우리 기술 지원 Dipa Bhaumik, 아론 밀러와 밥 휴즈 감사합니다. 변종은 CGC, NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 우리는 조지아 우즈와 유용한 토론에 대 한 리스 고 우, Kapahi 및 Melov 실험실의 구성원 감사입니다. 메이저 리그는 국립 보건원 (NIH) 훈련 그랜트 T32 AG000266와는 엘리슨 의료 재단/미국 연맹의 노화 연구 장래가 친목에 의해 지원 되었다. 이 작품은 BioAge 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다, 건강의 국가 학회로 서 래리 L. 럼 재단 부여, 부여 UL1024917, Geroscience, 및 G.J.L.에 1R01AG029631-01A1 학 제 연구 컨소시엄을 지 원하는

1. 버퍼를 준비
<ol><li>
국물 LB
	<ol>
<li>미리 혼합된과 립 ( 자료 표참조)를 사용 하 고 준비에 대 한 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
선 충 류 성장 미디어 (NGM) 한 천
	<ol>
<li>믹스 23 agar의 g, NaCl의 3 세대, bacto 펩의 2.5 g 및 0.972 L. 압력솥에 이온된 수와 60 ° C에 게 멋진 추가 25 mL의 1 M 칼륨 인산 (KPO4) 버퍼 (pH 6.0), 1 M 황산 마그네슘 (MgSO4)의 1 mL 1 mL의 1 M 칼슘 염화 물 (CaCl2), 그리고 (에탄올)에 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차 아 염소 산 솔루션
	<ol>
<li>5 M 코의 5 mL 염소 솔루션 (6%), 그리고 이온된 H2O 50 mL의 총 볼륨의 4 mL를 혼합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
S 기저
	<ol>
<li>5 g의 NaCl, K2HPO4, KH2포4와 드 이온된 수 1 l, 다음 압력솥 6 g 1 g을 혼합.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 집중된 대장균 (OP50)의 준비
참고:이 단계는 S 기저 버퍼의 25 mL로 포화 대장균 솔루션의 1 리터를 집중 한다.
<ol><li>대장균 (스트레인 OP50)의 단일 식민지와 압력가 파운드 국물 (단계 1.1)의 5 mL를 접종 하 고 진동 (250rpm) 37 ° C에서 4-6 h에 품 어. 이 솔루션의 0.1 mL를 사용 하 여 파운드의 1 L 2 L 삼각 플라스 크에 접종. 1 L 플라스 크 하룻밤 (12-16 h) 진동 (250rpm) 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>500 mL 원심 병 10000 x g와 박테리아를 작은 멀리 나머지 미디어를 가만히 따르다 하 4 ° C에서 5 분에 1 L 숙박 문화 원심 S 기저 (1.4 단계) 25 mL에 펠 릿을 resuspend. 4 ° c.에 게</li>
</ol>3입니다. NGM 문화 접시의 준비
<ol><li>대량 배양 배지 벌레의 많은 수를 생성 하는 데 사용, 한 층 류 캐비닛 자동된 유체 디스 펜스 장치 또는 혈 청 학적인 피 펫 10 cm 배양 접시에에 녹은 (60 ° C) NGM 천의 (1.2 단계) 30 mL를 분배 하십시오. 하룻밤 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>각 10 cm 접시, 기울이기 및 회전 접시, agar 표면 표지 확산에 집중된 OP50의 2 개 mL를 피펫으로 다음 접시 건조를 허용 합니다. 최대 2 주까지 4 ° C에서 접시를 저장.</li>
	<li>높은 처리량 분석 결과 문화 접시 심사에 대 한 사용, 층 류 캐비닛에 96 잘 접시의 각 음에 녹은 NGM agar의 0.15 mL를 분배 하는 자동화 된 8 채널 디스펜서를 활용 합니다. 이 내에 그 잘 분석 결과 손상 것 이다 벌레의 하면 있는지 우물을 주의 거품 없는 있습니다. 하룻밤 건조를 허용 합니다. 최대 2 주까지 4 ° C에서 접시를 저장.</li>
</ol>4. 온도 (ts)에 민감한 살 균 C. 선 충 대량 문화의 준비
<ol><li>문화는 ' 웜 ' (연결 된 백 금 철사 또는 제조 웜 유리 피펫은 골라 골라) 해 현미경을 사용 하 여 시작 하려면 전송 20 계란 (TJ1060 변형: spe-9 (hc88) 나, 단계 3.1에서에서 준비 중 문화의 plate(s)에 rrf-3(b26)II). 다음, 6 일 동안 20 ° C에서 번호판을 품 어 (이동 20 계란의 자손의 컬렉션에 대 한 대상으로 성장 한 세대 이상에 대 한 허용 한다).</li>
	<li>시각적으로 해 현미경으로 벗 성인 (자 궁에 계란)의 존재를 확인 합니다. 2-3 mL의 유리 피 펫을 사용 하 여 접시에 기저를 분배 하 여 벗 성인을 수집 합니다. 접시 주위 액체를 손으로, 소용돌이 다음 유리 피 펫을 사용 하 여 15 mL 튜브에 액체를 수집 합니다.</li>
	<li>튜브 (1000 x g 20 ° C에서 1.5 분) 작은 벌레, 그리고 상쾌한에서 발음을 회전 합니다. 웜 펠 릿을 10 mL 차 아 염소 산 솔루션 (1.3 단계)를 추가 하 고 빠르게 모든 2.5 분 떨고 5 분, 5 미 품에 대 한 위쪽-아래쪽 방향으로 손으로 튜브를 흔들.</li>
	<li>또, 회전 튜브 (1.5 분 1000 x g); 펠 릿은 노란 갈색 이어야 한다. 상쾌한에서 발음. 계란 펠 릿을 10 mL 차 아 염소 산 솔루션을 추가 하 고 튜브를 적극적으로 악수. 1-3 분, 가끔 흔들어와 해 현미경 외관을 모니터링 하는 동안 품 어. 시각적으로 확인 계란만 남아, 다음 단계를 진행 합니다.</li>
	<li>튜브 (1000 x g 1.5 분) 아래로 회전 시키십시오 그리고는 상쾌한에서 발음. 펠 릿은 아무 갈색 채색 흰색 이어야 한다. 참고: 후 차 아 염소 산 솔루션의 제거, 그것은 오염부터 살 균 기술 및 버퍼를 사용 하 여 중요 한 (세균 및 곰 팡이, 특히) 낭비 귀중 한 시간과 시 약 실험을 망칠 수 있습니다. 이 연구는 필터링 된 층 류 캐비닛을 사용 하 고 액체 살 균 펫과 팁을 사용 하 여 이동.</li>
	<li>살 균 공간에서 튜브를 엽니다. 3 번 S와 펠 릿 기저 (1.5 분 1000 x g) 아래로 회전 하 고 발음 멀리는 상쾌한 때마다 씻어. 다시 2-3 mL S 기저에 계란 펠 릿을 일시 중단 합니다. 이 계란 지금 L1 유 충 (5 단계) 수집을 버퍼에 하룻밤 해치에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 동기 문화 (L1 애벌레 C. 선 충 을 준비)를 버퍼에 C. 선 충 알을 부 화
<ol><li>커버와 멸 균 유리 페 트리 접시에 달걀 펠 릿 및 버퍼를 가만히 따르다. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 S 기저의 2-3 mL와 함께 접시에 튜브에서 나머지 계란을 씻어. 로이 (희 궤도 셰이 커와 20 rpm) 떨고 빛으로 해칭, 격려 수 있습니다 크롤 링을 쉽게 하기 위해 기저 S의 5 mL를 추가 합니다. 계란 해치 (16-24 h) 시간에 20 ° C에서 하룻밤를 품 어. 모든 파묻혀 식품의 부재로 인해 1세인트 애벌레 단계 (L1)에서 체포 됩니다. 참고: 일화 적 증거는 신선한 L1 준비 (달걀 수집 후 16-36 h) 성인 벌레의 가장 동기 인구를 생성을 나타냅니다.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫 15 mL 튜브에 L1s를 수집 합니다. 원심 분리기 (1000 x g 1.5 분)에서 L1s 아래로 회전 시키십시오, 멀리 상쾌한, 발음 하 고 단계에 대 한 기저 S의 10 mL를 떠나 있는 동안 격판덮개, 부 화에서 모든 L1s가 수집 될 때까지 반복 합니다.</li>
	<li>L1s를 포함 하는 관에서 micropipette 0.01 mL (즉시 혼합) 후 고는 unseeded에 분배 (아니 대장균) NGM 접시. 접시에 L1s의 수를 계산 합니다. 10 번 반복 하 고 각 약 수에 있는 L1s의 수에 대 한 평균을 구하십시오. 일반적으로, (때 20 계란을 포함 하는 1 대량 문화 접시와 함께 시작) µ L 당 1-3 L1s 사이 기대 합니다.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫과 S는 L1s를 들고 기저의 볼륨을 결정 합니다. 그런 다음 L1s의 총 수를 추정 하는 이전 단계에서 얻은 0.01 mL 당 벌레의 평균 수 결정된으로 추정. 일반적으로, (20 계란을 포함 하는 대량 문화 접시) 당 10000-30000 L1s 사이 기대 합니다.</li>
