1. Namalwa 세포를 준비하여 계산 <ol><li> 문화 플라스크에서 세포를 제거하고 펠릿에 세포를 원심 분리기. PBS의 유명한 볼륨에 뜨는 및 resuspend 세포를 제거합니다. 이 프로토콜에 사용되는 세포 현탁액 세포입니다. 당신은 자기편 세포를 사용하는 경우가 수집되기 전에 trypsinize해야합니다. </li><li> 라이브 세포의 수를 확인하려면 계산 슬라이드에 0.4 % trypan 파랑 솔루션과 혼합물의 pipet 10 μl로 1시 1분를 혼합하여 세포 현탁액의 나누어지는을 얼룩 다음 TC10 자동 세포에 슬라이드를 삽입 카운터 (바이오 래드 연구소, 병원). </li><li> TC10 셀 카운터는 것입 자동 초점 카운팅을 진행 후 가장 정확한 카운트를 보장하고 있습니다. 그것은 자동으로 샘플에 살고있는 세포와 세포 전체의 밀도를 결정합니다. </li><li> viewscreen에 세포를 표시하는 이미지를 보려면 선택합니다. 다음 TC10 셀 카운터를 가지고 희석 계산기를 선택 자동으로 필요한 것입니다 세포 혼합물의 양을 계산합니다. </li><li> 이 실험은 세 siRNAs 총을 사용하고 있습니다 : 한 컨트롤 siRNA와 STAT6 유전자, 플러스 untransfected 컨트롤을 대상으로 두 개의 서로 다른 siRNAs합니다. 이것은 ML 당 5 X 10 6 세포의 최종 농도에서 3.6 ML이 필요합니다. </li><li> 희석 계산기로 원하는 농도와 최종 볼륨 값을 입력하고 그것 샘플에 대한 라이브 셀 개수를 기반으로 세포 현탁액 필요의 볼륨을 계산합니다. 또는 수동으로 계산을 수행합니다. 그런 다음 새로운 튜브로이 실험에 대한 세포 혼합물의 필요한 볼륨을 전송합니다. </li><li> 펠렛 세포에 세포 섞어 돌려 모든 PBS를 제거합니다. 진 Pulser의 electroporation 버퍼 (바이오 래드 연구소)의 3.6 ML에 Resuspend. 해당 siRNAs를 포함하는 튜브에 800 μl aliquots를 전송하고 부드럽게 섞는다. 세포는 이제 electroporation을 위해 준비가되어 있습니다. </li></ol> 2. 96 - 웰 플레이트에있는 세포를 Electroporating <ol><li> 96 - 웰 플레이트 electroporation은 함께 electroporated하는 네 가지 치료를위한 복제를 허용합니다. </li><li> 96 - 웰 electroporation 판의 해당 우물에 세포 현탁액 150 μl을 전송합니다. </li><li> MXcell의 electroporation 플레이트 챔버에 접시를 넣고 뚜껑을 닫습니다. </li><li> 사용중인 셀 라인과 버퍼에 최적화된 설정을 사용하여 Electroporate. 이러한 세포는 지수 붕괴 250 V의 악기 설정으로 파, 350 μF, 1000 Ω 저항을 사용 electroporated 있습니다. </li><li> electroporation가 완료되면, 믹스 그리고 미리 예열 미디어를 포함하는 조직 문화 플레이트로 세포를 전송하는 각 우물에 부드럽게 위아래로 피펫합니다. Namalwa 세포는 7.5 % FCS, 1 %의 pyruvate로 보충 RPMI (생명 기술)에 재배하고 있습니다. </li><li> electroporated되지 않은 컨트롤 샘플은 남아있는 세포 현탁액에서 가져온 및 electroporated 세포에 동일하게 미리 예열 문화 매체 문화 요리에 추가됩니다. </li><li> 37 밤새 품어 세포 ° C와 5 % CO 2. </li><li> 24 시간 후, 세포의 한 세트 10 NG / ML 최종 농도 재조합 IL - 4 (R &amp; D 시스템)로 유도했습니다. 제어 세포의 두 번째 세트는 추가적인 미디어를받을 수 있습니다. 모든 세포는 37 ° C와 5% CO 2에서 추가로 24 시간을 incubated 있습니다. </li></ol> 3. RNA를 추출하고 확인 <ol><li> 성장의 48 시간 총 후, 각 우물에 세포를 계산하고, RNA 추출을위한 microfuge 튜브 각 잘 한 나누어지는를 전송하고, 모래 바닥 서부 또는 기타 단백질 분석을위한 두 번째 나누어지는을 동결. </li><li> 펠렛 세포 샘플을 원심 분리기, 다음 각 튜브의 표면에 뜨는를 제거하고 폐기. </li><li> RNA 추출 진행합니다. 우리는 일반적으로 포함되어있는 프로토콜에 따라 오럼 총 RNA 키트 (생물 래드)를 사용합니다. </li><li> 타락한 RNA가 오해의 소지가있는 결과를 제공하기 때문에 siRNA 중재 유전자 최저를 모니터링하면 그것은 RNA의 품질을 확인하기 위해 특히 중요합니다. 