This work was supported by grant 1R01CA152303-01.

윤리 정책 : 환자 유래 대장 선암 종양 표본이 콜로라도 여러 임상 시험 심사위원회 (08-0439)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 콜로라도 병원의 대학에서 환자 동의에서 얻었다. 모든 동물의 작업은 콜로라도 덴버 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인 동물 프로토콜에 따라 수행 하였다 (IACUC, 프로토콜 # 51412 (06) 1E와 96813 (04) 1E). 1. 받기 및 환자 혈액을 준비 <ol><li> 한 수집 -이 구연산 나트륨을 함유하는 혈액 / 세포 분리 튜브에서 혈액 ㎖ (플라즈마, 림프구 및 단핵구 밴드 밀도 구배 유체, 겔 차단 및 적혈구 및 호중구가 포함 된 튜브 상이다). 주의, 혈액이나 조직과 혈액 매개 병원체의 지침을 따르십시오. 참고 : PBMC를 플라즈마를 포함 할 수있다 미래 연구에 사용될 수 있습니다 : 종양 돌연변이와 생식 세포 유전 적 변이를 비교, circula를 분리등 무 세포 DNA (cfDNA) 검사 단백질 마이크로 RNA, 평가 팅 종양 세포. </li><li> RT 없음 브레이크 15 분 동안 2,500 XG에서 혈액 / 세포 분리 튜브를 원심 분리기. </li><li> 말초 혈액 단핵 세포를 (림프구 및 튜브의 단핵구 대역에서 PBMC를)를 수집하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관 (일반, 오토 클레이브, DNase의,의 RNase 및 발열 무료)에 넣어 멸균 인산 완충와 튜브의 상단에 기입 식염수 (PBS). <ol><li> RT에서 3 분 동안 2300 × g으로 원심 분리 튜브의 하단의 한 PBMC 펠릿을 형성 하였다. 다음, 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 30 초 동안 3,000 XG에 펠렛 원심 분리기를 씻어 멸균 PBS 1 ML을 추가 한 다음 상층 액을 제거합니다. </li></ol></li><li> 1.5 ml의 멸균 극저온 유리 병에 (튜브의 플라즈마 단계에서) 혈액 / 세포 분리 튜브에서 플라즈마를 수집하는 피펫을 사용하여 (DNase의와의 RNase 무료, 아니 인간의 DNA, 내 독소 무료) 및로 PMBC의의 플라즈마와 펠렛을 넣어 -80 ° C (F)저장 Freezer (냉동실). </li></ol> 2. 받기 및 환자 종양 샘플 준비 <ol><li> 준비 RPMI 또는 DMEM 미디어 1 다음 중 하나 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 비 필수 아미노산의 100 (10 %), 1 : 1000 (1 %) Plasmocin, 10 % 불 활성화 태아 소 혈청 (전체 미디어) 및 추가 20-25 종양 표본에 대한 멸균 컬렉션 컵 ml의. </li><li> 얼음에 완전한 미디어를 포함하는 살균 컵에 종양 샘플을 검색하거나 4 ℃에서 보관하십시오. 주 : 종양 샘플, 외과 의사에 의해 제거 병리학 자에 의해 처리하고, 완전한 미디어 무균 수거 컵에 배치되어 과잉 환자 종양 조직의 한 조각이다. 주의, 혈액이나 조직과 혈액 매개 병원체의 지침을 따르십시오. 또한, 이상적으로 다섯 마우스를 주입, 종양은 약 1 ㎤의해야합니다. </li><li> 면역 저하 쥐에 주입 동물 시설에 종양 샘플을 가져와. 주 : 최대한 빨리 종양 샘플을 처리하는 것이 최상이다. <ol><li> 층류 후드에서 종양 컵에서 멸균 플라스틱 가공 접시에 종양 샘플을 놓는다. 젤라틴 단백질 혼합 용액 300 ㎕를 가득 멸균 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 12 약 3 × 3 × 3mm 조각과 배치 - 10로 절단하는 오토 클레이브 - 작은 가위와 집게를 사용합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 우선 순위로 마우스에 종양을 주입하지만, 남아있는 종양이 존재하는 경우, 플래시 냉동 바이알 (FF), 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 컵 및 실행 가능한 종양 병을 수집합니다. </li><li> FF를 들어, 단백질, RNA 또는 DNA 분리와 같은 추가 분석을 위해 멸균 저온 유리 병에서 종양 조직의 작은 조각을 수집합니다. 