	<li>이 문화를 사용 하 여 96 잘 분석 결과에서, 살 균 라운드 미디어 병 µ L 당 1 L1 L1 현 탁 액을 희석 다음 7 단계로 진행 합니다. 이 문화를 추가 생성 하는 데 사용 되는 경우 C. 선 충 문화, 대량 다음 6 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>6. 대규모 동기 문화 준비
참고: L1 솔루션은 신속 하 게 벌레 인구 증가를 사용할 수 있습니다.
<ol><li>큰 벌레 번호 L1 솔루션을 생성 하려면 대량 배양 배지 원하는 수의 각 최대 5000 L1s 분배. 4.1-2 단계에 설명 된 대로 벗 성인 2.5 일 후 (20 ° C)을 수집 하 고 달걀을 수집 하는 4.3 단계로 진행.</li>
	<li>Anecdotally 관찰 되었다는 차 아 염소 산 컬렉션 스트레스 정복 된 인구 수, 인구에 의해 분할 반복으로 따기 계란 그래서 차 아 염소 산 치료에 잔여 인구를 겪고 전에 전파에 대 한 그의 여러 인구의 세대 반복적으로 차 아 염소 산 솔루션 치료 대상이 되지 됩니다.</li>
</ol>7. 분석 결과 96 잘 접시의 설치
<ol><li>실내 온도 도달 (단계 3.3에서에서 준비) 분석 결과 접시를 수 있습니다. 다음, 층 류 캐비닛에서 각 음에 집중된 OP50 (준비 단계 2.2에서에서)의 5 µ L를 추가 합니다. 이전 처럼 자동된 8 채널 디스펜서를 사용 하 여.</li>
	<li>자동된 8 채널 디스펜서를 사용 하 여 각 음에 L1 정지의 10 µ L를 추가 합니다. 이 때문에 1 µ L 당 L1 정지에 있는 잘, 당 평균 10 벌레에 얻을 것입니다. 슬러리에서 L1s의 동등한 배급을 홍보, 분배 섞인 적극적으로 적당히 천천히 돌고 라운드 미디어 병에서 L1s 저 어 바.</li>
	<li>뚜껑, 상자 일괄 플레이트, 플레이트 커버 하 고 2 일에 25 ° C에서 품 어.</li>
</ol>8. 1 성 화학 물질과 하루 성인 C. 선 충 을 치료
<ol><li>화학 라이브러리 접시는 냉장고에서 제거 하 고 진행 하기 전에 실내 온도 도달 하는 격판덮개를 허용. 참고: 여기에 설명 된 대로 화학 라이브러리 접시 96 잘 접시에 각 잘, 모두는 동일한 농도에 있으며 DMSO에 용 해 분리 된 화합물을 포함 하는. 이러한 라이브러리 외부 열을 사용 하지 않는 그리고 이렇게 각 플레이트는 80 가지 화학 물질의 최대. 여기에 설명 된 프로토콜에서 라이브러리 농도 10 m m 이다. 그것은 고기에 용 매 효과 고려 하는 것이 중요입니다. 이 연구는 0.5%의 DMSO 농도에 스크린, 하는 동안이 수준 결코 이러한 수명 분석 실험 및 낮은 처리량 분석 실험, 어디 그것은 더 많은 복합 소재 솔루션의 농도 선택을 초과 했습니다. 이 프로토콜 수준에서 수명 수정 발생 하지 않습니다16, 적어도 N2 스트레인에 0.25%를 초과 하지 않습니다.</li>
	<li>부드럽게 흔들 플레이트 1 분 미 판 통에 60 rpm에서 즉시 사용 하기 전에.</li>
	<li>또는 사용 하는 자동화 된 96-잘 액체 처리기, 화합물의 전송 0.75 µ L (DMSO) 분석 결과 접시에 라이브러리 접시에서. 그런 액체 처리기의 피 펫 팁 (와 웜 단계 7.1에서에서 집중된 OP50 agar의 표면에 액체의 ~ 15 µ L을 0.75 µ L 볼륨을 제공 하는 시험 접시에 액체 전달 중 피 펫의 깊이, 신중 하 게 제어 됩니다. -2)와 agar 표면에 잘 관통 하지 않습니다. 매우 작은 화면에 수동 8 또는 12 채널 펫을 제외 하 고를 사용 하지 마십시오 (< 10 접시), 그들은 오류와 타협 분석 결과 agar 표면 puncturing에 자주 결과 높일 수 있습니다.</li>
	<li>테스트 중인 라이브러리 DMSO를 사용 하 여 용 매로 가정 하 DMSO (디 메 틸 sulfoxide)와 화학 라이브러리 부정적인 제어 플레이트를 준비 합니다. 10 부정적인 제어 플레이트까지 접시 테스트 모든 5 1 부정적인 컨트롤 플레이트를 확인 합니다. 가능 하다 면, 또한 긍정적인 제어 접시 만들기 (NP11 20 m m, 0.1 m m의 최종 분석 결과 농도이 목적;에 대 한 효과적인 대표적인 결과 섹션 참조). 그들은 건조에 특히 취약는 격판덮개의 2 외부 열에 화학 물질 (테스트 또는 컨트롤)을 추가 하지 마십시오.</li>
</ol>9. 건조 문화
<ol><li>agar의 표면에서 액체를 제거, 층 류 4-8 h에 대 한 캐비닛에 접시를 건조. 그것은 중요이 판을 완전히 건조 하지만 포장해 될 하지 않습니다. 몇몇 접시는 다른 사람 보다 건조 하 고, 모든 접시를 밀접 하 게 모니터링 하 고 최대한 빨리 그들은 건조를 제거 하는 데 시간이 오래 걸릴 것입니다. 접시의 개별 우물의 주의 깊은 검사에 의해 건조를 확인 합니다. 참고: 캐비닛의 배기 속도 포함 하는 요소에 따라이 작업에 걸리는 시간은 수 경험적으로 결정 합니다. 이 건조 단계 전체 캐비닛에 대 한 약 4-8 h 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>투명 필름, 번호판 봉인 다음 접시 뚜껑에 넣어.</li>
	<li>45에 대 한 분석 결과 96 잘 접시를 회전 1000 x g에서 s.</li>
	<li>매장 판 25 ° c.에서 반전</li>
</ol>10. 장 수에 대 한 선 충 C. 문화 점수
<ol><li>부정적인 제어 플레이트까지 모니터링 > 95% 사망률이 관찰 됩니다. 주 매일 이후 첫 2 주간에 대 한 번호판을 확인 하십시오. 동일한 긴장 및 종 꼬마 동료 재판17크게 다른 수명을 표시할 수 있습니다. 참고: 설명, 25 ° C에서 배양 하는 TJ1060 동물 수명 분석 결과 대 한 95% 사망률이이 인구에 있는 성인 하루 16-20에서 발생 했습니다.</li>
	<li>때 부정적인 제어 우물에 도달 했습니다 간주 됩니다는 > 95%, 45에 대 한 모든 분석 결과 96 잘 접시를 회전 s는 미 판으로 탁상용 원심 분리기에 적응로 터 (45 250 x g s 20 ° C에서).</li>
	<li>제어 판 모든 우물을 점수. 이것은 계산 하 고 각 잘에서 살아 있고 죽은 동물의 수를 기록 하 여 이루어집니다. 죽은 벌레는 움직임의 그들의 완전 한 부족에 의해 살아있는 벌레에서 분화 될 수 있다. 갖는 응답에 대 한 접 안 렌즈를 통해 찾고 있는 동안 해 현미경 표면에 약 7 cm에서 96 잘 접시를 놓아 살아 벌레에 움직임을 자극 합니다. 죽은 벌레는 응답 하지 않습니다, 그리고 인근 연구소 동료 반복적인 소음을 감사 하지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>테스트 판에 대 한 계산 하 고 살아있는 벌레를 포함 하는 우물만을 기록 합니다. 살아있는 벌레를 관찰 하는 경우에 잘 위치 및 접시는 잘 모든 살아있는 죽은 동물 계산 합니다. 참고: 그것은 종종 다시 점수 후 접시에 유용한 > 부정적인 제어 벌레의 99%는 죽 었 다. 대형 화면에서 초기 득점 할 최고의 포인트 수 있습니다. 두 경우 모두, 점수/다시-score 위에서 설명한 대로</li>
</ol>11. 다시 테스트 화합물
<ol><li>소수의 후보 화합물을 테스트할 때 (< 320 화합물), 다시 테스트 또는 후보 화면 (대표 결과 참조), 분석 결과를 제한 32 중앙 우물 가능한 판 효과 최소화 하기 위해 노력에서. 이것은 2 우물 접시의 가장자리에 가까운 치료 하지만 여전히 한 천, 음식, 그리고 벌레.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+activation+of+a+food+deprivation+signal+extends+lifespan.">Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan.</a> Aging Cell. , (2016).</li><li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. 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저자는이 작품을 지 원하는 아무 자금 엔터티 데이터, 결과, 분석 또는 게시 하는 결정에 입력 했다 선언 합니다.