280분의 260 비율은 RNA의 무결성을 나타내는 것은 아닙니다 그러므로 그것은 RNA가 저하되지 않습니다 확인 젤 또는 microfluidic 장치의 샘플을 실행하는 것이 중요합니다. </li><li> 한 단계에서 품질과 수량 모두를 평가하려면 다음 샘플은 Experion 자동 전기 영동 시스템 (생물 래드)를 사용하여 분석합니다. </li><li> 첫째, 열 샘플. 그런 다음, 프라임, 부하, 그리고 소용돌이 Experion RNA 칩. Experion 전기 영동 역에 칩을 삽입하고 실행을 시작합니다. </li><li> 실행이 완료되면, Experion 소프트웨어 (전통적인 RNA와 유사한 어떤 electropherogram, 결과 테이블의 양식 (RNA 농도, ribosomal 비율, 그리고 RNA 품질 표시 번호를 표시), 그리고 가상 젤 자동으로 결과를 표시합니다 겔). 고품질의 총 RNA 샘플은 일반적으로 80-10의 RQI을 것입니다. </리&gt; </ol> 4. 실시간 PCR <ol><li> RNA 품질을 확인 후, cDNA 반응과 함께 진행합니다. 이 실험을 한 반응으로 cDNA 합성과 실시간 PCR을 결합 iScript 한 단계 RT - PCR 혼합 (바이오 래드) 사용됩니다. </li><li> 각 프라이머 세트에 대한 RNA 템플릿 이외의 모든 반응 구성 요소를 포함하는 마스터 믹스를 확인하고, PCR 플레이트로 그들을 배포합니다. </li><li> 균일한 농도로 RNA를 diluting 후, 적절한 우물에 RNA 샘플을 추가합니다. 각 반응은 세중의에 설정되어 있습니다. </li><li> 접시를 밀봉하고, CFX384 실시간 PCR 시스템 (바이오 래드)에 넣습니다. 적절한 프로토콜을 선택하고 실행을 시작합니다. </li><li> 실행이 완료되면 유전자 발현이 제어 siRNA와 electroporated 세포의 동일한 정상화하는 실험 siRNA와 electroporated 세포에서 참조 유전자에 정규 관심 유전자의 유전자 표현을 비교에 의해 결정됩니다. </li></ol> 5. siRNA의 최저 분석 <ol><li> CCL17의 표현은 CCL17의 IL - 4에 의존 유도의​​ transcriptional 활성제 STAT6의 역할을 조사하기 위해 정량 실시간 PCR을 사용하여 모니터링할되었습니다. 본 실험에서는, GAPDH는 참조 유전자로 사용되었다. 대체 기준 유전자 또는 여러 참조 유전자가 같은 방식으로 사용할 수 있습니다. </li><li> CFX 관리자 소프트웨어가 자동으로 같은 예제에서 참조 유전자의 표현에 CCL17 표현을 표준 자동으로 단순히 &quot;참조&quot;와 제어 처리 (IL - 4 유도하지 않고 제어 siRNA)로 GAPDH를 선택하여 치료를 제어하는​​ 결과 표준 값을 비교 CFX 관리자 소프트웨어의 실험 설정 창에서 &quot;조정&quot;. </li><li> 없이 IL - 4 유도, CCL17의 전사가 낮은, 제정 수준에서 제어 트리 트먼트 비교 남아. </li><li> IL - 4로 유도된과 정상 STAT6 경로를 (즉, 제어 siRNA 또는 untransfected 제어 트리 트먼트) 유지 세포는 CCL17 표현의 80-10 배 유도을 보여주었다. </li><li> IL - 4가 아니라 STAT6 표현 중 STAT6 siRNA의 도입에 의해 저해로 유도된 세포는 CCL17의 IL - 4 유도된 표현 STAT6의 역할을 확인 uninduced 세포보다는 약 2 배 높은 CCL17 표현을 보여주었다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. IL - 4 신호 경로의 개요. 의 수용체에 IL - 4의 A) 바인딩은 STAT6의 dimerization 및 활성화로 연결됩니다. 핵에 STAT6 translocates을 활성화 및 CC17로서 목표 유전자의 전사를 활성화한다. B) IL - 4 유도없이 CCL17의 전사가 낮은, 제정 수준에서 유지됩니다. C) STAT6 유전자의 siRNA - 중재의 입을 후, I​​L4 치료는 CCL17 표현에 거의 또는 전혀 증가로 이어질 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. IL4에 의해 CCL17의 유도는 양적 실시간 PCR에 의해 여러 조건으로 측정. A) IL - 4 않고 재배 샘플에 관계없이 유전자 발현의 표현의 낮은 수준을 제정했다. B) 녹색과 파란색으로 그림과 같이, 컨트롤 샘플 IL - 4와 치료에 일반적으로 대응, CCL17의 80-10 배 유도와 함께. 그러나, 세포, 빨간색 및 분홍색에 나타난 STAT6를 타겟팅 siRNAs와 transfected는 아이디어를 지원, IL - 4에 대응 CCL17 표현을 저하 있다고 STAT6 재생 CCL17의 IL - 4 유도된 표현의 역할.