액체 질소 듀어에 즉시 FF를 배치하고 장기 보관 -80 C의 냉동고 °. </li><li> FFPE 들어 충분한 종양, 위 종양, 적어도 24 시간 동안 포르말린되면 파라핀 블록에 10 ml의 10 % 포르말린 컵 프로세스로 3 작은 조각이됩니다. 참고 : 24 시간을 기반으로우리의 조직학 코어의 제안 11 끕니다. </li><li> 마지막으로, 극저온 튜브에 남아있는 종양을 배치합니다. 미디어를 완료하는 데 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 추가하여 가능한 미디어를 확인합니다. 다음으로, 극저온 튜브에 1 ml에 추가하고 얼음에 저장합니다. 주 : 오랜 시간 동안 얼음에 보관하지 마십시오. <ol><li> 10 종양이 향후 5 생쥐에 주입하는 이상적으로 충분합니다 작은 조각으로 남은 종양을 잘라. 이를 이소 프로필 알코올 냉동 컨테이너 (천천히 한번에 종양 1 °의 C를 정지)에 넣고, -80 ° C에 냉동 투입 될 때까지이어서, 종양이 중 다이되지 않도록 얼음 생존 종양 튜브를 배치 동결 과정. 주 : 장기 저장을 위해 종양을 제거한다 (이 후 - 삼일) 큰 액체 질소 듀어 넣고. 가능한 튜브는 마우스에 주입 추출되지 않는 한 해동 할 수 없습니다 것을 유의하시기 바랍니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 삼.환자 유래 종양 이종 이식의 주입 <ol><li> 각 개별 환자 유래의 종양 8 회 오래 된 남성 및 / 또는 여성 무 흉선 누드 마우스 (부족 T 세포) - 오 (6)을 사용합니다. 10 종양의 총 (마우스 당 2 주사) 피하 (SQ)를 주입한다. 주 : 원래 인간 종양 F0로 지정하고 한번 차세대 F1 인 쥐에 주입된다. 또한, 각각의 고유 한 이식편에 대한 멸균 된 집게, 가위, 및 트로 카를 사용합니다. </li><li> 멸균 12 G의 트로 카를로 젤라틴 단백질 혼합 용액에서 종양의로드 조각은 종양이 완전히 투관침에 밀려되어 있는지 확인합니다. <ol><li> (마취의 유지를 위해 3 % 아이소 플루 란 - - 4 %의 산소 및 2 5 %의 초기 속도 아이소 플루 란에서 시작 3) 멸균 층류 후드에있어서, 이소 플루 란 마취 기계에 접속 된 마취 상자에 마우스 5 마리를 올려 숯 필터 (과잉 가스를 흡수). 참고 : 숙련 된 기술자에 전체 절차를 수행 할 수 있어야한다약 5 분 총 (마우스 당 약 30 초)에서 5 쥐의 케이지. 따라서 추가로 열 지원과 눈 윤활은 일반적으로 사용되지 않습니다. 경험이 적은 개인 또는 훈련 기간 동안, 매우 개인이 한 번에 적은 동물의 절차를 수행 및 / 또는 동물이 5 분보다 더 오래 마취 될 경우 절차를 수행하는 동안 온난화 패드 / 아이 윤활을 사용하거나하는 것이 좋습니다. 절차는 우리 대학에서 IACUC 표준을 기반으로합니다. </li></ol></li><li> 마우스가 더 이상 응답 없도록 마우스 발가락을 꼬집어 후 아이소 플루 란 상자에서 마우스를 가져 가라. 옆구리 영역은 멸균 12 G의 트로 카를에 도달 할 때까지 중간 지느러미 목 영역 아래 피하 투관침을 슬라이딩에 종양을 주입하는 깨끗한 필드에 마우스를 놓습니다. <ol><li> 마우스의 측면의 각 측면에 하나의 종양 피하을 제공합니다. 투관침은 종양 원하는 측면 영역에 남아 있음을 보장 인출 될 때 종양 핀치. GE의latinous 단백질 혼합물을 마우스의 신체 온도 경화 및 종양 성장에 도움 SQ 및 결합 조직에 고정하기 위해 약 1 주간 종양을 캡슐화한다. 투관침에 의해 병변 4mm보다 크지 않으며 스테이플 피부에 가까이 할 필요가 없다. 주 : 우리 수의사가 더 클로저가 병변의 매우 작은 크기에 기초하지 필요 결정된 짧은 치료 시간이 기간 동안, 기록없이 감염, 및 동물의 근접 모니터링 (중간 등쪽 넥 영역은 피부에 긴장이나 병변 정리 감소) . </li></ol></li><li> 마우스를 멀리 종양 주사 부위에서 완전히 깨어 분사 멜 록시 캄 2 ㎎ / ㎏ SQ (진통제)을하기 전에. 