Name: development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies
Uploaded: 2016-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
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This work was supported by grant 1R01CA152303-01.

윤리 정책 : 환자 유래 대장 선암 종양 표본이 콜로라도 여러 임상 시험 심사위원회 (08-0439)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 콜로라도 병원의 대학에서 환자 동의에서 얻었다. 모든 동물의 작업은 콜로라도 덴버 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인 동물 프로토콜에 따라 수행 하였다 (IACUC, 프로토콜 # 51412 (06) 1E와 96813 (04) 1E). 1. 받기 및 환자 혈액을 준비 <ol><li> 한 수집 -이 구연산 나트륨을 함유하는 혈액 / 세포 분리 튜브에서 혈액 ㎖ (플라즈마, 림프구 및 단핵구 밴드 밀도 구배 유체, 겔 차단 및 적혈구 및 호중구가 포함 된 튜브 상이다). 주의, 혈액이나 조직과 혈액 매개 병원체의 지침을 따르십시오. 참고 : PBMC를 플라즈마를 포함 할 수있다 미래 연구에 사용될 수 있습니다 : 종양 돌연변이와 생식 세포 유전 적 변이를 비교, circula를 분리등 무 세포 DNA (cfDNA) 검사 단백질 마이크로 RNA, 평가 팅 종양 세포. </li><li> RT 없음 브레이크 15 분 동안 2,500 XG에서 혈액 / 세포 분리 튜브를 원심 분리기. </li><li> 말초 혈액 단핵 세포를 (림프구 및 튜브의 단핵구 대역에서 PBMC를)를 수집하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관 (일반, 오토 클레이브, DNase의,의 RNase 및 발열 무료)에 넣어 멸균 인산 완충와 튜브의 상단에 기입 식염수 (PBS). <ol><li> RT에서 3 분 동안 2300 × g으로 원심 분리 튜브의 하단의 한 PBMC 펠릿을 형성 하였다. 다음, 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 30 초 동안 3,000 XG에 펠렛 원심 분리기를 씻어 멸균 PBS 1 ML을 추가 한 다음 상층 액을 제거합니다. </li></ol></li><li> 1.5 ml의 멸균 극저온 유리 병에 (튜브의 플라즈마 단계에서) 혈액 / 세포 분리 튜브에서 플라즈마를 수집하는 피펫을 사용하여 (DNase의와의 RNase 무료, 아니 인간의 DNA, 내 독소 무료) 및로 PMBC의의 플라즈마와 펠렛을 넣어 -80 ° C (F)저장 Freezer (냉동실). </li></ol> 2. 받기 및 환자 종양 샘플 준비 <ol><li> 준비 RPMI 또는 DMEM 미디어 1 다음 중 하나 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 비 필수 아미노산의 100 (10 %), 1 : 1000 (1 %) Plasmocin, 10 % 불 활성화 태아 소 혈청 (전체 미디어) 및 추가 20-25 종양 표본에 대한 멸균 컬렉션 컵 ml의. </li><li> 얼음에 완전한 미디어를 포함하는 살균 컵에 종양 샘플을 검색하거나 4 ℃에서 보관하십시오. 주 : 종양 샘플, 외과 의사에 의해 제거 병리학 자에 의해 처리하고, 완전한 미디어 무균 수거 컵에 배치되어 과잉 환자 종양 조직의 한 조각이다. 주의, 혈액이나 조직과 혈액 매개 병원체의 지침을 따르십시오. 또한, 이상적으로 다섯 마우스를 주입, 종양은 약 1 ㎤의해야합니다. </li><li> 면역 저하 쥐에 주입 동물 시설에 종양 샘플을 가져와. 주 : 최대한 빨리 종양 샘플을 처리하는 것이 최상이다. <ol><li> 층류 후드에서 종양 컵에서 멸균 플라스틱 가공 접시에 종양 샘플을 놓는다. 젤라틴 단백질 혼합 용액 300 ㎕를 가득 멸균 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 12 약 3 × 3 × 3mm 조각과 배치 - 10로 절단하는 오토 클레이브 - 작은 가위와 집게를 사용합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 우선 순위로 마우스에 종양을 주입하지만, 남아있는 종양이 존재하는 경우, 플래시 냉동 바이알 (FF), 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 컵 및 실행 가능한 종양 병을 수집합니다. </li><li> FF를 들어, 단백질, RNA 또는 DNA 분리와 같은 추가 분석을 위해 멸균 저온 유리 병에서 종양 조직의 작은 조각을 수집합니다. 