이 프로토콜은 조사자가 천연 방광 요로상피에서 CDNA 또는 SIRNA를 발현할 수 있도록 하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 단순성, 요로상피에서 cDNA, siRNA를 고효율로 비교적 짧은 시간 내에 발현하는 능력입니다. 이 기술의 가장 어려운 부분은 카테터 삽입입니다.
그러나 전반적인 기술은 한 번 배우면 비교적 쉽게 마스터할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 전문가 IV인 Giovanni Ruiz가 될 것입니다. 시작하려면 마취 된 마우스를 코 콘 옆의 가열 패드에 놓습니다.
프로토콜 기간 동안 동물을 마취 상태로 유지하십시오. 마우스가 발가락 핀치로 완전히 마취되었는지 확인합니다. 방광으로 공기가 유입되는 것을 방지하려면 멸균 이송 피펫 또는 주사기를 사용하여 IV 카테터 및 관련 허브의 플라스틱 카테터 부분을 멸균 PBS로 채웁니다.
앙와위 자세의 동물과 함께 외부 요도 비도를 70 % 알코올로 닦습니다. 그런 다음 외부 요도 비도를 형성하는 조직을 부드럽게 잡고 미세한 집게를 사용하여 동물에서 수직으로 확장합니다. 멸균 카테터를 외부 비도에 삽입합니다.
다른 손을 사용하여 카테터를 요도 비도에 약 3-4mm 수직으로 조심스럽게 삽입합니다. 그런 다음 외부 비도에 삽입 된 카테터를 동물의 꼬리쪽으로 내리면 치골 아래를 통과하여 궁극적으로 방광으로 들어가는 요도 부분으로 쉽게 들어갈 수 있습니다. 방광의 소변이 새어 나오도록하십시오.
Crede의 조작을 수행하여 하복부 부위의 방광 범프를 마사지하고 부드럽게 눌러 잔류 소변을 제거합니다. 요로상피가 형질도입을 수용하도록 하려면 PBS로 채워진 멸균된 1밀리리터 주사기를 카테터 허브에 부착하여 마우스 또는 쥐 방광을 세척합니다. 100마이크로리터의 멸균 PBS를 마우스 방광에 주입합니다.
카테터 피팅에서 주사기를 분리한 후 PBS가 배출되도록 합니다. PBS에 용해된 0.1%N-도데실-베타-D-말토사이드 100마이크로리터를 주입하고 멸균된 1밀리리터 주사기를 사용하여 마우스 방광에 멸균된 0.2마이크로미터 필터를 주입합니다. 주사기를 제자리에 두고 N-dodecyl-beta-D-maltoside를 방광에 10분 동안 유지합니다.
주사기를 분리하고 배출되도록 하여 방광에서 N-dodecyl-beta-D-maltoside를 제거합니다. 방광에 바이러스를 도입하려면 멸균 된 1 밀리리터 주사기를 카테터 허브에 부착하고 5, 000, 000에서 100, 000, 000 IVP의 아데노 바이러스를 100 마이크로 리터의 멸균 PBS에 희석하거나 쥐의 경우 450 마이크로 리터를 방광에 주입하십시오. 30분 후 주사기를 분리하고 바이러스 용액이 방광을 일회용 패드로 배출하도록 합니다.
패드를 버리는 동안 흡수성 물티슈로 잔류 바이러스 용액을 닦아내고 생물학적 유해 폐기물로 닦아냅니다. 동물이 회복 할 수 있도록하려면 이소 플루 란의 흐름을 중단하십시오. 특히 동물이 집단 사육장인 경우 새장으로 돌려보내기 전에 동물이 회복되고 완전히 움직일 수 있도록 하십시오.
mRNA in situ hybridization, western blot 또는 immunofluorescence와 같은 방법을 사용하여 처리 후 12 내지 72시간 후에 이식유전자 발현의 효과를 분석한다. 요로상피 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 형질도입된 방광의 요로상피에서 V5 태그가 부착된 인간 성장 호르몬 발현을 나타내었지만 형질도입되지 않은 방광에서는 발현되지 않았습니다. 또한 인간 성장 호르몬 또는 V5 에피토프 태그를 인식하는 항체를 이용한 면역형광법으로도 발현을 확인하였다.
웨스턴 블롯 분석은 아데노바이러스로 형질도입된 쥐에서 Claudin-2의 발현을 확인했지만 통제된 GFP-인코딩 바이러스로 형질도입된 쥐에서는 확인되지 않았습니다. 면역형광 분석은 바이러스-코딩 Claudin-2 cDNA로 형질도입된 요로상피우산 세포에서 외인성 Claudin-2 발현을 추가로 확인했습니다. 전체 장착 또는 단면 요로상피의 면역형광 및 공초점 현미경에 의한 Tight Junction Protein 1의 외인성 Claudin-2의 검출은 세포 세포질에서 Tight Junction의 존재 및 Claudin-2의 세포 내 축적을 밝혀냈습니다.
이미지 필드는 형질도입된 우산 세포의 수를 세면 95%에 가까운 효율이 나타나고 방광벽 전체에서 요로상피만 형질도입되고 주입된 아데노바이러스에 의해 표적이 되는 다른 조직은 없음을 보여줍니다. 카테터 삽입은 프로토콜이 의도한 대로 작동하는 데 중요합니다. 이 기술을 통해 연구자는 정상적인 요로상피 생물학을 연구할 수 있을 뿐만 아니라 단백질 과발현 또는 과소 발현이 질병을 유발하는 상태를 이해할 수 있습니다.