다음으로, 케이지에 마우스를 놓고 마우스가 깨어 및 이동 될 때까지 모니터링 할 수 있습니다. 참고 : 완전히 깨어 때까지 무인 동물을 회복 두지 마십시오. 멜 록시 캄의 투여 량은 우리 대학에서 IACUC 표준을 기반으로합니다. <ol><li> 다음으로,도 4와 같은 절차를 반복마우스를 나머지 자신의 호흡을 모니터링 할 수 있습니다. 참고 :이 매우 빠른 절차 및 마우스 멜 록시 캄 주입 후 곧 깨어 있습니다,하지만 필요에 따라 아이소 플루 란을 조정하십시오. 마우스 취출 때마다, 아이소 플루 란 거절. 멜 록시 캄은 24 시간 지속되고 트로 카를에서 병변은 완전 일주에 치유 할 것이다. </li></ol></li></ol> 환자 유래 종양 이종 이식 은행 4. 유지 보수 <ol><li> 적어도 일주일에 한 번 쥐의 성장과 건강을 모니터링합니다. 종양의 크기, 종양의 생성, 종양 주입의 날짜 및 마우스의 건강을 추적하는 스프레드 시트 (또는 다른 추적 시스템)를 사용합니다. 참고 : 마우스는 15 원래 체중 %, 낮은 신체 조건 점수 (≥ 2)를 분실 한 경우, 종양 궤양, 종양은 2,000mm 3 또는 전체 종양 3,000mm 3, 웅크 (병약하고, 감기, 혼수 등을 도달했다 .) 임의의 방식에서, 마우스 CO₂ 통해 안락사 또는 경부 전위로 하였다 마취econdary 방법. 종양을 수집하고, 그렇지 않은 생쥐 CO₂ 경부 탈구를 통해 안락사 경우 마취 경추 탈구를 통해 안락사. </li><li> 종양은 위에서 설명한 후 안락사하는 자궁 경부 전위를 수행으로 약 1,500-2,000 mm 3 마취 마우스 인 경우. <ol><li> 마우스가 하트 비트가 없음을 확인합니다. 멸균 가위와 집게와 SQ 종양을 절제. 참고 : 허용 종양은 최대 1 년 성장하고 더 종양이 보이지 않는 경우 다음 두 번째 방법으로 자궁 경부 전위 다음 CO 2를 통해 쥐를 안락사합니다. </li><li> 통로 (5 마우스의 새로운 세트 일명) 다음 세대로 성장하는 종양 가장. 전달 12 종양 또한 상술 한 바와 같이 후 남은 종양을 수집 - 사용 설명서 위 (10)를 수집합니다. 참고 : 다수의 가능한 튜브를 수집하는 초기 세대 (F1 - F8)에서 매우 중요하다; 따라서 여러 가능한 튜브, FF 튜브 및 generat라는 당 1 FFPE를 수집이온. </li><li> 마우스의 새로운 세대는 약 300mm 3의 종양 성장이 때까지 남아있는 쥐를 유지합니다. 나머지 마우스 큰 종양이있는 경우, 전술 한 바와 같이 계속 수집. </li></ol></li><li> 통로 종양에 계속 F15까지 각 단계에서 수집합니다. 이 시점에서, 액체 질소 중 가능한 초기 세대의 가능한 튜브를 타고 얼음에 해동을하게 상술 종양 주입 절차를 따르십시오. 가능한 튜브에서 성장 종양은 세대에서 세대로 전달에 비해 쥐에서 성장하는 데 시간이 더 걸릴 수 있으므로 계획 할 때 염두에 두십시오 있습니다. 특정 PDTX 모델은 더 이상 통과에 필요한 경우 안락사 않고 수많은 가능한 튜브는 장래의 사용을 위해 회수되도록하는 종양을 수집한다. </li></ol> 환자 유래 종양 이종 이식 5. 발달 치료 참고 : F3 세대에서 대부분의 종양이 좋은 성장 속도론은 (더 빠르고 공동 성장이nsistent) 따라서, 약물의 효능 연구를 PDTX로 진행합니다. <ol><li> 원하는 종양이 매우 큰 경우 (1500 - 2,000mm 3), 마우스의 원하는 양으로 확장하는 종양를 수집하기 위해 위의 절차를 따르십시오. <ol><li> 상기 가정에 따라서 처리 군마다 필요한 종양의 수를 결정 시험된다. 주 : 단백질이 젤라틴 혼합액 1 ㎖를 마우스에 주입하기 위해 약 30 피트의 작은 조각 종양 (종양 형태에 의존) 할 수있다. </li></ol></li><li> 주간 종양으로 쥐를 확인 대부분의 종양은 (50 사이에 약 - 300 mm³) 눈에 띄게 작은 경우 종양 부피를 결정하는 캘리퍼스와 함께 종양을 측정한다. 종양의 부피 = [width² (최소 측정) × 길이 (최대 측정)] 0.52을 X. 주 : 단백질이 젤라틴 혼합물 용액을 일주일의 종양 성장이 정확할 것이다 후 후 일주일 동안 주입 된 종양 부분을 둘러싼 다. </li><li> 300 mm³과 - (50) 사이에 종양 볼륨을 사용하여N 좌우 종양 평균. 