액체 질소 듀어에 즉시 FF를 배치하고 장기 보관 -80 C의 냉동고 °. </li><li> FFPE 들어 충분한 종양, 위 종양, 적어도 24 시간 동안 포르말린되면 파라핀 블록에 10 ml의 10 % 포르말린 컵 프로세스로 3 작은 조각이됩니다. 참고 : 24 시간을 기반으로우리의 조직학 코어의 제안 11 끕니다. </li><li> 마지막으로, 극저온 튜브에 남아있는 종양을 배치합니다. 미디어를 완료하는 데 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 추가하여 가능한 미디어를 확인합니다. 다음으로, 극저온 튜브에 1 ml에 추가하고 얼음에 저장합니다. 주 : 오랜 시간 동안 얼음에 보관하지 마십시오. <ol><li> 10 종양이 향후 5 생쥐에 주입하는 이상적으로 충분합니다 작은 조각으로 남은 종양을 잘라. 이를 이소 프로필 알코올 냉동 컨테이너 (천천히 한번에 종양 1 °의 C를 정지)에 넣고, -80 ° C에 냉동 투입 될 때까지이어서, 종양이 중 다이되지 않도록 얼음 생존 종양 튜브를 배치 동결 과정. 주 : 장기 저장을 위해 종양을 제거한다 (이 후 - 삼일) 큰 액체 질소 듀어 넣고. 가능한 튜브는 마우스에 주입 추출되지 않는 한 해동 할 수 없습니다 것을 유의하시기 바랍니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 삼.환자 유래 종양 이종 이식의 주입 <ol><li> 각 개별 환자 유래의 종양 8 회 오래 된 남성 및 / 또는 여성 무 흉선 누드 마우스 (부족 T 세포) - 오 (6)을 사용합니다. 10 종양의 총 (마우스 당 2 주사) 피하 (SQ)를 주입한다. 주 : 원래 인간 종양 F0로 지정하고 한번 차세대 F1 인 쥐에 주입된다. 또한, 각각의 고유 한 이식편에 대한 멸균 된 집게, 가위, 및 트로 카를 사용합니다. </li><li> 멸균 12 G의 트로 카를로 젤라틴 단백질 혼합 용액에서 종양의로드 조각은 종양이 완전히 투관침에 밀려되어 있는지 확인합니다. <ol><li> (마취의 유지를 위해 3 % 아이소 플루 란 - - 4 %의 산소 및 2 5 %의 초기 속도 아이소 플루 란에서 시작 3) 멸균 층류 후드에있어서, 이소 플루 란 마취 기계에 접속 된 마취 상자에 마우스 5 마리를 올려 숯 필터 (과잉 가스를 흡수). 참고 : 숙련 된 기술자에 전체 절차를 수행 할 수 있어야한다약 5 분 총 (마우스 당 약 30 초)에서 5 쥐의 케이지. 따라서 추가로 열 지원과 눈 윤활은 일반적으로 사용되지 않습니다. 경험이 적은 개인 또는 훈련 기간 동안, 매우 개인이 한 번에 적은 동물의 절차를 수행 및 / 또는 동물이 5 분보다 더 오래 마취 될 경우 절차를 수행하는 동안 온난화 패드 / 아이 윤활을 사용하거나하는 것이 좋습니다. 절차는 우리 대학에서 IACUC 표준을 기반으로합니다. </li></ol></li><li> 마우스가 더 이상 응답 없도록 마우스 발가락을 꼬집어 후 아이소 플루 란 상자에서 마우스를 가져 가라. 옆구리 영역은 멸균 12 G의 트로 카를에 도달 할 때까지 중간 지느러미 목 영역 아래 피하 투관침을 슬라이딩에 종양을 주입하는 깨끗한 필드에 마우스를 놓습니다. <ol><li> 마우스의 측면의 각 측면에 하나의 종양 피하을 제공합니다. 투관침은 종양 원하는 측면 영역에 남아 있음을 보장 인출 될 때 종양 핀치. GE의latinous 단백질 혼합물을 마우스의 신체 온도 경화 및 종양 성장에 도움 SQ 및 결합 조직에 고정하기 위해 약 1 주간 종양을 캡슐화한다. 투관침에 의해 병변 4mm보다 크지 않으며 스테이플 피부에 가까이 할 필요가 없다. 주 : 우리 수의사가 더 클로저가 병변의 매우 작은 크기에 기초하지 필요 결정된 짧은 치료 시간이 기간 동안, 기록없이 감염, 및 동물의 근접 모니터링 (중간 등쪽 넥 영역은 피부에 긴장이나 병변 정리 감소) . </li></ol></li><li> 마우스를 멀리 종양 주사 부위에서 완전히 깨어 분사 멜 록시 캄 2 ㎎ / ㎏ SQ (진통제)을하기 전에. 다음으로, 케이지에 마우스를 놓고 마우스가 깨어 및 이동 될 때까지 모니터링 할 수 있습니다. 참고 : 완전히 깨어 때까지 무인 동물을 회복 두지 마십시오. 멜 록시 캄의 투여 량은 우리 대학에서 IACUC 표준을 기반으로합니다. <ol><li> 다음으로,도 4와 같은 절차를 반복마우스를 나머지 자신의 호흡을 모니터링 할 수 있습니다. 참고 :이 매우 빠른 절차 및 마우스 멜 록시 캄 주입 후 곧 깨어 있습니다,하지만 필요에 따라 아이소 플루 란을 조정하십시오. 