여기 우리 96 잘 접시에 C. 선 충 배양을 위한 간단한 방법을 설명 했습니다. 우리 화학 검사 및 수명 분석 실험에서 사용 하기 위해 이러한 문화를 설명 하지만 많은 유형의 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다. 동안 멀티 잘 문화 조건 화학 심사에 대 한 이전 보고8, 여러 가지 방법으로 여기에 설명 된 분석 결과가 다릅니다 수명 분석10를 포함 하 여. 여기에 설명 된 수명 분석 결과 96 잘 접시를 활용 하 여, (대신 화학 살 균) 살 균 돌연변이에 의존, 천 문화 조건을 사용 하 여, 웜, 이동 처리 하는 간단한 액체를 사용 하 여 하며 수동으로 끝점에서 득점. 이 분석 결과에서 사용 하는 다른 접근 상영이 조건을 포함 하는 방법을 찾고 연구 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜에 중요 한 요소는 주로 분석 결과 대 한 생산 하는 접시의 품질에 센터. 첫째, 플레이트를 만들 때 한 천 표면 거품 및 다른 결점의 무료입니다 필수적입니다. 한 천 표면에이 변이 거의 항상 이어질 내 우물의 손실. 둘째,이 프로토콜 설치 및 약물 중독자 단계 입금 액체 떨어져 건조에 의존 합니다. 그것은 중요 이러한 액체는 완전히 제거 하 고, 하지만 한 천 밖으로 건조 될 하지 않습니다. Anecdotally, 그것 되지 않은 완전히 스 웜 (액체에서 수영) 건조 나타납니다 건조 및 균열 웜 내과 손실에 이르게 agar의 리드 플레이트의 이상 건조 하는 동안 제대로 건조 웰 스 보다 오래 산다. 이 프로토콜의 또 다른 중요 한 요소는 무 균 상태를 유지 하 고. 와 마찬가지로 모든 수명 분석 결과, 거기 많은 일 판 설치와 관련 된 그리고 많은 기회와 시간 시험 망치고 정착 하 고 성장 판에 오염에 대 한 존재.
여기에 설명 된 수명 분석 결과 C. 선 충에서 화합물의 심사에 대 한 유용 하지만, 그것은 특정 유전 배경, 제한 온도 (ts)에 민감한 살 균 스트레인;에 의존 우리는 높은 불 임 penetrance TJ1060를 사용 합니다. 이이 방법으로 심사에 사용할 수 있는 긴장을 제한합니다. 대체 원하는 배경으로 ts 메 마른 돌연변이 건너 등 화학 살 균을 사용 하 여 접근 한다. 우리는이 분석 결과와 화학 소독을 시도 하지 않은 하지만 가능 해야 한다. 잠재적인 장애물 배치는 소독 기는 벌레에 올바른 단계에서 적절 한 복용량에 포함 됩니다. 설명 하는 프로토콜은 여기 액체 디스펜서는 빠르고, 그러나 성인을 효과적으로 분배 하는 표시 되지 않습니다을 사용 합니다. 그래서,이 벌레는 접시에 개발 하 고 살 균 판에 화학으로 대우 되어야 한다. 최적의 복용량을 결정 하 고 타이밍 성공을 위해 중요 한 것입니다. 대체 전략 성인 이동할 수 있는 분배 방법을 사용 하 여 포함 됩니다. 과거에는, 우리 식별 하 고 성인 정렬 기계는 일반적으로 일시 중단 된 유 충의 균질 슬러리 분배 수 있습니다 간단한 액체 처리기 보다 훨씬 느린 것으로 나타났습니다.
일반적으로, 빠르게 화면 화학 물질과 치료가이 메서드 사용 하 여 수명에 큰 긍정적인 영향에 대 한. 방법은 여러 복용과 함께 사용 될 때 특히 효과적, 높은 숫자, 및 부정적인 컨트롤을 항상 유지 하 고 시험 접시 중 산재의 모니터링을 닫습니다. 긍정적인 컨트롤은 또한 디자인 하 고 구현 하는이 원고에서 설명 하는 스크린 경우에 유용 합니다. 그러나, 효과적인 긍정적인 것, 컨트롤 상당히 유력한 매우 강력한 될 필요가 것입니다. 화면 원래 배포 되 면 적당히 강력 하 고 강력한 화합물 확인 하지 않을 수 있습니다. 현재, 많은 보고가 있다 긍정적인 컨트롤에 대 한 가능성이 후보 '노화' 문학에 여기에서 설명 하는 스크린에 유용. 이 원고의 예상된 결과 섹션의 후보 화면 섹션에서 하 고 그림 2 및 표 1에서 설명한 대로 복합 NP1은이 화면에 대 한 효과적인 긍정적인 컨트롤. 우리는 일반적으로 3mm 문화 접시에 표준 수명 분석으로이 화면에서 긍정적인 안타를 확인합니다.