이어서 서로 약간 번호 내의 그룹과 그룹 당 평균 10 종양 치료 그룹으로 무작위. 다음으로, 그룹으로 마우스를 정렬하고 원하는 치료 연구를 시작한다. </li><li> 약물 (약물에 따라 일정) 두 번 일주일에, 무게 측정 (종양)와 쥐 선량. 연구의 끝에서, 마취 및 자궁 경부 전위를 통해 쥐를 안락사와 실험실에서 미래의 약력 학적 분석을 위해 종양를 수집합니다. 참고 :이 연구는 차량 종양의 크기와 마우스의 상태에 따라 30 일 동안 지속됩니다. </li></ol> PDTX 은행 6. 조직 <ol><li> 연구 및 동물의 적절한 사용의 반복 방지하기 위해 잘 문서화 된 형태를 유지합니다. 참고 :이 성공적으로 PDTX 은행의 핵심입니다. <ol><li> PDTX 은행의 마우스, 처리, 데이터, 병원에서 인간의 환자에서 종양을 추적하기 위해 스프레드 시트를 사용하여 무엇을 수집한다. 주 :이 냉동 액체 질소 dewars 포함뿐만 아니라, 및 FFPE 저장. </li></ol></li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALDH++tumor-initiating+cells+exhibiting+gain+in+NOTCH1+gene+copy+number+have+enhanced+regrowth+sensitivity+to+a+gamma-secretase+inhibitor+and+irinotecan+in+colorectal+cancer.">ALDH+ tumor-initiating cells exhibiting gain in NOTCH1 gene copy number have enhanced regrowth sensitivity to a gamma-secretase inhibitor and irinotecan in colorectal cancer.</a> Mol Oncol. 6 (3), 370-381 (2012).</li><li>Hoey, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLL4+blockade+inhibits+tumor+growth+and+reduces+tumor-initiating+cell+frequency.">DLL4 blockade inhibits tumor growth and reduces tumor-initiating cell frequency.</a> Cell Stem Cell. 5 (2), 168-177 (2009).</li><li>Ikebuchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+c-Met+phosphotyrosine+sites+in+human+cells+in+response+to+mouse+hepatocyte+growth+factor+but+not+human+hepatocyte+growth+factor:+the+possible+roles+of+different+amino+acids+in+different+species.">Dissociation of c-Met phosphotyrosine sites in human cells in response to mouse hepatocyte growth factor but not human hepatocyte growth factor: the possible roles of different amino acids in different species.</a> Cell Biochem Funct. 31 (4), 298-304 (2013).</li><li>Zhang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+growth+of+human+met-expressing+xenografts+in+a+new+strain+of+immunocompromised+mice+transgenic+for+human+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor.">Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor.</a> Oncogene. 24 (1), 101-106 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