마우스 취출 때마다, 아이소 플루 란 거절. 멜 록시 캄은 24 시간 지속되고 트로 카를에서 병변은 완전 일주에 치유 할 것이다. </li></ol></li></ol> 환자 유래 종양 이종 이식 은행 4. 유지 보수 <ol><li> 적어도 일주일에 한 번 쥐의 성장과 건강을 모니터링합니다. 종양의 크기, 종양의 생성, 종양 주입의 날짜 및 마우스의 건강을 추적하는 스프레드 시트 (또는 다른 추적 시스템)를 사용합니다. 참고 : 마우스는 15 원래 체중 %, 낮은 신체 조건 점수 (≥ 2)를 분실 한 경우, 종양 궤양, 종양은 2,000mm 3 또는 전체 종양 3,000mm 3, 웅크 (병약하고, 감기, 혼수 등을 도달했다 .) 임의의 방식에서, 마우스 CO₂ 통해 안락사 또는 경부 전위로 하였다 마취econdary 방법. 종양을 수집하고, 그렇지 않은 생쥐 CO₂ 경부 탈구를 통해 안락사 경우 마취 경추 탈구를 통해 안락사. </li><li> 종양은 위에서 설명한 후 안락사하는 자궁 경부 전위를 수행으로 약 1,500-2,000 mm 3 마취 마우스 인 경우. <ol><li> 마우스가 하트 비트가 없음을 확인합니다. 멸균 가위와 집게와 SQ 종양을 절제. 참고 : 허용 종양은 최대 1 년 성장하고 더 종양이 보이지 않는 경우 다음 두 번째 방법으로 자궁 경부 전위 다음 CO 2를 통해 쥐를 안락사합니다. </li><li> 통로 (5 마우스의 새로운 세트 일명) 다음 세대로 성장하는 종양 가장. 전달 12 종양 또한 상술 한 바와 같이 후 남은 종양을 수집 - 사용 설명서 위 (10)를 수집합니다. 참고 : 다수의 가능한 튜브를 수집하는 초기 세대 (F1 - F8)에서 매우 중요하다; 따라서 여러 가능한 튜브, FF 튜브 및 generat라는 당 1 FFPE를 수집이온. </li><li> 마우스의 새로운 세대는 약 300mm 3의 종양 성장이 때까지 남아있는 쥐를 유지합니다. 나머지 마우스 큰 종양이있는 경우, 전술 한 바와 같이 계속 수집. </li></ol></li><li> 통로 종양에 계속 F15까지 각 단계에서 수집합니다. 이 시점에서, 액체 질소 중 가능한 초기 세대의 가능한 튜브를 타고 얼음에 해동을하게 상술 종양 주입 절차를 따르십시오. 가능한 튜브에서 성장 종양은 세대에서 세대로 전달에 비해 쥐에서 성장하는 데 시간이 더 걸릴 수 있으므로 계획 할 때 염두에 두십시오 있습니다. 특정 PDTX 모델은 더 이상 통과에 필요한 경우 안락사 않고 수많은 가능한 튜브는 장래의 사용을 위해 회수되도록하는 종양을 수집한다. </li></ol> 환자 유래 종양 이종 이식 5. 발달 치료 참고 : F3 세대에서 대부분의 종양이 좋은 성장 속도론은 (더 빠르고 공동 성장이nsistent) 따라서, 약물의 효능 연구를 PDTX로 진행합니다. <ol><li> 원하는 종양이 매우 큰 경우 (1500 - 2,000mm 3), 마우스의 원하는 양으로 확장하는 종양를 수집하기 위해 위의 절차를 따르십시오. <ol><li> 상기 가정에 따라서 처리 군마다 필요한 종양의 수를 결정 시험된다. 주 : 단백질이 젤라틴 혼합액 1 ㎖를 마우스에 주입하기 위해 약 30 피트의 작은 조각 종양 (종양 형태에 의존) 할 수있다. </li></ol></li><li> 주간 종양으로 쥐를 확인 대부분의 종양은 (50 사이에 약 - 300 mm³) 눈에 띄게 작은 경우 종양 부피를 결정하는 캘리퍼스와 함께 종양을 측정한다. 종양의 부피 = [width² (최소 측정) × 길이 (최대 측정)] 0.52을 X. 주 : 단백질이 젤라틴 혼합물 용액을 일주일의 종양 성장이 정확할 것이다 후 후 일주일 동안 주입 된 종양 부분을 둘러싼 다. </li><li> 300 mm³과 - (50) 사이에 종양 볼륨을 사용하여N 좌우 종양 평균. 이어서 서로 약간 번호 내의 그룹과 그룹 당 평균 10 종양 치료 그룹으로 무작위. 다음으로, 그룹으로 마우스를 정렬하고 원하는 치료 연구를 시작한다. </li><li> 약물 (약물에 따라 일정) 두 번 일주일에, 무게 측정 (종양)와 쥐 선량. 연구의 끝에서, 마취 및 자궁 경부 전위를 통해 쥐를 안락사와 실험실에서 미래의 약력 학적 분석을 위해 종양를 수집합니다. 참고 :이 연구는 차량 종양의 크기와 마우스의 상태에 따라 30 일 동안 지속됩니다. </li></ol> PDTX 은행 6. 조직 <ol><li> 연구 및 동물의 적절한 사용의 반복 방지하기 위해 잘 문서화 된 형태를 유지합니다. 참고 :이 성공적으로 PDTX 은행의 핵심입니다. <ol><li> PDTX 은행의 마우스, 처리, 데이터, 병원에서 인간의 환자에서 종양을 추적하기 위해 스프레드 시트를 사용하여 무엇을 수집한다. 