여기는 프로토콜 꼬마 선 충 수명에 미치는 영향에 대 한 화합물의 높은 처리량 검열을 위한 개발 된 설명 합니다. 프로토콜 자체는 기자 C. 선 충 종자를 이용 하 여 연구를 포함 하 여 다른 phenotypic 스크린에 쉽게 적응할 수입니다. 이 프로토콜 NP1 소설 생물학적 활성 화합물을 식별 하기 위해 성공적으로 이용 되었다 (nitrophenyl-piperazine 1), 하 강하게 식이 제한 메커니즘을 통해 C. 선 충 의 수명 연장. NP1과 놀이, 유전 통로의 설명을 포함 하 여 수명에 미치는 영향의 특성은 이전1설명 되어. 그 보고서에는 대규모 구현의 화면에서 결과의 설명도 포함 됩니다. 여기 우리가 설명 훨씬 더 자세히 방법론 및 화면 자체의 설치는 모두 작은 큰 규모 응용 프로그램에 대 한 확장 가능한.
목표는 여기에 설명 된 프로토콜의 창조에 주도 소설 생물학적 활성 화합물에 대 한 큰 화학 라이브러리의 신속한 심사에 대 한 허용 하는 C. 선 충 문화 플랫폼을 개발 했다. 화학 화면이이 프로토콜의 개발에 앞서 수행 되었습니다, 하지만 이들은 주로 소규모 또는 후보 형식 접근2,3. 실제로, 대부분의 화합물의 수만에 실험실에서 수행 하는 화면 장 수 효과4상영 되 고 안타와 스트레스 저항 분석 실험, 활용. 이 연구 하고자 했다 대신 직접 수명 효과 대 한 화면. 놀랍게도, 수행 하는 대규모 화학 스크린 C. 선 충의 때에 과학 문학에서 몇 가지 설명 했다. 실제로, 화면5,,67의 다른 유형에 비해, C. 선 충 을 사용 하 여 대규모 화학 심사에서 고용 것 같았다.
이 접근 방법을 개발 하는 기초로 사용 된 C. 선 충 에서 대규모 화학 화면 두 설명 했다. 이 중 첫 번째 화학 화면을 사용 하 여 동물의 개발을 교란 할 수 있는 화합물을 식별 하는 피터로이 실험실에서 우아한 연구 했다. 연구는 다음8이러한 화학 물질 유전 목표를 식별 하기 위해 앞으로 mutagenesis 화면 따라. 그 연구에서 설명 하는 프로토콜 사용 24 잘 pates,이 연구의 특정 요구 사항 (제한 된 양의 화학 라이브러리에 제한 된 사용 가능한 보육 공간)를 위해 간단 하 게 실행할 수 아니었다. 다른 연구는 수명 연장 화학9,10마이클 Petrascheck의 혁신적이 고 야심찬 작은 분자 화면을 했다. 그 연구는 384-잘 접시와 액체 문화를 사용합니다. 이 스크린의 다른 주요 기능 FUDR (5-fluorodeoxyuridine) 화학적으로 자손 생산을 억제 하기 위해 사용 했다. 그 연구에서 설명 하는 프로토콜의 상당한 고려 후 화학 살 균과 액체 문화 C. 선 충 의 피해 했다.
비록 FUDR C. 선 충 수명 실험에서 널리 이용 된다, FUDR 예기치 못한 약물 상호 작용을 발생할 수 있습니다 또는 그 FUDR 자체 수명에 어떤 영향을 미칠 수 있습니다 우려 했다. 최근이 후자의 문제는 검증, 적어도 일부 농도 및 25 ° C11에서 특히. 자손 오염의 문제 회피, C. 선 충 스트레인 TJ1060 사용 되었다는 두 개의 독립적인 온도 민감한 돌연변이 항구 (spe-9 (hc88) 나, 정자 생산을 폐지 하 고 유용한 것으로 입증 되었습니다 rrf-3(b26)II) 대 한 동기 인구12의 대량 문화. 이 긴장은 25 ° C에서 완전히 살 균 하지만 15-20 ° c.에 교양 때 자손을 생산할 예정 이다 이 연구 액체 문화 얻은 결과 항상 기존의 한 천 배지와 재현 한 천의 표면에 크롤 링 하는 벌레와 함께 기존의 문화 조건, 사용. 이 현상을 완전히 이해 되지 않습니다, 그러나 그것은 입증 되었습니다 그 웜 교양 교양 표준 미디어13,14에 웜 보다 다른 방식으로 박사 (식이 제한) 액체 반응에. 따라서 액체 미디어 화면 식별 것입니다 그렇지 않으면 일부 박사 mimetics 마스크 수 그럴 듯 하 게 이다.
한 천 문화 조건에 정착 하는 데,이 분석 결과에서 우물의 성능 점수에 대 한 다른 옵션 고려 되었다. 다양 한 자동화 또는 이미징 기반된 분석 사용할 수 있는 동안, 그들은 필요한 수집 및 배포의 기술적으로 도전적인 장치, 대부분의 엄청나게 비싼 했다. 이 옵션을 고려 하는 동안 모든 종류의 이전 수명 화면 참조 필수적 이었다. 궁극적으로,이 연구 수명 고기15시 우 실비아 리 연구소의 전체 게놈 RNAi 스크린에서 적응 점수 메서드를 사용 합니다. 특히, 모든 수명 접시 같은 방식으로 설정 하지만 부정적인 컨트롤만 감시 되었다. 일단 부정적인 컨트롤 플레이트 근처 전체 사망률을 확인 했다, 테스트 플레이트 손으로 득점 했다. 이 대형 스크린에서 긍정 주 반응의 3 중 반복 갓 화학 물질을 사용 하 여 다시 테스트 하 여 확인 되었다.