저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산하는 바이오 래드 연구소에 의해 고용됩니다.

이 문서는 서스펜션 세포 라인을 transfect하고 이러한 세포의 유전자 발현을 수행하는 방법을 어려운에 siRNAs를 electroporate하는 방법을 시연했다. 이 절차를 수행할 때 그것은 모든 샘플에 걸쳐 최대한 일관된 것들을 유지하는 기억하는 것이 중요 S.

using an automated cell counter to simplify gene expression studies: sirna knockdown of il-4 dependent gene expression in namalwa cells

siRNA의 중재 유전자 최저의 사용은 유전자 발현 연구에 중요한 도구로 계속됩니다. siRNA 연구는 단일 유전자를 downregulating의 효과를 연구하기 위해뿐만 아니라 실시되고있다뿐만 아니라, 신호 경로 및 기타 복잡한 상호 작용 네트워크를 심문합니다. 이러한 경로 분석은 관련 세포 모델의 사용과 세포 생리학 적은 섭동 원인이 방법을 모두 필요로합니다. Electroporation은 점점 조사에서 신호 경로를 변경하지 않고 셀 라인 및 기본 세포를 transfect 어려울으로 siRNA와 다른 핵산을 소개하는 효과적인 방법으로 사용되고 있습니다. 성공적인 siRNA 실험에 여러 중요한 단계가 있으며, 여러 실험 단계에있는 데이터 품질을 개선하는 동안 작업을 단순화하는 방법이 있습니다. 당신이 당신의 siRNA의 중재 유전자 최저 프로젝트로 시작할 수 있도록, 우리는 포스트 transfection 실시간 PCR 유전자 발현 분석을 통해 electroporation하기 전에 세포를 수집하고 계산의 전체 경로 연구를 수행하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 다음 연구는 버킷 림프종 세포주 (Namalwa)에서 CCL17의 IL - 4에 의존 유전자 발현의 transcriptional 활성제 STAT6의 역할을 조사. 보여준 기술은 자기편과 서스펜션 세포 모두에서 siRNA 기반 실험의 광범위한 유용합니다. 우리는 또한 방법 동시에 MXcell의 electroporation 시스템을 사용하여 여러 개의 샘플을 electroporate하는 TC10 자동 셀 카운터 카운트 세포, 어떻게 동시에 Experion 자동 전기 영동 시스템과 RNA의 품질과 수량을 평가를 간소화하는 방법을 보여줍니다.