주 :이 냉동 액체 질소 dewars 포함뿐만 아니라, 및 FFPE 저장. </li></ol></li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pharmacological+targeting+of+the+MAP+kinase+and+PI3K/mTOR+pathway+in+preclinical+models+of+colorectal+cancer.">Dual pharmacological targeting of the MAP kinase and PI3K/mTOR pathway in preclinical models of colorectal cancer.</a> PLoS One. 9 (11), e113037 (2014).</li><li>Spreafico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+combination+of+a+MEK+inhibitor,+selumetinib,+and+the+Wnt/calcium+pathway+modulator,+cyclosporin+A,+in+preclinical+models+of+colorectal+cancer.">Rational combination of a MEK inhibitor, selumetinib, and the Wnt/calcium pathway modulator, cyclosporin A, in preclinical models of colorectal cancer.</a> Clin Cancer Res. 19 (15), 4149-4162 (2013).</li><li>Arcaroli, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALDH++tumor-initiating+cells+exhibiting+gain+in+NOTCH1+gene+copy+number+have+enhanced+regrowth+sensitivity+to+a+gamma-secretase+inhibitor+and+irinotecan+in+colorectal+cancer.">ALDH+ tumor-initiating cells exhibiting gain in NOTCH1 gene copy number have enhanced regrowth sensitivity to a gamma-secretase inhibitor and irinotecan in colorectal cancer.</a> Mol Oncol. 6 (3), 370-381 (2012).</li><li>Hoey, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLL4+blockade+inhibits+tumor+growth+and+reduces+tumor-initiating+cell+frequency.">DLL4 blockade inhibits tumor growth and reduces tumor-initiating cell frequency.</a> Cell Stem Cell. 5 (2), 168-177 (2009).</li><li>Ikebuchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+c-Met+phosphotyrosine+sites+in+human+cells+in+response+to+mouse+hepatocyte+growth+factor+but+not+human+hepatocyte+growth+factor:+the+possible+roles+of+different+amino+acids+in+different+species.">Dissociation of c-Met phosphotyrosine sites in human cells in response to mouse hepatocyte growth factor but not human hepatocyte growth factor: the possible roles of different amino acids in different species.</a> Cell Biochem Funct. 31 (4), 298-304 (2013).</li><li>Zhang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+growth+of+human+met-expressing+xenografts+in+a+new+strain+of+immunocompromised+mice+transgenic+for+human+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor.">Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor.</a> Oncogene. 24 (1), 101-106 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