<table><tbody><tr><td>LB Broth Miller Granules</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unispense&amp;nbsp;</td><td>Wheaton Science Products</td><td></td><td>automated fluid dispensing apparatus</td></tr><tr><td>96 well assay plate; COSTAR 3370</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop 384; automated 8 channel dispenser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>manufactored worm pick</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Stovall Life Science inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microplate shaker; MTS 2/4 Digital</td><td>IKA Works, inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler</td><td>&amp;nbsp;Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor&amp;nbsp;</td><td>Sorenson Bioscience, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>manual 8 or 12 multi-channel pipettes</td><td>we use rainin&amp;hellip;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>table top centrifuge; Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 은 생리학에 화학 효과 테스트 하기 위한 유용한 유기 체입니다. 전체 유기 체 분자 스크린 수명 등 복잡 한 고기를 수정할 수 있는 생물 학적 활성 화학 구조를 식별 하는 데 상당한 이점을 제공 합니다. 여기에 설명 된 각 잘에서 C. 선 충 의 상당히 일관 된 번호 96 잘 문화 접시의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜이입니다. 다음으로, 우리는 선 충 류 C. 선 충의 수명에 미치는 영향에 대 한 이러한 문화 화면 화학 물질의 수천을 사용 하는 방법을 지정 합니다. 이 프로토콜 온도 민감한 살 균 긴장, 한 천 격판덮개 조건 및 심사에 대 한 동기화 된 동물 문화의 신속 하 고 높은 처리량 생산을 촉진 하기 위하여 처리 하는 간단한 동물의 사용.

