이 방법은 갈륨-68로 표시된 D-펩타이드 DPA를 사용합니다. DPA를 표지하는 무선 추적자 Gallium-68을 사용하면 비침습적 방식으로 전신의 PDL-1 발현을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. D-펩타이드의 사용은 단백질 분해 분해에 대한 내성이 매우 강한 무선 트레이서를 수여하고 대사 반감기를 현저하게 연장합니다.
특히, 이 기술은 특정 표적의 발견과 우수한 전화 통화 역학을 가진 무선 추적자의 개발에 따라 다양한 질병을 평가하는 데 적용될 수 있습니다. 이 기술은 PDL-1 양성 종양의 치료에도 적용할 수 있으며, DPA를 루테튬-177 및 악티늄-225와 같은 다른 방사성 뉴클레오티드로 표지할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 연구원인 Wu Jiang입니다.
펩타이드 d-도데카펩타이드 길항제(DPA)를 방사성 표지하기 위해 DPA를 함유한 준비된 스톡 버퍼 5마이크로리터를 스크류 캡이 있는 1.5밀리리터 폴리프로필렌 용기에 피펫팅하고 400마이크로리터의 68갈륨 삼염화물을 용기에 추가합니다. 혼합물을 5초 동안 소용돌이치게 합니다. pH 테스트 스트립을 사용하여 혼합물의 pH를 측정하고 0.1몰 수산화나트륨으로 pH를 4 내지 4.5로 조정합니다.
용액을 실온에서 5-10분 동안 배양합니다. 그런 다음 텍스트에 언급된 조건에 따라 반응 혼합물을 무선 HPLC에 적용하여 방사선 표지 수율을 분석합니다. PBS에서 추적자 안정성을 테스트하려면 아세트산나트륨 용액에 10마이크로리터의 갈륨-68 표지 DPA를 990마이크로리터의 PBS에 추가합니다.
혼합물을 섭씨 37도에서 1시간, 2시간, 4시간 동안 약간의 교반과 함께 배양합니다. 상기 각 시점에서 용액의 200 마이크로 리터를 수집하고 무선 HPLC로 분석합니다. 마우스 혈청의 추적자 안정성을 테스트하려면 아세트산나트륨 용액에 포함된 갈륨-68 표지 DPA 10마이크로리터를 갓 준비한 마우스 혈청 90마이크로리터에 첨가하고 혼합물을 섭씨 37도에서 1시간, 2시간, 4시간 동안 약간의 교반을 가하여 배양합니다.
그런 다음 상기 시점마다 20 마이크로 리터의 용액을 수집하고 100 마이크로 리터의 아세토 니트릴 물 혼합물을 수집 된 부분 표본에 첨가합니다. 5, 25 섭씨 온도에 10 분 동안 000 G에 혼합물을 분리하십시오. 전파 HPLC를 사용하여 상층액을 분석합니다.
80% 밀도에 도달할 때까지 12웰 플레이트에서 U-87 MG 세포를 배양합니다. 그런 다음 배지를 제거하고 0.5ml의 PBS로 세포를 세척합니다. 갈륨-68 표지 DPA를 신선한 배지에 밀리리터당 74킬로베크렐의 농도로 희석합니다.
그런 다음 희석된 갈륨-68 표지 DPA 완충액 0.5mL를 각 웰에 추가합니다. 섭씨 37도에서 10분, 30분, 40분 및 120분 동안 Gallium-68 표지 DPA로 세포를 배양합니다. 배양 후 피펫을 사용하여 배지를 흡인하고 0.5mL의 PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
다음으로, 웰당 300마이크로리터의 0.5몰 수산화나트륨 용액을 추가하여 세포를 용해합니다. 30초 후 점성 세포 용해물을 1.5밀리리터 튜브에 수집합니다. 웰 당 0.4 밀리리터의 PBS를 두 번 첨가하여 플레이트를 세척하고 언급 된 1.5 밀리리터 튜브에 세척액을 수집합니다.
자동 감마 카운터의 내장 컴퓨터를 시작하고 튜브를 내장 선반에 넣습니다. 모든 샘플을 컨베이어에 적재한 후, 시작 버튼을 누릅니다. 결과는 내부 소프트웨어에서 계산되며, 판독값은 각 튜브의 분당 감쇠 상관 횟수(CPM)를 기록합니다.
