영장류 IPSC는 유용하지만 윤리적 및 기술적 문제로 인해 얻기가 어려운 경우가 많습니다. 이 프로토콜은 영장류 IPSC의 생성 및 유지에 가장 접근하기 쉬운 경로를 제공합니다. IPSC의 주요 공급원으로 비뇨기 세포를 사용하면 특별한 기술 없이 완전히 비침습적인 방식으로 얻을 수 있기 때문에 큰 이점이 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 Wolfgang M.S.Laboratory의 박사 과정 학생인 Jessica Radmer입니다. 시작하려면 소변이 들어 있는 튜브를 400G에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 1 밀리리터를 남기고 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
암포테리신을 함유하는 소변 세척 완충액 10밀리리터를 첨가하여 세포를 세척하고 혈청학적 피펫을 사용하여 현탁액을 조심스럽게 혼합합니다. 원심 분리 후, 상청액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 0.2 밀리리터 미만을 남긴다. 초기에 처리된 소변 50밀리리터당 암포테리신을 함유한 1차 소변 배지 1밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
젤라틴을 제거하고, 1 밀리리터의 현탁액을 젤라틴으로 코팅된 12 웰 플레이트의 웰에 첨가한다. 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양합니다. 기저막 매트릭스 코팅된 12웰 플레이트를 제조하기 위해, 웰 당 500 마이크로리터의 기저막 매트릭스를 추가한다.
접시를 움직여 액체를 분배하고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양합니다. 배양 후 기저막 매트릭스를 900 마이크로 리터의 REMC 배지로 교체하고 사용할 때까지 섭씨 37도에서 보관하십시오. 방정식을 사용하여 5 개의 감염 다중도에 필요한 센다이 바이러스의 양을 계산하십시오.
센다이 리프로그래밍 키트의 구성 요소를 섭씨 37도에서 템퍼링된 수조에서 빠르게 해동합니다. 센다이 바이러스의 계산 된 부피를 추가하고 혼합하기 전에 총 100 마이크로 리터의 REMC 배지를 튜브에 첨가하십시오. 원고에 기술된 바와 같이 비뇨기 세포를 해리시킨 후, 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 원하는 수의 세포를 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다.
원심 분리에 의해 펠릿을 얻고, 제조 된 센다이 바이러스 혼합물 100 마이크로 리터에 재현 탁시킨다. 현탁액 감염을 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다. 인큐베이션 후, 세포 현탁액을 기저막 매트릭스가 코팅된 12 웰 플레이트에 파종하기 전에 총 1 밀리리터의 REMC를 첨가한다.
형질도입 후, 유도만능줄기세포(IPSC)가 발달할 때까지 배지를 2일마다 교체하고, 5일째에 PSC 생성 배지로 전환하여 콜로니를 생성한다. IPSC 콜로니가 덩어리 계대배양을 위해 충분히 커지면 배양된 세포에서 배지를 흡인하고 500마이크로리터의 DPBS로 세포를 조심스럽게 세척합니다. DPBS를 제거한 후, 500 마이크로리터의 0.5 밀리몰 EDTA를 웰에 첨가하고, 2 내지 5분 동안 배양한다.
콜로니가 분리되기 시작할 때까지 현미경으로 세포를주의 깊게 관찰하십시오. 콜로니의 가장자리가 벗겨지기 시작하고 세포 사이의 틈이 보이게되면 EDTA를 제거하고 조심스럽게 500 마이크로 리터의 DPBS를 첨가하십시오. DPBS를 흡인하고 P-1000 피펫을 사용하여 500마이크로리터의 PSC 배양 배지로 웰을 플러시합니다.
콜로니를 적절한 크기의 덩어리로 분산시키기 위해 위아래로 피펫을 만듭니다. 컨플루언시드, 시딩된 세포의 원하는 밀도 및 IPSC 클론 선호도에 따라, 세포 덩어리 현탁액의 1/10 내지 1/50을 새로운 웰로 옮긴다. 접시를 앞뒤로 여러 번 부드럽게 움직여 덩어리가 우물에 고르게 분포되도록 합니다.
덩어리가 부착되도록 섭씨 30도에서 최소 37분 동안 플레이트를 배양합니다. 콜로니가 통과할 수 있을 만큼 충분히 커질 때까지 2-3일마다 배지를 교체하십시오. 분리 후, 편평 세포와 다양한 작은 원형 세포가 소변과 함께 배설되는 것을 볼 수 있습니다.
첫 번째 부착성 증식 세포를 볼 수 있으며, 이러한 세포는 계대할 수 있는 큰 콜로니로 성장합니다. 두 가지 뚜렷한 세포 유형을 볼 수 있는데, 하나는 상피와 유사한 표현형을 나타내고 다른 하나는 길쭉한 모양을 가진 더 중간엽과 유사한 표현형을 나타냅니다. 첫 번째 통과 후, 비뇨기 세포는 단층으로 자랍니다.
IPSC가 생성되는 동안 일부 부착 세포를 볼 수 있으며 이러한 세포는 형태학적 변화를 보이기 시작하여 세포의 재프로그래밍을 나타냅니다. 또한, 콜로니를 형성하는 세포는 전형적인 배아 줄기 세포 형태를 나타낸다. 생성된 모든 IPSC는 명확하게 정의된 가장자리를 가진 촘촘하게 채워진 세포를 특징으로 하는 전형적인 배아 줄기 세포와 유사한 콜로니 형태를 공유합니다.
면역세포화학은 고릴라 IPSC에서 만능 관련 마커의 발현을 테스트하는 데 사용되었습니다. 또한, 유세포 분석 결과 분석된 오랑우탄 IPSC가 TRA-1-60에 양성인 것으로 나타났습니다. 또한 고릴라 IPSC는 내배엽, 중배엽 및 외배엽 계통으로 분화할 수 있습니다.
분화된 세포의 수가 증가하고 경계 무결성 및 균일성이 손실되면 IPSC 품질이 좋지 않음을 나타냅니다. 대조적으로, 정의된 경계, 촘촘한 세포 패키징 및 두드러진 핵소체는 고품질 IPSC를 의미합니다. 관상 동맥 가변성으로 인해 영장류 IPSC가 건강하게 성장할 수 있도록 분할 비율, 통과 타이밍 및 덩어리 크기와 같은 클론 특정 조건을 최적화해야 합니다.
확립된 IPSC의 품질 관리로서 마커 유전자 발현을 확인하는 것 외에도 in vitro EV 분화와 같은 직접 또는 간접 분화 유도를 통해 사전 효능을 확인할 수 있습니다.