PDTX 신약 개발 플랫폼은 신규 화합물의 임상 활동을 예측 신뢰할 수없는 다른 전임상 모델의 단점을 개선 모델을 제공합니다. 중요한 것은,이 모델에서 종양이 생물학적으로 안정, 전이성 잠재력을 보유하고 세대 유사한 약물 반응성을 나타낸다. 이 모델에서, 환자 유래의 종양은 무 흉선 누드 마우스에 주사 계대하고,이어서 치료의 평가에 사용된다. 등 성공적인 PDTX 은행에 대한 몇 가지 중요한 ...

대장 암 (CRC)는 미국에서 암 사망에 크게 기여. 2015 년, 49,700 사망 1 CRC의 예상 132,700 새로운 사례가 있었다. 국소 질환 환자의 예후가 우수하지만, 고급 질환 환자는 신규 치료법의 개발이 중요한 우선 순위 결정, 불량한 결과를 갖는다. 치료 화학 요법이 질병에 배포 된 새로운 생물학적 제제의 기준에도 불구하고, 전체 생존 만 증분 증가하고있다. 따라서,이 질병에서 종양 성장을 촉진 관련된 드라이버 경로를 이해하는데 상당한 노력이 존재한다. 암 게놈 아틀라스 네트워크는 최근 다수의 주요 CRC의 이상 조절에 관여하고 포함하는 경로 확인했습니다 : WNT를, 포스 3- 키나제 (PI3K), RAS, 변형 성장 인자 β (TGF-β의)와 TP53 2. 함께 조사는 오티 설명과 함께CRC 성장을 강화할 그녀의 경로를 크게이 환자군 3-5 생존을 개선하기위한 새로운 치료법의 개발을 촉발 하였다. 종양 치료제 개발에 활용 전임상 모델은 이러한 신규 한 화합물의 임상 적 활성을 예측하는 과정이 필수적이었다. 다양한 전임상 모델은 신약 개발 과정에서 사용되어왔다. 전임상 트랜스 제닉 동물 모델 및 세포주 크게 때문에 인간 종양의 복잡도를 반영하기 위해 자신의 무능력을, 신규 종양 치료법의 임상 적 활성을 결정하는데 성공적이지 않은 불멸화 것을 고려하면, 환자 유래의 종양 이종 이식 (PDTX) 모델이 확립되었다. 이 모델의 가장 큰 장점은 종양 이질성은 그대로 유지하고 밀접하게 원래 환자 종양 6-9의 분자 특성과 clonality을 반영하는 것입니다. PDTX 모델은 생체 내에서 우수한을 제공전임상 플랫폼은 새로운 에이전트, 약물 내성 경로, 조합 전략, 암 줄기 세포 생물학 (10)을 공부한다. PDTX 공정의 일반적인 개요는도 1에 도시되어있다. 또한, 병원에서 시작 그 초과 종양 조직이 일부 연구에 사용될 수 있도록 환자 동의. 다음으로, 수술로 종양의 조각은 병리학 자에 의해 싫어할하고 연구 인력으로 운반 할 미디어에 넣어. 바로 그 후, 종양의 단면은 작은 조각으로 절단하고, 면역 결핍 마우스의 피하에 이식. 종양 성장 후에는 종양 (10)을 유지하기 위해 다른 세대의 마우스로 계대된다. 전형적으로, F3 생성 후에 종양은 신규 화합물 및 / 또는 조합 치료를 평가 치료 연구로 확장 될 수있다. 활용하여 차세대 서열 (엑솜 서열, RNA 서열과 SNP 어레이) 가능성 예측 바이오 마커 발견하다특정 치료에서 효과를 유도 할 수있다 환자의 선택에 도움 에디션. 1) 단일 에이전트로 또는 조합하여 새로운 치료법의 효능을 평가하고 2) 이전에 임상 시험에 대한 민감도 또는 저항의 예측 바이오 마커를 식별 : PDTX 모델을 사용하는 무엇보다 중요한 목표로합니다. 이 논문에서, 우리는 CRC PDTX 은행의 개시 및 유지 보수 방법론을 제공하고 신약 개발의 발견이 모델의 장점과 한계를 제공합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54393/54393fig1.jpg" /> CRC를 PDTX 모델 프로토콜의 그림 1. 개요. 환자 유래의 종양은 수술받은 즉시 피하 무 흉선 누드 마우스에 주입된다. 종양이 성장하면 그것은 다음 세대로 확장하고 결국 치료 연구에 확장됩니다. 치료 RESPONSE를을 평가하고 예측 바이오 마커는. 환자 선택에 도움을 수 식별 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54393/54393fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>RPMI or DMEM</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>Thaw in -4 &amp;deg;C, then activate for 30 min at 60 &amp;deg;C water bath</td></tr><tr><td>CPT blood tube</td><td>BD vacutainer</td><td>362761</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>Surelock</td><td>A-7002</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cyrogenic vials</td><td>Cyroking</td><td>C0732901</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tumor cutting dish</td><td>Trueline</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5881</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (gelatinous protein mixture)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Store at -20 or -80 &amp;deg;C, then thaw on ice, do not leave at RT</td></tr><tr><td>10% Formalin cups</td><td>Protocol</td><td>032-059</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen Dewar Storage</td><td>Thermolyne</td><td>CY50900</td><td></td></tr><tr><td>Portable liquid nitrogen dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-2000</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fischer</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Freezing container: Mr Frosty</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>Decon</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Trocars</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia machine</td><td>Patterson Veterinary</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia box</td><td>Patterson Veterinary</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>1038005</td><td></td></tr><tr><td>F-Air Canister</td><td>Bickford Omnicon</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Vet one</td><td>5182-90C</td><td></td></tr><tr><td>Calipers</td><td>Fowler</td><td>54-100-167</td><td></td></tr><tr><td>Weight scale</td><td>Ohaus</td><td>Scout Pro SP601</td><td></td></tr></tbody></table>