PDTX 신약 개발 플랫폼은 신규 화합물의 임상 활동을 예측 신뢰할 수없는 다른 전임상 모델의 단점을 개선 모델을 제공합니다. 중요한 것은,이 모델에서 종양이 생물학적으로 안정, 전이성 잠재력을 보유하고 세대 유사한 약물 반응성을 나타낸다. 이 모델에서, 환자 유래의 종양은 무 흉선 누드 마우스에 주사 계대하고,이어서 치료의 평가에 사용된다. 등 성공적인 PDTX 은행에 대한 몇 가지 중요한 ...

대장 암 (CRC)는 미국에서 암 사망에 크게 기여. 2015 년, 49,700 사망 1 CRC의 예상 132,700 새로운 사례가 있었다. 국소 질환 환자의 예후가 우수하지만, 고급 질환 환자는 신규 치료법의 개발이 중요한 우선 순위 결정, 불량한 결과를 갖는다. 치료 화학 요법이 질병에 배포 된 새로운 생물학적 제제의 기준에도 불구하고, 전체 생존 만 증분 증가하고있다. 따라서,이 질병에서 종양 성장을 촉진 관련된 드라이버 경로를 이해하는데 상당한 노력이 존재한다. 암 게놈 아틀라스 네트워크는 최근 다수의 주요 CRC의 이상 조절에 관여하고 포함하는 경로 확인했습니다 : WNT를, 포스 3- 키나제 (PI3K), RAS, 변형 성장 인자 β (TGF-β의)와 TP53 2. 함께 조사는 오티 설명과 함께CRC 성장을 강화할 그녀의 경로를 크게이 환자군 3-5 생존을 개선하기위한 새로운 치료법의 개발을 촉발 하였다. 종양 치료제 개발에 활용 전임상 모델은 이러한 신규 한 화합물의 임상 적 활성을 예측하는 과정이 필수적이었다. 다양한 전임상 모델은 신약 개발 과정에서 사용되어왔다. 전임상 트랜스 제닉 동물 모델 및 세포주 크게 때문에 인간 종양의 복잡도를 반영하기 위해 자신의 무능력을, 신규 종양 치료법의 임상 적 활성을 결정하는데 성공적이지 않은 불멸화 것을 고려하면, 환자 유래의 종양 이종 이식 (PDTX) 모델이 확립되었다. 이 모델의 가장 큰 장점은 종양 이질성은 그대로 유지하고 밀접하게 원래 환자 종양 6-9의 분자 특성과 clonality을 반영하는 것입니다. PDTX 모델은 생체 내에서 우수한을 제공전임상 플랫폼은 새로운 에이전트, 약물 내성 경로, 조합 전략, 암 줄기 세포 생물학 (10)을 공부한다. PDTX 공정의 일반적인 개요는도 1에 도시되어있다. 또한, 병원에서 시작 그 초과 종양 조직이 일부 연구에 사용될 수 있도록 환자 동의. 다음으로, 수술로 종양의 조각은 병리학 자에 의해 싫어할하고 연구 인력으로 운반 할 미디어에 넣어. 바로 그 후, 종양의 단면은 작은 조각으로 절단하고, 면역 결핍 마우스의 피하에 이식. 종양 성장 후에는 종양 (10)을 유지하기 위해 다른 세대의 마우스로 계대된다. 전형적으로, F3 생성 후에 종양은 신규 화합물 및 / 또는 조합 치료를 평가 치료 연구로 확장 될 수있다. 활용하여 차세대 서열 (엑솜 서열, RNA 서열과 SNP 어레이) 가능성 예측 바이오 마커 발견하다특정 치료에서 효과를 유도 할 수있다 환자의 선택에 도움 에디션. 1) 단일 에이전트로 또는 조합하여 새로운 치료법의 효능을 평가하고 2) 이전에 임상 시험에 대한 민감도 또는 저항의 예측 바이오 마커를 식별 : PDTX 모델을 사용하는 무엇보다 중요한 목표로합니다. 이 논문에서, 우리는 CRC PDTX 은행의 개시 및 유지 보수 방법론을 제공하고 신약 개발의 발견이 모델의 장점과 한계를 제공합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54393/54393fig1.jpg" /> CRC를 PDTX 모델 프로토콜의 그림 1. 개요. 환자 유래의 종양은 수술받은 즉시 피하 무 흉선 누드 마우스에 주입된다. 종양이 성장하면 그것은 다음 세대로 확장하고 결국 치료 연구에 확장됩니다. 치료 RESPONSE를을 평가하고 예측 바이오 마커는. 환자 선택에 도움을 수 식별 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54393/54393fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="915">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI or DMEM</td>
			<td style="width:81px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:499px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:81px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Non-essential Amino Acids</td>
			<td style="width:81px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:81px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">35-010-CV</td>
			<td>Thaw in -4 &#176;C, then activate for 30 minutes at 60 &#176;C water bath</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CPT blood tube</td>
			<td style="width:81px;">BD vacutainer</td>
			<td style="width:119px;">362761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:81px;">Surelock</td>
			<td style="width:119px;">A-7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phospate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:81px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyrogenic vials</td>
			<td style="width:81px;">Cyroking</td>
			<td style="width:119px;">C0732901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic tumor cutting dish</td>
			<td style="width:81px;">Trueline</td>
			<td style="width:119px;">TR4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissors</td>
			<td style="width:81px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:81px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Matrigel (gelatinous protein mixture)</td>
			<td style="width:81px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354234</td>
			<td>Store at -20 or -80 &#176;C, then thaw on ice, do not leave at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10% Formalin cups</td>
			<td style="width:81px;">Protocol</td>
			<td style="width:119px;">032-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Liquid Nitrogen Dewar Storage</td>
			<td style="width:81px;">Thermolyne</td>
			<td style="width:119px;">CY50900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Portable liquid nitrogen dewar</td>
			<td style="width:81px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">4150-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:81px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Freezing container: Mr Frosty</td>
			<td style="width:81px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isopropyl Alcohol</td>
			<td style="width:81px;">Decon</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trocars</td>
			<td style="width:81px;">Innovative Research of America</td>
			<td style="width:119px;">MP-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anesthesia machine</td>
			<td style="width:81px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:119px;">none</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anesthesia box</td>
			<td style="width:81px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:119px;">none</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:81px;">Vet one</td>
			<td style="width:119px;">1038005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">F-Air Canister</td>
			<td style="width:81px;">Bickford Omnicon</td>
			<td style="width:119px;">80120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Meloxicam</td>
			<td style="width:81px;">Vet one</td>
			<td style="width:119px;">5182-90C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calipers</td>
			<td style="width:81px;">Fowler</td>
			<td style="width:119px;">54-100-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Weight scale</td>
			<td style="width:81px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;">Scout Pro SP601</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor pieces are injected subcutaneously into athymic nude mice (immunocompromised, T cell deficient) to create a bank of tumors and subsequently are passaged into different generations of mice in order to maintain these tumors from patients. Importantly, cellular heterogeneity of the original tumor is closely emulated in this model, which provides a more clinically relevant model for evaluation of drug efficacy studies (single agent and combination), biomarker analysis, resistant pathways and cancer stem cell biology. Some limitations of the PDTX model include the replacement of the human stroma with mouse stroma after the first generation in mice, inability to investigate treatment effects on metastasis due to the subcutaneous injections of the tumors, and the lack of evaluation of immunotherapies due to the use of immunocompromised mice. However, even with these limitations, the PDTX model provides a powerful preclinical platform in the drug discovery process.

