박테리아 부담을 모니터링하고 호중구 반응을 동시에 하는 기술은 Staph 아우레우스 지속성의 메커니즘과 치료 전략의 효능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 매개 변수가 감염 기간 내내 라이브 호스트에서 세로로 측정될 수 있다는 것입니다. 마우스 도르섬에 상처를 배치하는 곳, 피부를 소비하는 방법, Staph 아우레우스로 상처를 접종하는 방법을 보여주는 것이 중요합니다.
먼저 얼음에 대한 음의 섭씨 80도 저장에서 관심의 생물 발광 Staph aureus 변형을 해동하여 시작합니다. 5%의 소 혈액 화마 접시에 문화를 줄무늬하기 전에. 섭씨 37도에서 하룻밤 잠복식.
다음 날 아침, Staph aureus 플레이트에서 트립틱 콩 국물 또는 TSB로 3~4개의 개별 식민지를 옮기. 클로람페니콜 밀리리터당 10마이크로그램으로 보충하여 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 흔들리는 배양을 제공합니다. 다음 아침, TSB의 6 밀리리터에 문화 샘플의 120 마이크로 리터를 희석.
클로람페니콜 밀리리터당 10마이크로그램, 섭씨 37도에서 2시간 배양, 분당 200회 회전. 600 나노미터의 광학 밀도가 0.5에 도달하면 세균 현탁액 3 밀리리터를 10 밀리리터 얼음 차가운 DPBS로 옮춥니다. 상체를 조심스럽게 탈수 한 후, 펠릿에 차가운 DPBS를 추가하고 다시 중단 된 박테리아를 철저히 소용돌이시다.
두 번째 원심 분리 후, 얼음에 PBS의 1.5 밀리리터에서 세균 펠릿을 다시 중단. 박테리아 농도를 확인하기 위해 세균 현탁액의 마이크로리터 100개를 4대 10, 5번으로 1x 10으로 희석하여 신선한 PBS로 희석한다. 그리고 개별 한천 접시에 각 희석의 20 마이크로 리터를 플레이트.
섭씨 37도에서 하룻밤 잠복 후, 전날의 세균 농도를 계산하기 위해 총 검사에 의한 식민지 형성 단위의 수를 계산합니다. 수령인 동물의 절제된 피부 상처의 경우 마우스 뒷면에 1 인치 씩 면도하기 전에 발가락 핀치에 대한 반응부족을 확인하십시오. 길 잃은 머리카락을 제거하기 위해 부드럽게 닦으십시오.
순차적으로 10%의 포비도요오드, 70%에탄올에 젖은 거즈 어플리케이션으로 노출된 피부를 소독합니다. 나선형 패턴으로 외과 부위의 중심에서 바깥쪽으로 이동합니다. 피부가 약 1 분 동안 건조 할 수 있게 한 후 준비 된 수술 영역의 중앙에 멸균 6 밀리미터 펀치 생검을 단단히 누릅니다.
펀치 생검을 비틀어 피부에 원형 윤곽선을 만들고 피부 조직을 완전히 잘라내고 윤곽선의 적어도 한 부분을 만듭니다. 기본 근막 이나 조직으로 잘라 하지 않도록 주의. 그런 다음 멸균 가위를 사용하여 표피와 진피를 잘라내고 펀치 생검에 의해 각인된 원형 패턴을 따라 절단합니다.
Staph aureus 접종의 경우, 제조 된 생물 발광 세균 접종의 50 마이크로 리터와 28 게이지 인슐린 주사기를 채웁니다. 그리고 손가락을 사용하여 상처 입은 동물의 진피를 옆으로 당깁니다. 조직에 거의 평행주위를 잡고, 저항의 급격한 감소가 느껴질 때까지 천천히 조직에 주사기를 삽입합니다.
근막의 피어싱을 나타냅니다. 바늘이 상처의 중앙에 놓이면, 천천히 부피의 전체 부피를 전달합니다. 난무제가 최소한의 누설이나 분산으로 상처 의 중심에 거품을 형성하는지 확인합니다.