본문에 언급된 프로토콜에 따라 U-87 MG 세포를 채취하고 세포를 0.5밀리리터 주사기로 흡인합니다. 다음으로, BALB/c 누드 마우스를 채취하여 마우스당 2개의 종양 수를 유지하면서 세포를 피하 주사합니다. 주사 후 종양 부피가 100-300 입방 밀리미터가 될 때까지 종양 성장을 모니터링합니다.
PET 이미징을 수행하려면 사전 설치된 꼬리 정맥 카테터를 통해 추적자를 정맥 주사합니다. 참조 소프트웨어를 사용하여 호스트 컴퓨터에서 스캐닝 워크플로우를 생성한 다음, 스터디 폴더를 생성하고 제조업체의 지침에 따라 수집 프로토콜을 설정합니다. 3D 목록 모드에서 60분 동안 각 마우스에 대해 동적 스캔을 수행합니다.
다음으로, 제조업체의 지시에 따라 히스토그램 프로토콜과 재구성 프로토콜을 정의합니다. 픽셀당 0.5 사이클의 나이퀴스트 컷오프와 함께 Hanning의 필터를 사용하여 25-30분 동안 PET 동적 이미지를 재구성하고 필터링된 역 투영을 통해 55-60분 동안 재구성합니다. 모든 마우스에 대해 최대 강도 투영 또는 MIP 이미지를 생성합니다.
꼬리 정맥 주입을 통해 BALB/c 누드 마우스를 함유한 U-87 MG에 갈륨-68 표지 DPA를 투여합니다. 안락사 후 동물의 흉벽을 해부하고 심장을 엽니다. 1밀리리터 주사기를 사용하여 혈액을 채취하고 주사기에서 혈액을 짜내어 감마 계수기용 직경 13mm의 무선 면역분석 튜브(RIA)에 넣습니다.
주요 장기와 종양을 절제하고 감마 계수기를 위해 유사한 RIA 튜브에 넣습니다. 본문에 언급된 모든 주요 장기의 무게를 잰다. 자동 감마 계수기를 사용하여 수집된 장기 내의 방사능을 측정하고 붕괴 값을 수정합니다.
젖은 티슈 그램당 주입된 선량의 백분율을 계산합니다. 갈륨-68 표지 DPA는 높은 전파 화학 수율 불순물을 보여주었습니다. PBS와 마우스 혈청 모두에서 매우 안정적이었으며, 4시간 배양 후 갈륨-68 분해 또는 펩타이드 가수분해를 나타내지 않았습니다.
U-87 MG 세포의 약 60%는 유세포 분석에 의해 사멸 리간드 1 또는 PDL-1 양성으로 프로그래밍된 것으로 밝혀졌으며, 면역형광 염색을 통해 U-87 MG 세포에서 PDL-1의 강력한 발현이 확인되었습니다. U-87 MG 세포는 PDL-1 억제제인 BMS-202를 차단제로 사용했을 때 현저히 감소한 갈륨-68 표지 DPA의 시간 의존적 흡수를 보여주었습니다. BMS-202의 추정 결합 친화도는 갈륨-68 표지 DPA를 경쟁자로 사용했을 때 리터당 43.8나노몰이었습니다.
전신 PET 영상은 주사 30분 및 60분 후 종양에 높은 갈륨-68 표지 DPA 축적을 보여주었습니다. 병행 실험에서는 주사 후 60분에 음성 대조군 Bon-1 종양에서 갈륨-68 표지 DPA 축적이 거의 없음을 입증했습니다. 또한, 면역조직화학적 염색은 U-87 MG 세포가 상당한 PDL-1 발현을 나타내지만, Bon-1 종양은 나타내지 않음을 밝혀냈다.
헤마톡실린 염색과 에오신 염색은 두 종양 조직 사이에 유사한 세포 형태를 보였다. 생체 외 생체 분포 연구는 심장, 간, 폐 및 근육을 포함한 대부분의 분석 기관에서 방사능과 혈액이 빠르게 제거되었음을 보여주었습니다. 신장에 가장 많은 양의 방사능이 축적된 반면, 종양은 모든 시점에서 두 번째로 높은 추적자 흡수를 보였습니다.
D-펩타이드의 구조가 달라지는 것은 갈륨-68로 DPA를 라벨링하는 효율적인 방법을 사용하는 것이 가장 중요한 단계입니다. 이 기술은 PET 추적자 및 전파 진단제로서 다양한 암을 관리하는 효과적인 방사성 의약품으로 PET 검사를 활용할 수 있는 길을 열었습니다.