CRC를 PDTX 모델과 TCGA에있는 일반적인 돌연변이의 유사점 우리는 CRC PDTX 은행에서 일반적으로 돌연변이 (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 및 TP53)의 비율은 CRC 환자 집단에서 볼 수있는 돌연변이 주파수를 대표했다 여부를 조사 하였다. 도 2A (TCGA) 및 B (CRC PDTX 뱅크)에 도시 된 바와 같이, ...

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Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

피하 전임상 모델에서 환자 유래 종양을 활용하여 새로운 치료법, 예측 바이오 마커의 발견 및 약제 내성 경로의 효능을 연구 할 수있는 좋은 방법입니다. 이 모델은 신약 개발 과정에서 임상 시험에 앞서 많은 신규 항암 요법의 운명을 결정하는데 중요하다.

전임상 환자 유래 종양 소설 안티 - 암 치료의 조사를위한 이종 이식 모델의 개발 및 유지 보수

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

development-maintenance-preclinical-patient-derived-tumor-xenograft

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.6K 조회수.  University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus.  피하 전임상 모델에서 환자 유래 종양을 활용하여 새로운 치료법, 예측 바이오 마커의 발견 및 약제 내성 경로의 효능을 연구 할 수있는 좋은 방법입니다. 이 모델은 신약 개발 과정에서 임상 시험에 앞서 많은 신규 항암 요법의 운명을 결정하는데 중요하다. 

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Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients' tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.

We describe a method for stable labeling of patient-derived xenografts (PDXs) with lentiviral particles expressing green-fluorescent protein and luciferase reporters. This method allows for tracking the growth of PDXs at the primary site, as well as detecting spontaneous and experimental metastases using in vivo imaging systems.