development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor pieces are injected subcutaneously into athymic nude mice (immunocompromised, T cell deficient) to create a bank of tumors and subsequently are passaged into different generations of mice in order to maintain these tumors from patients. Importantly, cellular heterogeneity of the original tumor is closely emulated in this model, which provides a more clinically relevant model for evaluation of drug efficacy studies (single agent and combination), biomarker analysis, resistant pathways and cancer stem cell biology. Some limitations of the PDTX model include the replacement of the human stroma with mouse stroma after the first generation in mice, inability to investigate treatment effects on metastasis due to the subcutaneous injections of the tumors, and the lack of evaluation of immunotherapies due to the use of immunocompromised mice. However, even with these limitations, the PDTX model provides a powerful preclinical platform in the drug discovery process.

CRC를 PDTX 모델과 TCGA에있는 일반적인 돌연변이의 유사점 우리는 CRC PDTX 은행에서 일반적으로 돌연변이 (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 및 TP53)의 비율은 CRC 환자 집단에서 볼 수있는 돌연변이 주파수를 대표했다 여부를 조사 하였다. 도 2A (TCGA) 및 B (CRC PDTX 뱅크)에 도시 된 바와 같이, ...

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Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

피하 전임상 모델에서 환자 유래 종양을 활용하여 새로운 치료법, 예측 바이오 마커의 발견 및 약제 내성 경로의 효능을 연구 할 수있는 좋은 방법입니다. 이 모델은 신약 개발 과정에서 임상 시험에 앞서 많은 신규 항암 요법의 운명을 결정하는데 중요하다.

전임상 환자 유래 종양 소설 안티 - 암 치료의 조사를위한 이종 이식 모델의 개발 및 유지 보수

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.6K 조회수.  University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus.  피하 전임상 모델에서 환자 유래 종양을 활용하여 새로운 치료법, 예측 바이오 마커의 발견 및 약제 내성 경로의 효능을 연구 할 수있는 좋은 방법입니다. 이 모델은 신약 개발 과정에서 임상 시험에 앞서 많은 신규 항암 요법의 운명을 결정하는데 중요하다. 

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Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients' tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.

We describe a method for stable labeling of patient-derived xenografts (PDXs) with lentiviral particles expressing green-fluorescent protein and luciferase reporters. This method allows for tracking the growth of PDXs at the primary site, as well as detecting spontaneous and experimental metastases using in vivo imaging systems.