우리 96-잘 수명 분석 실험을 위해이 프로토콜을 채용에서 대표적인 결과 검토 하 여 시작 합니다. 첫 번째 예제에서 메서드는 30000 화학 물질을 통해 성공적으로 스크린에 사용 되었다 C. 선 충 의 수명을 확장 하 고 또한 화학 물질을 사용 하 여 수행 하는 최고의 후속 다시 테스트 화면에서 결과 포함 하는 화학 물질 확인에 동일한 프로토콜입니다. 이러한 결과 앞에서 설명한1했다입니다. 두 번째 예에서는 후보 화합물의 작은 규모 스크린에 동일한 프로토콜을 사용합니다.
대형 스크린 및 다시 테스트: 30000 화합물을 테스트 하는 대형 화면 중복에 단 하나의 복용량에서 수행 되었다. 각 화학 따라서 20의 예상된 총 동물 인구와 가진 2 개의 우물에서 시험 되었다. 이 위해 3 개의 개별 세트 (중복)에서 10000 화합물의 전체 30000 화합물을 충당 하기 위해 3 개월의 기간 동안 상영 했다. 이 부분에서 수동 분석 결과의 끝에 득점의 관리 금액을 보장 하기 위해 수행 했다 하 고 각 집합에서 분석 결과 96 잘 접시의 260의 총 필요 합니다. 도서관 사진 판, 80만 웰 스 포함 화합물; 10000 화합물에의 한 복제 125 분석 결과 접시를 만든다. 이 연구 각 세트에서 10 부정적인 컨트롤 플레이트 2 복제 사용. 처리량을 증가, 접시 때 부정적인 제어 인구 ~ 99% 사망 경험 평가 했다 득점 했다. 살아있는 벌레에 대 한 모든 테스트 웰 스 다음 조사 했다.
한 라이브 벌레 스에서 화학 안타 라고 했다. 웰 스 되었고 또한 라는 안타, 그리고 그 우물에 또한 모든 벌레 (살아있는 죽은) 이상 1 웜 살아에 포함 된 화학 물질 간단한 점수 생성을 계산 했다 (백분율 살아 점수, 살아있는 벌레 죽은 벌레의 수로 나눈 수). 라이브러리에 있는 각 화학 수 따라서 히트 두 번 그리고 그 안타, 하지만 수도, 그들과 관련 된 점수를가지고. 512 가지 화학 30000 화합물의 화면에서 조회 수 (적어도 한 번) 전화를 했다. 화면 강력한 그리고/또한 강력한 (재현성) 프로 장 수 효과 식별 목적으로 수행 되었다. 이러한 두 가지 다른 속성 뚜렷한 효과 있을 수 있습니다. 강력한 화학 물질 수 극적으로 어떤 경우에 우리는 그 화학 물질의 잘 살아있을 벌레의 높은 % 기대 수명을 증가. 강력한 화학 물질에 대 한 두 복제 살아있는 벌레를가지고 것으로 예상 것입니다. 히트 리스트는 이러한 기준에 따라 평가 되었다. 화학 물질의 179 높은 백분율 살아 점수, 굴복 또는 두 복제에 성공 했 고 따라서 다시 테스트를 위해 선정 됐다. 라는 안타, 하지만 다시 테스트를 위해 선택 하지 나머지 화학의 대부분 복제 우물 중 하나에서 단일 웜 살아 포함만 했다.
다시는 안타의 테스트, 3 복제 (예상된 총 동물의 인구 30), 그리고 치료 제어 판에서 동물의 수명의 주의 정량화를 제외 하 고 기본 화면으로 유사 했다. 이러한 변화는 비교 테스트 및 제어 우물에 도움이 추가 되었습니다. 화학 안타의 179 다시 주문, 10mm, 희석 되었고 96 잘 접시에 이동. 다시 테스트 분석 결과 대 한 내부 24 웰 스만 사용 되었다 (이 프로토콜의 현재 버전 사용 했 내부 32 우물 다시 테스트 화면에 대 한 프로토콜 섹션에 설명 된 대로) 화합물 6 부정적인 제어 분석 결과 플레이트와 3 중에서 다시 테스트 했다 DMSO 용 매로 처리. 한 부정적인 컨트롤 플레이트 총 생존 (그림 1A)에 대 한 주기적으로 득점 했다. 모든 플레이트 득점 했다 완전히 제어 동물의 약 95% 죽은 때, (치료 모든 생활과 죽은 벌레 계산 했다).
다시 테스트 결과에서 안타를 호출 하는 커트 오프 부정적인 컨트롤 + 2 표준 편차 (SD)의 평균 백분율 살아있는 점수에서 만들어졌다. 테스트 웰 스에 대 한 % (득점의 시간)에서 살아 평균 점수는 각 음에 대 한 세 가지 복제에서 살아 백분율 점수를 평균 하 여 계산 했다. 이 특정 분석 결과 대 한 부정적인 제어 우물의 평균 백분율 살아 점수 48 우물 (triplicate 부정적인 컨트롤 플레이트 2 세트) 3 복제의 평균으로 계산 했다. 다시 테스트 화학 세트에서 안타를 호출 하는 데 사용 하는 SD 48 부정적인 제어를 통해 SD % 살아있는 점수를 평균 했다. 이 전략을 사용 하 여,이 연구 발견의 179, 다시 테스트 화학 물질의 32%의 총 양성 시연 (그림 1B) 테스트 다시 도서관에서 57 안타. 부정적인 제어 및 테스트 웰 스에 대 한 평균된 % 살아있는 점수의 binning 테스트 웰 스 제어 웰 스 (그림 1C) 실적이 표시 됩니다.
후보 스크린: 작은 규모 스크린 위에서 설명한 재 시험을 유사한 방식으로 수행할 수 있습니다. 여기, 우리는 139 화합물과 후보 화면에서 결과 설명합니다. 이 후보는 장 수를 촉진 가능성이 구조로 조립 했다. 이 화면에 대 한 우리는 두 개의 다른 복용량 (50 µ M, 100 µ M)에서 테스트 판의 5 복제 수행. 또한, 우리가 포함 하는 두 개의 다른 복용량; 단일 긍정적인 컨트롤 (NP1) 접시 8 부정적인 컨트롤 플레이트, 사용 50 µ M, 100 µ M
부정적인 통제 격판덮개는 동물의 ~ 90% 죽 었 때까지 감시 되었다. 그 당시, 웰 스는 모든 제어 웰 스, 그리고 살아있는 벌레를 포함 하는 테스트 웰 스에서 라이브 하 고 죽은 벌레를 계산 하 여 득점 했다. 득점의 시간에서 살아 % 각 우물에 대 한 평균된 % 살아있는 점수를 계산에 사용 되었다. 부정적인 컨트롤 32 웰 스 8 복제에서 % 살아있는 점수를 했다. 긍정적인 컨트롤에 대 한 각 복용량에 대 한 4 복제에 걸쳐 평균 4 잘 점수 있었다. 조회 수는 평균 보다 큰 한 평균된 백분율 살아 점수와 웰 스에 대 한 전화를 했다 부정적인 제어 % 살아 점수 + 2 sd. 이 컷오프 후보 화면에서 14 안타와 모든 부정적인 제어 웰 스 제외. 그 구분 또한 긍정적인 컨트롤의 모든 포함 100 µ M와 긍정적인 컨트롤의 50%에서 치료 하는 우물 50 µ M에서 치료. 이러한 결과 제시 여기 범주화 50 µ M (그림 2A) 및 100 µ M (그림 2B) 테스트 화면에 대 한 백분율 살아있는 점수를 평균 했다.