그리고 동물에서 천천히 주사기를 제거합니다. 그런 다음 동물을 열로 케이지로 되돌리고 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 상처와 감염 후, 실험 하는 동안 매일, 생물 발 광 및 꽃 감기에 마취 된 마우스를 배치, 가능한 한 평평한 상처와 함께.
이미저 소프트웨어에서 발광및 사진을 이미징 모드로 선택합니다. 노출 시간은 작은 비닝에서 1분, 발광용 F/Stop 1, 사진용 F/Stop 8, 방출 필터를 위해 열려 있어야 합니다. 그런 다음 이미지를 기록하려면 획득을 클릭합니다.
생체 내 형광 이미징의 경우, 이미징 모드로 형광을 선택하고 사진을 찍습니다. 노출 시간은 작은 비닝에서 1초, 형광용 F/Stop 1, 사진용 F/Stop 8, 30나노미터 이상 465, 20나노미터 이상 520개의 광막 강도로 각각 1초로 미리 설정되어야 합니다. 그런 다음 이미지를 기록하려면 획득을 클릭합니다.
두 세트의 이미지를 얻은 후, 전체 복구까지 모니터링과 함께 동물을 케이지로 되돌리게 하십시오. 이미지 분석의 경우 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램에서 정량화할 이미지를 열고 주변 피부를 포함한 전체 상처 영역에 기본 원형 영역을 배치합니다. 관심 영역을 측정하고 상처의 평균 플럭스의 값을 기록하여 각 신호의 평균 플럭스를 시간 대비 플롯할 수 있도록 합니다.
상처 치유를 측정하려면 상처 가장자리에 관심있는 원형 영역에 맞추고 상처 영역을 곱곱한 센티미터로 측정하여 기준선과 시간 대비 분수 변화를 플로팅할 수 있습니다. 본 대표적인 실험에서 조건부 EGFP 발현 골수성 분화 1차 반응(88) 또는 MyD88 녹아웃 마우스는 비조건적인 EGFP발성 동물보다 포도상 구레나귀 접종에 더 큰 감수성을 입증하였다. 감염의 첫번째 8 일 도중 관찰된 80%의 치사로.
마우스의 두 변종은 감염 직후 체중의 약 5%를 잃었습니다. 그러나, 마우스를 표현하는 조건부 EGFP는 둘째 날까지 원래의 무게를 회복시켰다. MyD88 마우스는 하지 않았다 하는 동안.
Staph aureus 감염의 존재에 있는 상처 폐쇄는 두 긴장 사이에서 다르지 않았습니다. 그러나, 살균상처MyD88 녹아웃 마우스는, 동물을 표현하는 조건부 EGFP에 비해 상처 치유에 중요한 결함이 있었다. 전체 동물 화상 진찰은 MyD88 녹아웃 동물의 상처에 있는 증가한 생물 발광 신호에 의해 입증된 바와 같이, 조건부 EGFP에 비해 더 높은 세균성 부담을 제시했습니다.
MyD88 녹아웃 동물의 감염되지 않은 상처에 대한 초기 호중구 인신 매매의 40 % 감소는 또한 동물을 표현하는 조건부 EGFP에 비해 관찰되었다. 1 x 10에서 Staph 아우레우스의 7식민지 형성 유닛이 상처 직후 도입되었을 때, 호중구 인신 매매는 동물을 표현하는 조건부 EGFP에 비해 녹아웃 동물에서 현저히 감쇠되었다. 박테리아를 분배하기 전에 주사기에 기포가 없고 바늘의 위치가 상처 의 중앙에 올바르게 위치되어 있는지 확인하십시오.
동물 조직은 상처에서 관심있는 단백질과 세균 보급의 발현을 측정하기 위해 엔드 포인트에서 수확 될 수있다. 포도상 구균은 인간에게 전염됩니다. 따라서, 개인 보호 장비는 박테리아를 취급할 때 착용되어야 하고, 병원체를 포함하는 주사기를 취급할 때 주의해야 합니다.
이 기술은 감염에 대하여 호스트선천적인 면역 반응을 강화하는 Staph aureus 감염을 위한 생물학 처리의 사용을 탐구하는 것을 도왔습니다.