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

연구

암 연구학

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard subcutaneous flank models include procedural ease and the ability to monitor tumor progression and response without invasive imaging. Such models are often inconsistent in translational clinical trials and have limited biologically relevant characteristics with low proclivity to produce metastasis, as there is a lack of a native microenvironment. In comparison, orthotopic xenograft models at native tumor sites have been shown to mimic the tumor microenvironment and replicate important disease characteristics such as distant metastatic spread. These models often require tedious surgical procedures with prolonged anesthetic time and recovery periods. To address this, cancer researchers have recently utilized ultrasound-guided injection techniques to establish cancer xenograft models for preclinical experiments, which allows for rapid and reliable establishment of tissue-directed murine models. Ultrasound visualization also provides a noninvasive method for longitudinal assessment of tumor engraftment and growth. Here, we describe the method for ultrasound-guided injection of cancer cells, utilizing the adrenal gland for NB and renal sub capsule for ES. This minimally invasive approach overcomes tedious open surgery implantation of cancer cells in tissue-specific locations for growth and metastasis, and abates morbid recovery periods. We describe the utilization of both established cell lines and patient derived cell lines for orthotopic injection. Pre-made commercial kits are available for tumor dissociation and luciferase tagging of cells. Injection of cell suspension using image-guidance provides a minimally invasive and reproducible platform for the creation of preclinical models. This method is utilized to create reliable preclinical models for other cancers such as bladder, liver and pancreas exemplifying its untapped potential for numerous cancer models.

Here, we present a protocol to utilize ultrasound-guided injection of neuroblastoma (NB) and Ewing's sarcoma (ES) cells (established cell lines and patient-derived tumor cells) at biologically relevant sites to create reliable preclinical models for cancer research.

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture vessels versus in vivo in human patients. This is due to the bottleneck selection of clonal populations of melanoma cells that can robustly grow in vitro in the absence of physiological conditions. Further, responses to therapy in two-dimensional tissue cultures overall do not faithfully reflect responses to therapy in melanoma patients, with the majority of clinical trials failing to show the efficacy of therapeutic combinations shown to be effective in vitro. Although xenografting of melanoma cells into mice provides the physiological in vivo context absent from two-dimensional tissue culture assays, the melanoma cells used for engraftment have already undergone bottleneck selection for cells that could grow under two-dimensional conditions when the cell line was established. The irreversible alterations that occur as a consequence of the bottleneck include changes in growth and invasion properties, as well as the loss of specific subpopulations. Therefore, models that better recapitulate the human condition in vivo may better predict therapeutic strategies that effectively increase the overall survival of patients with metastatic melanoma. The patient-derived xenograft (PDX) technique involves the direct implantation of tumor cells from the human patient to a mouse recipient. In this manner, tumor cells are consistently grown under physiological stresses in vivo and never undergo the two-dimensional bottleneck, which preserves the molecular and biological properties present when the tumor was in the human patient. Notable, PDX models derived from organ sites of metastases (i.e., brain) display similar metastatic capacity, while PDX models derived from therapy naive patients and patients with acquired resistance to therapy (i.e., BRAF/MEK inhibitor therapy) display similar sensitivity to therapy.

Patient-derived xenograft (PDX) models more robustly recapitulate melanoma molecular and biological features and are more predictive of therapy response compared to traditional plastic tissue culture-based assays. Here we describe our standard operating protocol for the establishment of new PDX models and the characterization/experimentation of existing PDX models.

흑색종 환자 유래 이종이식 모델

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic target analyses and drug response monitoring using patient derived xenografts (PDX). This strategy was validated using ovarian tumors as an example. The mate-pair next generation sequencing (MPseq) protocol was used to identify structural alterations and followed by analysis of potentially targetable alterations. Human tumors grown in immunocompromised mice were treated with drugs selected based on the genomic analyses. Results demonstrated a good correlation between the predicted and the observed responses in the PDX model. The presented approach can be used to test the efficacy of combination treatments and aid personalized treatment for patients with recurrent cancer, specifically in cases when standard therapy fails and there is a need to use drugs off label.

Here we present a protocol to test the efficacy of targeted therapies selected based on the genomic makeup of a tumor. The protocol describes identification and validation of structural DNA rearrangements, engraftment of patients&#8217; tumors into mice and testing responses to corresponding drugs.