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Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

이 절차는 셀 라인을 transfect 실시간 PCR에 의해 유전자 발현에 따라 어려움에 siRNA를 도입하는 빠르고 쉬운 흐름을 설명합니다. 자동 셀 카운터의 사용, 멀티 잘 electroporation 판 및 자동 전기 영동 역은 고가의 로봇 처리가 필요없이 신속하고 신뢰성있는 결과를 제공합니다.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

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Research

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Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

연구

면역학 및 감염병학

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Production of siRNA-Loaded Lipid Nanoparticles using a Microfluidic Device

The development of functional lipid nanoparticles (LNPs) is one of the major challenges in the field of drug delivery systems (DDS). Recently, LNP-based RNA delivery systems, namely, RNA-loaded LNPs have attracted attention for RNA therapy. In particular, mRNA-loaded LNP vaccines were approved to prevent COVID-19, thereby leading to the paradigm shift toward the development of next-generation nanomedicines. For the LNP-based nanomedicines, the LNP size is a significant factor in controlling the LNP biodistribution and LNP performance. Therefore, a precise LNP size control technique is indispensable for the LNP production process. Here, we report a protocol for size controlled LNP production using a microfluidic device, named iLiNP. siRNA loaded LNPs are also produced using the iLiNP device and evaluated by in vitro experiment. Representative results are shown for the LNP size, including siRNA-loaded LNPs, Z-potential, siRNA encapsulation efficiency, cytotoxicity, and target gene silencing activity.

Microfluidic-based lipid nanoparticle (LNP) production methods have attracted attention in drug delivery systems (DDSs), including RNA delivery. This protocol describes the fabrication, LNP (siRNA-loaded LNP) production, and LNP evaluation processes using our original microfluidic device named iLiNP.

미세 유체 장치를 사용하여 siRNA로드 지질 나노 입자의 생산

The development of functional lipid nanoparticles (LNPs) is one of the major challenges in the field of drug delivery systems (DDS). Recently, LNP-based ...

생화학

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

생물학

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다 2 + ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will greatly facilitate the use of ES cells for developmental biology studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine (reviewed in 1,2).
To expedite the identification and characterization of novel regulators of ES cell maintenance and self-renewal, we developed a fluorescence reporter-based assay to quantitatively measure the self-renewal status in mouse ES cells using the Oct4GiP cells 3. The Oct4GiP cells express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the Oct4 gene promoter region 4,5. Oct4 is required for ES cell self-renewal, and is highly expressed in ES cells and quickly down-regulated during differentiation 6,7. As a result, GFP expression and fluorescence in the reporter cells correlates faithfully with the ES cell identity 5, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis can be used to closely monitor the self-renewal status of the cells at the single cell level 3,8.
Coupled with RNAi, the Oct4GiP reporter assay can be used to quickly identify and study regulators of ES cell maintenance and self-renewal 3,8. Compared to other methods for assaying self-renewal, it is more convenient, sensitive, quantitative, and of lower cost. It can be carried out in 96- or 384-well plates for large-scale studies such as high-throughput screens or genetic epistasis analysis. Finally, by using other lineage-specific reporter ES cell lines, the assay we describe here can also be modified to study fate specification during ES cell differentiation.

We describe a fluorescence reporter assay to quickly identify and characterize genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.

E4orf4 - 유도 세포 사망에 최저 효과의 유전자 발현 및 측정의 조건부 최저위한 셀 라인의 작성

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell cytoskeletal structures. This involves the assembly-disassembly of higher-order macromolecular structures at a given time and location, a process that is particularly sensitive to perturbations caused by overexpression of proteins. Methods that can preserve protein homeostasis and maintain near-to-normal cellular morphology are highly desirable to determine the functional contribution of a protein of interest in a wide range of cellular processes. Transient depletion-rescue experiments based on RNA interference are powerful approaches to analyze protein functions and structural requirements. However, reintroduction of the target protein with minimum deviation from its physiological level is a real challenge. Here we describe a method termed adenofection that was developed to study the role of molecular chaperones and partners in the normal operation of dividing cells and the relationship with actin remodeling. HeLa cells were depleted of BAG3 with siRNA duplexes targeting the 3&#39;UTR region. GFP-tagged BAG3 proteins were reintroduced simultaneously into &#62;75% of the cells using recombinant adenoviruses coupled to transfection reagents. Adenofection enabled to express BAG3-GFP proteins at near physiological levels in HeLa cells depleted of BAG3, in the absence of a stress response. No effect was observed on the levels of endogenous Heat Shock Protein chaperones, the main stress-inducible regulators of protein homeostasis. Furthermore, by adding baculoviruses driving the expression of fluorescent markers at the time of cell transduction-transfection, we could dissect mitotic cell dynamics by time-lapse microscopic analyses with minimum perturbation of normal mitotic progression. Adenofection is applicable also to hard-to-infect mouse cells, and suitable for functional analyses of myoblast differentiation into myotubes. Thus adenofection provides a versatile method to perform structure-function analyses of proteins involved in sensitive biological processes that rely on higher-order cytoskeletal dynamics.

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

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