마지막으로, 모든 접시 늦은 시간이 시점에서 한 번에 대응 다시 득점 했다 부정적인 컨트롤의 99% 보다 큰 치료 동물 죽 었다고. 그 결과 긍정적인 통제 우물까지 밖 수행 부정적인 제어 및 시험 우물 (그림 2C) 표시. 동안 테스트 웰 스 부정적인 컨트롤 보다 약간 더 나은 했다. 이 후자의 결과 테스트 웰 스의 많은 제어 치료 (표 1), 따라서이 간단한 해석 혼동 상대적인 독성을 전시에 등장 하는 표시에 의해 편 파. 이것은 이후 후보 라이브러리 C. 선 충에서 알 수 없는 생물학 활동 화학 물질의 진정한 화면 다시 테스트 화면 했다 독성 화합물에 대 한 본질적으로 사전 검사 동안에, 예상 될 것 이었다. 이 기본 화면 수명 길어 화합물에 대 한 이후, 크게 독성 화학 물질 해야 하지 다시 테스트에 설정 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig1.jpg"> 그림 1 : 대표 결과 높은 처리량 화면 하 고 다시 테스트 (A) Survivorship 다시 테스트 분석 결과에 사용 된 대표적인 부정적인 컨트롤 플레이트에서 곡선. 이 곡선 분석 결과의 18 일 동안 4 번이이 시험에 사용 되는 24 스에서 모든 라이브 및 죽은 벌레를 점수에서 건설 되었다. 성년의 날 18, 컨트롤 ~ 5% 생존을 평가 했다 그리고 모든 제어 테스트 및 플레이트 또한 득점 후 했다. (B) 테이블 화면 및 재 시험의 결과 요약. (C) Binning 다시 테스트 화면에서 제어 및 테스트 조건에 대 한 웰 스 평균 백분율 살아 점수. 컨트롤에 대 한 점수는 48 우물에서 각 구성 3 복제의 평균. 테스트 결과 179 우물에서 각 구성 3 복제에서 평균된 점수. 그림 1 은 이전 게시1에서 재생 된다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig2.jpg"> 그림 2 : 대표 후보 화면에서 결과 (A) Binning 50 µ M 후보 화면에서 결과의. 139 테스트 잘 결과 5 복제에서 평균된 백분율 살아있는 점수를 나타냅니다. 8 복제에서 평균된 백분율 살아 점수 32 부정적인 제어 결과 의하여 이루어져 있다. 4 복제 (16 총 50 µ M에 포함 NP1 우물)에서 평균된 백분율 살아 점수 4 긍정적인 제어 결과 의하여 이루어져 있다. (B) 100 µ M 후보 화면에서 결과의 Binning. 모두는 (A)에서 같이 테스트 웰 스와 긍정적인 컨트롤 100 μ M 농도에서 치료. 같은 부정적인 컨트롤 플레이트는 모두 (A 와 B)에 표시 됩니다. (C) 대표는 상대적으로 극단적인 늦은 시간에 접시를 다시 점수에서 결과. 그냥이 시간 시점에서 주요 텍스트 및 표 1에 설명 된 대로 테스트 웰 스에 대 한 편견을 라이브 벌레와 우물의 %를 차지 하는 경우 긍정적인 컨트롤은 극적으로 모든 다른 사람 보다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="6">평균된 백분율 살아 점수의 binning</td>
		</tr>
<tr>
<td>그룹화 된 점수</td>
			<td>모든 죽은 (0)</td>
			<td>1-10</td>
			<td>11-20</td>
			<td>21-30</td>
			<td>31-40</td>
			<td>> 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>다시 테스트</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td># (-) 제어</td>
			<td>16</td>
			<td>31</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># 테스트 웰 스 (50µM)의</td>
			<td>46</td>
			<td>69</td>
			<td>50</td>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>후보 스크린</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td># (-) 제어</td>
			<td>0</td>
			<td>11</td>
			<td>21</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>(+)의 # 제어 (50µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>(+)의 # 제어 (100µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td># 테스트 웰 스 (50µM)의</td>
			<td>94</td>
			<td>22</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># 테스트 웰 스 (100µM)의</td>
			<td>86</td>
			<td>25</td>
			<td>21</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 대표 binning 다른 화면에서 결과 여기 두 화면 (다시 테스트 및 후보)에서 평균된 백분율 살아 점수의 binning 선물이. 다시 테스트 화면에서 피크는 부정적인 컨트롤과 유사 하 게 테스트 다시 오른쪽에 극적으로 부정적인 제어를 능가 (수명이 긴) 사이드 테이블의. 이 다시 테스트 집합에 여러 개의 프로 장 수 화합물의 존재를 나타냅니다. 후보 화면에서 우리는 피크는 모든 죽은 카테고리에는 또한 테이블의 오른쪽에서 명백한 신호를 참조 하십시오. 이 후보 세트에서 프로 장 수 화합물의 존재를 나타냅니다 하지만 또한 중요 한 독성 화합물에 대 한 후보 집합 중의 존재를 나타냅니다.