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires a platform for preclinical research. Over recent years, we have established a biobank of colorectal and pancreatic cancers comprising of primary tumor tissue, normal tissue, sera, isolated peripheral blood lymphocytes (PBL), patient-derived xenografts (PDX), as well as primary and secondary cancer cell lines. Since original tumor tissue is limited and the establishment rate of primary cancer cell lines is still relatively low, PDX allow not only the preservation and extension of the biobank but also the generation of secondary cancer cell lines. Moreover, PDX-models have been proven to be the ideal in vivo model for preclinical drug testing. However, biobanking requires careful preparation, strict guidelines and a well attuned infrastructure. Colectomy, duodenopancreatectomy or resected metastases specimens are collected immediately after resection and transferred to the pathology department. Respecting priority of an unbiased histopathological report, at the discretion of the attending pathologist who carries out the dissections, small tumor pieces and non-tumor tissue are harvested. 
Necrotic parts are discarded and the remaining tumor tissue is cut into small, identical cubes and cryopreserved for later use. Additionally, a small portion of the tumor is minced and strained for primary cancer cell culture. Additionally, blood samples drawn from the patient pre- and postoperatively, are processed to obtain serum and PBLs. For PDX engraftment, the cryopreserved specimens are defrosted and implanted subcutaneously into the flanks of immunodeficient mice. The resulting PDX closely recapitulate the histology of the "donor" tumors and can be either used for subsequent xenografting or cryopreserved for later use. In the following work, we describe the individual steps of creation, maintenance and administration of a large biobank of colorectal and pancreatic cancer. Moreover, we highlight the crucial details and caveats associated with biobanking.

In the following work, we describe the consecutive steps necessary for the establishment of a large biobank of colorectal and pancreatic cancer.

살아있는 바이오 뱅크의 창조 및 유지 보수 - 우리가 그것을 하는 방법

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully preserve the histological and genetic characteristics of the primary tumor and maintain its heterogeneity. Pharmacodynamic results based on PDX models are highly correlated with clinical practice. Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is the most malignant subtype of thyroid cancer, with strong invasiveness, poor prognosis, and limited treatment. Although the incidence rate of ATC accounts for only 2%-5% of thyroid cancer, its mortality rate is as high as 15%-50%. Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is one of the most common head and neck malignancies, with over 600,000 new cases worldwide each year. Herein, detailed protocols are presented to establish PDX models of ATC and HNSCC. In this work, the key factors influencing the success rate of model construction were analyzed, and the histopathological features were compared between the PDX model and the primary tumor. Furthermore, the clinical relevance of the model was validated by evaluating the in vivo therapeutic efficacy of representative clinically used drugs in the successfully constructed PDX models.

The present protocol establishes and characterizes a patient-derived xenograft (PDX) model of anaplastic thyroid carcinoma (ATC) and head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), as PDX models are rapidly becoming the standard in the field of translational oncology.

역형성 갑상선 암종 및 두경부 편평 세포 암종의 환자 유래 이종 이식 모델의 확립 및 특성화

Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully preserve the histological and genetic characteristics of the primary tumor and maintain its ...

<meta charset="utf8"></head><body>환자 유래 흑색종 오가노이드: 암 면역 요법의 최전선

Unveiling Therapeutic Opportunities with Melanoma Patient-derived Organoid Models

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While traditional two- and three-dimensional models can offer insights into cancer development and progression, these lack crucial aspects that hinder a faithful mimic of native tumors. An alternative model that has gained a lot of attention is the patient-derived organoid. The development of these organoids recapitulates the complex intercellular communication, tumor microenvironment, and histoarchitecture of tumors. This paper describes the protocol for establishing melanoma patient-derived organoid (MPDO) models. To validate these models, we assessed the immune cell composition, including the expression levels of T-cell activation markers, to confirm the cellular heterogeneity of the organoids. Additionally, to describe the potential utility of MPDOs in cellular therapies, we evaluated the cytotoxic capabilities of treating the organoids with &#947;&#948; T-cells. In conclusion, the MPDO models offer promising avenues for understanding tumor complexity, validating therapeutic strategies, and potentially advancing personalized treatment.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 면역요법 평가를 위한 환자 유래 오가노이드를 사용한 흑색종 복잡성 재현

Here, we present a protocol to generate melanoma patient-derived organoids by culturing disassociated cell suspensions from fresh melanoma tissues. These organoids faithfully recapitulate patient-specific tumors in vitro, offering an innovative approach to exploring tumor immunosuppressive mechanisms, drug screening, drug resistance mechanisms, and cancer surveillance approaches.

흑색종 환자 유래 오가노이드 모델을 통한 치료 기회 발굴

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While ...

전임상 환자 유래 종양 소설 안티 - 암 치료의 조사를위한 이종 이식 모델의 개발 및 유지 보수

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흑색종 환자 유래 이종이식 모델

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살아있는 바이오 뱅크의 창조 및 유지 보수 - 우리가 그것을 하는 방법

역형성 갑상선 암종 및 두경부 편평 세포 암종의 환자 유래 이종 이식 모델의 확립 및 특성화

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