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

연구

암 연구학

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of diagnosis. Metastatic RCC (mRCC) is incurable, with a median survival time of only 18 months. Immune-based interventions (e.g., interferon (IFN) and interleukin (IL)-2) induce durable responses in a fraction of mRCC patients, and multikinase inhibitors (e.g., sunitinib or sorafenib) or anti-VEGF receptor monoclonal antibodies (mAb) are largely palliative, as complete remissions are rare. Such shortcomings in current therapies for mRCC patients provide the rationale for the development of novel treatment protocols. A key component in the preclinical testing of new therapies for mRCC is a suitable animal model. Beneficial features that recapitulate the human condition include a primary renal tumor, renal tumor metastases, and an intact immune system to investigate any therapy-driven immune effector responses and the formation of tumor-induced immunosuppressive factors. This report describes an orthotopic mRCC mouse model that has all of these features. We describe an intrarenal implantation technique using the mouse renal adenocarcinoma cell line Renca, followed by the assessment of tumor growth in the kidney (primary site) and lungs (metastatic site).

Implementation of an orthotopic model of renal cell carcinoma in immunocompetent mice affords the investigator a clinically-relevant system defined by the presence of a primary renal tumor and lung metastases in the same animal. This system can be used to preclinically test a variety of treatments in vivo.

전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

환자에서 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene disruption, many of these studies have made use of complex gene knockout models. While these studies with knockout mice offer an elegant and time-tested system for investigating genotype-to-phenotype relationships, a rapid and scalable method for assessing candidate genes that play a role in AML cell proliferation or survival in AML models will help accelerate the parallel interrogation of multiple candidate genes. Recent advances in genome-editing technologies have dramatically enhanced our ability to perform genetic perturbations at an unprecedented scale. One such system of genome editing is the CRISPR-Cas9-based method that can be used to make rapid and efficacious alterations in the target cell genome. The ease and scalability of CRISPR/Cas9-mediated gene-deletion makes it one of the most attractive techniques for the interrogation of a large number of genes in phenotypic assays. Here, we present a simple assay using CRISPR/Cas9 mediated gene-disruption combined with high-throughput flow-cytometry-based competition assays to investigate the role of genes that may play an important role in the proliferation or survival of human and murine AML cell lines.

This manuscript describes a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) CRISPR-Cas9-based method for simple and expeditious investigation of the role of multiple candidate genes in Acute Myeloid Leukemia (AML) cell proliferation in parallel. This technique is scalable and can be applied in other cancer cell lines as well.

CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험을 사용 하 여 유전 종속성의 조사

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and colorectal cancer (CRC). More than 50% of patients with muscle-invasive UCC, despite curative therapy for clinically-localized disease, will develop metastases and die within 5 years, and metastatic CRC is a leading cause of cancer-related deaths in the US. Xenograft models that consistently mimic UCC and CRC metastasis seen in patients are needed. This study aims to generate patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) models of UCC and CRC for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of LN stromal cells mimicking the progression of human metastatic diseases for drug screening. Fresh UCC and CRC tumors were obtained from consented patients undergoing resection for HG-UCC and colorectal adenocarcinoma, respectively. Co-inoculated with LN stromal cell (LNSC) analog HK cells, luciferase-tagged UCC cells were intra-vesically (IB) instilled into female non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice, and CRC cells were intra-rectally (IR) injected into male NOD/SCID mice. Tumor growth and metastasis were monitored weekly using bioluminescence imaging (BLI). Upon sacrifice, primary tumors and mouse organs were harvested, weighed, and formalin-fixed for Hematoxylin and Eosin and immunohistochemistry staining. In our unique PDOX models, xenograft tumors resemble patient pre-implantation tumors. In the presence of HK cells, both models have high tumor implantation rates measured by BLI and tumor weights, 83.3% for UCC and 96.9% for CRC, and high distant organ metastasis rates (33.3% detected liver or lung metastasis for UCC and 53.1% for CRC). In addition, both models have zero mortality from the procedure. We have established unique, reproducible PDOX models for human HG-UCC and CRC, which allow for tumor formation, growth, and metastasis studies. With these models, testing of novel therapeutic drugs can be performed efficiently and in a clinically-mimetic manner.

This protocol describes the generation of patient-derived orthotopic xenograft models by intra-vesically instilling high-grade urothelial cell carcinoma cells or intra-rectally injecting colorectal cancer cells into non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of lymph node stromal cells, which mimics the progression of human metastatic diseases.