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

여기 우리는 빠르게 잘 당 Caenorhhabditis 선 충 의 일관 된 번호 96 잘 문화 접시 선 충 성장 미디어 agar의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 문화는 전체 생물의 phenotypic 심사에 대 한 유용 합니다. 우리는 여기 화면 화학 물질에 이러한 culture를 사용 하 여 프로 장 수 효과 초점.

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

8.7K 조회수.  The Buck Institute for Research on Aging. 여기 우리는 빠르게 잘 당 Caenorhhabditis 선 충 의 일관 된 번호 96 잘 문화 접시 선 충 성장 미디어 agar의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 문화는 전체 생물의 phenotypic 심사에 대 한 유용 합니다. 우리는 여기 화면 화학 물질에 이러한 culture를 사용 하 여 프로 장 수 효과 초점.

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

연구

발생학

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple and inexpensive method to obtain a large number of animals for the isolation of proteins to proceed with a western blot, mass spectrometry, or further proteomics analyses. Furthermore, an increase of nematode numbers for immunostainings and the integration of multiple analyses under the same culturing conditions can easily be achieved. Additionally, a transfer between plates with different experimental conditions is facilitated. Common techniques in plate culture involve the transfer of a single C. elegans using a platinum wire and the transfer of populated agar chunks using a scalpel. However, with increasing nematode numbers, these techniques become overly time-consuming. This protocol describes the large-scale culture of C. elegans including numerous steps to minimize the impact of the sample preparation on the physiology of the worm. Fluid and shear stress can alter the lifespan of and metabolic processes in C. elegans, thus requiring a detailed description of the critical steps in order to retrieve reliable and reproducible results. C. elegans is a model organism, consisting of neuronal cells for up to one-third, but lacking blood vessels, thus providing the possibility to investigate solely neuronal alterations independent of vascular control. Recently, early neurodegeneration in diabetic retinopathy was found prior to vascular alterations. Thus, C. elegans is of special interest for studying general mechanisms of diabetic complications. For example, an increased formation of advanced glycation end products (AGEs) and reactive oxygen species (ROS) is observed, which are reproducibly found in C. elegans. Protocols to handle samples of adequate size for a broader spectrum of investigations are presented here, exemplified by the study of diabetes-induced biochemical alterations. In general, this protocol can be useful for studies requiring large C. elegans numbers and in which liquid culture is not suitable.

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

This protocol describes a method for the large-scale cultivation of Caenorhabditis elegans on solid media. As an alternative to liquid culture, this protocol allows obtaining parameters of different scales under plate-based cultivation. This increases the comparability of results by omitting the morphological and metabolic differences between liquid and solid media culture.

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Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

생화학

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

행동분석학

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

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Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

환경과학

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

생물학

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

면역학 및 감염병학

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

자동화 된 행동 분석의 큰 C. 선 충 인구 넓은 시야의 사용 하 여 추적 플랫폼

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

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선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가