입증된 프로토콜은 직접적이고 효과적인 실험적 접근 방식과 새로운 바이러스 보조제의 면역 반응 효과에 대한 세부 단계를 강조했습니다. 이 프로토콜은 보조 백신에 대한 기본적인 면역 평가 방법을 연구에 제공할 뿐만 아니라 질량 안정성을 결정할 수도 있습니다. 먼저, MRSA HI 항원 단백질의 10 밀리리터 작업 용액을 취하고, 여기에 이소프로필 미리스테이트, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 프로필렌 글리콜 등 3가지 부형제를 순차적으로 첨가하고, 1 대 6 대 3의 질량비를 유지한다.
혼합물을 잘 저어 준 다음 멸균 된 순수한 물을 서서히 첨가하여 10 밀리리터의 시스템 부피에 도달하십시오. 저에너지 유화법으로 나노에멀젼 백신을 제조하기 위해서는 분당 500회전, 섭씨 25도에서 약 20분 동안 교반한다. 이어서, 밀리리터 당 1 밀리그램의 단백질을 함유하는 나노 에멀젼 백신을 투명한 액체로서 수득한다.
효소 결합 면역흡착 분석 또는 ELISA 플레이트의 항원 코팅을 위해, HI 단백질 항원을 코팅 용액으로 밀리리터당 10마이크로그램으로 희석하고, 웰당 희석된 항원 100마이크로리터를 ELISA 플레이트에 첨가한다. 접시를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 인큐베이션 후, 플레이트를 웰 당 300 마이크로리터의 PBST로 세척한다.
웰 당 300 마이크로리터의 밀봉 용액으로 웰을 섭씨 37도에서 2시간 동안 밀봉한 후, 각 실험군으로부터 3 마이크로리터의 마우스 혈청을 297 마이크로리터의 PBST를 첨가하여 100배 희석하고, 희석된 혈청을 와동시킨다. 각 혈청 샘플에 대해 코팅된 ELISA 플레이트에 웰당 100마이크로리터의 희석된 혈청을 추가합니다. 유사하게, 396 마이크로리터의 PBST에 4 마이크로리터의 양성 또는 음성 대조군 혈청을 첨가하여 PBST로 양성 및 음성 대조군 혈청을 100배 희석한 다음, 와류 혼합한다.
이중 비율 희석을 수행하려면 이전에 희석된 실험 혈청 200마이크로리터를 코팅된 ELISA 플레이트의 첫 번째 행에 추가한 다음 1열과 12행의 웰을 제외한 모든 웰에 PBST 100마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 피펫 건을 100 마이크로리터로 조정하고 100 마이크로리터의 혈청을 첫 번째 행에서 PBST가 포함된 두 번째 행으로 옮깁니다. 피펫 건을 사용하여 두 번째 줄의 내용물을 10 번 혼합하십시오.
유사하게, 1행까지 혈청을 2회 연속적으로 희석하여 11행을 수행한다. 완료되면 100열에서 11마이크로리터의 액체를 버립니다. 100마이크로리터의 희석된 음성 및 양성 혈청을 샘플 템플릿에 따라 행 12의 각 해당 웰에 추가합니다.
ELISA 플레이트를 플라스틱 랩으로 밀봉하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 한편, PBST를 첨가하여 2차 항체 anti-mouse IgG HRP를 10, 000배 희석한다. 1시간 배양 후, 웰 당 300 마이크로리터의 PBST로 ELISA 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 항체를 세척한 다음, 희석된 2차 항체 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 40분 동안 인큐베이션한다.
웰 당 300 마이크로리터의 PBST로 플레이트를 세척한 다음, 100 마이크로리터의 TMB 발색 용액을 각 웰에 첨가한다. 접시를 섭씨 37도에 놓고 10분 동안 빛을 피하십시오. 그 후, 50 마이크로 리터의 2 몰 황산으로 즉시 반응을 종결시킨다.
종료 후 15분 이내에 효소 마커를 사용하여 415나노미터에서 광학 밀도 또는 OD 값을 감지합니다. 새로운 나노 에멀젼 백신의 물리적 특성은 투과 전자 현미경과 원자력 현미경을 사용하여 분석되었습니다. 동적 광 산란은 샘플의 입자 크기 분포와 제타 전위를 결정하는 데 사용되었습니다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅은 침전물 및 상청액 중의 항원의 양이 원심분리 후 유의하게 지연되지 않았으며, 이는 백신이 구조적으로 손상되지 않고 특이적이며 면역원성임을 나타냅니다. 나노에멀젼 아쥬반트 백신은 마우스의 총 IgG, IgG1 및 IgG2a 항체 역가를 유의하게 증가시켰다. 단백질 백신의 면역원성이 현저히 개선되었다.
450 나노미터에서의 혈청 IgG2b OD 값은 PBS가 5, 000 희석 정도일 때 가장 높았다. MRSA 252 마우스의 치명적인 모델은 나노 에멀젼 백신이 우수한 보호 효과를 나타내고 MRS A 252에 의한 박테리아 감염을 효과적으로 억제하여 감염된 마우스의 생존율을 향상 시킨다는 것을 반영했다. 나노 유화의 준비와 식물에 혈청을 첨가하는 것이 가장 중요합니다.
또한, 항체 역가를 검출하는 곳에서는 더 넓고 액체계 아웃으로 보정하는 데 주의를 기울여야 한다. 보조제 외에도 이 방법은 플라스틱이나 전달 시스템과 같은 다른 수학 배열의 면역 진화에도 사용할 수 있습니다.
