰 분석 플레이트의 적절한 웰에 분주합니다. 10 마이크로리터의 SAMHD1 피로포스파타제 마스터 믹스, 피로포스파타제 단독 또는 완전한 SAMHD1 반응 완충액을 적절한 웰에 분주하여 반응을 시작하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
EDTA 정지 용액을 사용하여 반응을 중지한 후 모든 웰에 10마이크로리터의 MG 작동 용액을 추가합니다. 내용물이 혼합되면 플레이트를 1000 x g에서 1분 동안 원심분리하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 630나노미터에서 흡광도를 측정합니다.
pyrophosphatase 전용 반응 웰에 대한 평균 흡광도 값을 계산하며, 이는 배경 값이 됩니다. 그런 다음 SAMHD1 또는 피로포스파타제 반응의 해당 웰에서 배경 값을 뺍니다. 마지막으로, 버퍼 GTP 및 dGTP 알파 S 조건을 사용하여 각 뉴클레오티드 유사체에 대해 보정된 흡광도 값을 플로팅합니다.
본 연구에서 흡수제는 말라카이트 녹색 시약으로 배양한 후 인산나트륨 농도가 증가함에 따라 증가하여 0.25밀리몰 농도에서 포화에 도달했습니다. 인산염의 선형 검출 범위는 0.004에서 0.03 밀리몰까지 볼 수 있습니다. 측정 가능한 SAMHD1 활성을 달성하기 위한 분석 성분의 요구 사항이 설명되어 있습니다.
SAMHD1 또는 피로포스파타제 단독으로는 dGTP가 있는 상태에서 유기 인산염을 생성할 수 없습니다. 그러나 모든 분석 성분이 존재할 때 신호의 증가가 관찰되었습니다. SAMHD1 억제제 화합물에 대해 얻은 용량 반응 곡선은 농도를 높이면 SAMHD1 활성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났습니다.
하이드록시우레아는 시험관 내에서 SAMHD1 활성을 억제하지 않으며, 이는 하이드록시우레아 투여량이 증가함에 따라 영향을 받지 않는 SAMHD1 활성으로 나타났습니다. 두 알로스테릭 부위에 결합하는 dGTP는 SAMHD1을 활성화하여 이 뉴클레오티드의 후속 가수분해를 허용하는 반면, 다른 세 가지 표준 dNTP는 두 번째 알로스테릭 부위에 결합하기 전에 먼저 첫 번째 알로스테릭 부위의 GTP 활성화가 필요하며 촉매 부위에서 가수분해됩니다. 뉴클레오티드 유사체의 경우, 클로파라빈 삼인산은 GTP의 존재 하에서 활성이 관찰됨에 따라 알로스테릭 부위 2 활성제 및 기질입니다.
반면 시타라빈 삼인산은 활성을 관찰하기 위해 dGTP 알파 S가 필요하기 때문에 촉매 부위만 점유할 수 있습니다. 젬시타빈 삼인산에서는 활성이 관찰되지 않았다. 열 이동 분석과 같은 물리적 접근 방식으로 이 분석에서 SAMHD1을 억제하는 소분자를 식별한 후 표적 결합을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
여기에 제시된 방법은 SAMHD1에 의해 가수분해될 수 있는 항암제를 이해하고 이 효소를 약물 내성을 극복하기 위한 잠재적인 치료 표적으로 확립하는 데 도움이 되었습니다.