인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and basic cancer researches. Generations of PDX models in traditional host mice are time-consuming and only working for a small proportion of samples. Recently, zebrafish PDX (zPDX) has emerged as a unique host system, with the characteristics of small-scale and high efficiency. Here, we describe an optimized methodology for generating a dual fluorescence-labeled tumor xenograft model for comparative chemotherapy assessment in zPDX models. Tumor cells and fibroblasts were enriched from freshly-harvested or frozen pancreatic cancer tissue at different culture conditions. Both cell groups were labeled by lentivirus expressing green or red fluorescent proteins, as well as an anti-apoptosis gene BCL2L1. The transfected cells were pre-mixed and co-injected into the 2 dpf larval zebrafish that were then bred in modified E3 medium at 32 &#176;C. The xenograft models were treated by chemotherapy drugs and/or BCL2L1 inhibitor, and the viabilities of both tumor cells and fibroblasts were investigated simultaneously. In summary, this protocol allows researchers to quickly generate a large amount of zPDX models with a heterogeneous tumor microenvironment and provides a longer observation window and a more precise quantitation in assessing the efficiency of drug candidates.

This protocol describes optimization procedures in a virus-based dual fluorescence-labeled tumor xenograft model using larval zebrafish as hosts. This heterogeneous xenograft model mimics the tissue composition of pancreatic cancer microenvironment in vivo and serves as a more precise tool for assessing drug responses in personalized zPDX (zebrafish patient-derived xenograft) models.

비교 약물 평가를 위한 호스트로 Zebrafish 애벌레를 사용하여 췌장암의 환자 유래 이종 이종이식 모형

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture vessels versus in vivo in human patients. This is due to the bottleneck selection of clonal populations of melanoma cells that can robustly grow in vitro in the absence of physiological conditions. Further, responses to therapy in two-dimensional tissue cultures overall do not faithfully reflect responses to therapy in melanoma patients, with the majority of clinical trials failing to show the efficacy of therapeutic combinations shown to be effective in vitro. Although xenografting of melanoma cells into mice provides the physiological in vivo context absent from two-dimensional tissue culture assays, the melanoma cells used for engraftment have already undergone bottleneck selection for cells that could grow under two-dimensional conditions when the cell line was established. The irreversible alterations that occur as a consequence of the bottleneck include changes in growth and invasion properties, as well as the loss of specific subpopulations. Therefore, models that better recapitulate the human condition in vivo may better predict therapeutic strategies that effectively increase the overall survival of patients with metastatic melanoma. The patient-derived xenograft (PDX) technique involves the direct implantation of tumor cells from the human patient to a mouse recipient. In this manner, tumor cells are consistently grown under physiological stresses in vivo and never undergo the two-dimensional bottleneck, which preserves the molecular and biological properties present when the tumor was in the human patient. Notable, PDX models derived from organ sites of metastases (i.e., brain) display similar metastatic capacity, while PDX models derived from therapy naive patients and patients with acquired resistance to therapy (i.e., BRAF/MEK inhibitor therapy) display similar sensitivity to therapy.

Patient-derived xenograft (PDX) models more robustly recapitulate melanoma molecular and biological features and are more predictive of therapy response compared to traditional plastic tissue culture-based assays. Here we describe our standard operating protocol for the establishment of new PDX models and the characterization/experimentation of existing PDX models.

흑색종 환자 유래 이종이식 모델

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. Although there are many established gastric cancer cell lines and many conventional transgenic mouse models for preclinical research, the disadvantages of these in vitro and in vivo models limit their applications. Because the characteristics of these models have changed in culture, they no longer model tumor heterogeneity, and their responses have not been able to predict responses in humans. Thus, alternative models that better represent tumor heterogeneity are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models preserve the histologic appearance of cancer cells, retain intratumoral heterogeneity, and better reflect the relevant human components of the tumor microenvironment. However, it usually takes 4-8 months to develop a PDX model, which is longer than the expected survival of many gastric patients. For this reason, establishing primary cancer cell lines may be an effective complementary method for drug response studies. The current protocol describes methods to establish PDX models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. These methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

The current protocol describes methods to establish patient-derived xenograft (PDX) models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. The methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic target analyses and drug response monitoring using patient derived xenografts (PDX). This strategy was validated using ovarian tumors as an example. The mate-pair next generation sequencing (MPseq) protocol was used to identify structural alterations and followed by analysis of potentially targetable alterations. Human tumors grown in immunocompromised mice were treated with drugs selected based on the genomic analyses. Results demonstrated a good correlation between the predicted and the observed responses in the PDX model. The presented approach can be used to test the efficacy of combination treatments and aid personalized treatment for patients with recurrent cancer, specifically in cases when standard therapy fails and there is a need to use drugs off label.

Here we present a protocol to test the efficacy of targeted therapies selected based on the genomic makeup of a tumor. The protocol describes identification and validation of structural DNA rearrangements, engraftment of patients&#8217; tumors into mice and testing responses to corresponding drugs.

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...