이 방법을 사용하면 천연 및 인공 다공성 배지에서 생물막 발달에 대한 기공 크기 및 유속의 영향에 대한 체계적인 연구를 수행할 수 있으므로 다공성 매체 바이오 막힘의 기본 메커니즘을 밝힐 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 변경의 가장 높은 공간 및 시간적 해상도와 다양한 실험 조건 및 요구 사항에 대한 플랫폼의 적응성입니다. 섭씨 25도의 안정적인 온도를 보장하기 위해 실험 3시간 전에 현미경의 상자 인큐베이터를 켜는 것으로 시작합니다.
입구 및 출구 튜브를 미세 유체 장치에 연결합니다. 입구 튜브에 외경 0.6mm의 바늘을 삽입하여 튜브와 주사기 사이의 연결을 고정합니다. 미세유체 장치, 탈이온수 30밀리리터 및 배양액 30밀리리터를 진공 데시케이터에 넣고 최소 1시간 동안 탈기합니다.
완료되면 배양 배지와 탈이온수를 두 개의 개별 30밀리리터 주사기로 천천히 당깁니다. 그런 다음 현미경에 미세 유체 장치를 장착하고 배출 튜브를 폐기물 용기에 넣습니다. 탈이온수로 채워진 주사기를 미세유체 튜브를 통해 미세유체 채널에 연결하고 압력 센서 배출구에서 나올 때까지 물을 천천히 주입합니다.
압력 센서에 물을 채우고 미세유체 채널과 압력 센서를 연결하는 튜브에서 모든 기포를 씻어냅니다. 압력 센서 전용 나사로 압력 센서의 배출구를 닫습니다. 미세유체 채널의 나머지 부분을 탈이온수로 채웁니다.
다음으로, 배양 배지 주사기에 1.2 마이크로 미터 필터를 놓습니다. 물 주사기를 제거하고 주사기를 입구 미세유체 튜브에 조심스럽게 연결합니다. 주사기 펌프에 주사기를 장착 한 후 1 시간 동안 시간당 2 밀리리터의 유속으로 배양 배지로 채널을 플러시합니다.
그 후, 실험 중에 주사기 펌프를 원하는 유량으로 설정하고 압력 센서의 압력 판독값을 0으로 설정합니다. 다음에, 1.5 밀리리터 원심분리 바이알에서 600 나노미터 파장에서 0.1의 광학 밀도의 바실러스 서브틸리스 NCIB 3610 배양물 1밀리리터를 피펫팅한다. 박테리아 배양액을 미세유체 채널에 로드하려면 출구 튜브를 원심분리기 바이알에 넣고 5분 동안 기다렸다가 튜브 출구에서 잠재적인 기포를 제거합니다.
완료되면 미세 유체 채널이 박테리아 배양으로 채워질 때까지 시간당 1밀리리터의 유속으로 150마이크로리터의 박테리아 용액을 회수합니다. 그런 다음 배양 배지 주사기 필터를 조심스럽게 제거하고 배출구를 폐기물 용기에 넣습니다. 박테리아 세포를 미세유체 채널에서 3시간 동안 제로 플로우 상태로 두어 다공성 배지에 표면 부착을 허용합니다.
실험을 시작하려면 주사기 펌프를 원하는 유속으로 설정하여 유량을 시작하고 원하는 시간 간격, 광학 구성 및 배율로 성장하는 생물막의 이미지를 획득하기 전에 1Hz에서 압력 판독을 시작합니다. 생물막 형성 과정은 명시야 현미경을 사용하여 시각화되었으며, 박테리아 세포와 생물막이 이미지에서 더 어두운 픽셀로 나타났습니다. 24시간 실험 동안, 초기에 무작위로 성장한 생물막은 거의 모든 다공성 배지를 식민지화했습니다.
생물막의 표면 피복은 20시간에서 가장 큰 기공 크기에서보다 가장 작은 기공 크기에서 10% 더 빠르게 발생했습니다. 생물막 표면 커버리지와 압력 축적의 상관관계는 더 작은 공극 크기의 미세유체 채널에서의 막힘이 더 큰 공극 크기에서보다 입구와 출구 사이의 더 큰 압력 차이를 초래한다는 것을 보여주었다. 기억해야 할 가장 중요한 측면은 온도 안정 환경에서 실험을 실행하고 기포 형성을 피하기 위해 미세 유체 장치와 용액을 잘 탈기하는 것입니다.
이 방법을 통해 체계적인 연구를 통해 유속 및 공극 크기의 영향과 관련하여 산업 및 천연 다공성 매체 모두에서 생물막 성장의 기본 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.
