This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88&#8211;/&#8211; mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.

모든 동물 실험은 의학 분지 택사스 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 감염 - 비와 웨스트 나일 바이러스에 감염된 마우스에서의 DC 1. 분리 <ol><li> 나이와, 성별 일치 6-10주 된 야생형 C57BL / 6 (B6)과에서 MyD88 - / - 마우스. 복강 (IP) WNV NS4B- P38G 돌연변이의 500 플라크 형성 단위 (PFU) 접종. - / - CO 2와 마우스 3 일 후 감염에, B6과에서 MyD88를 안락사. 컨트롤과 같은 두 그룹의 감염되지 않은 마우스를 사용합니다. 각 그룹에서 세 마우스를 사용합니다. </li><li> 젖은 70 % 에탄올을 사용하여 희생 마우스의 왼쪽 및 모피는 전방 및 후방 다리 사이의 중간에 대해, 마우스 왼쪽의 털을 절단. 체강을 오픈. 집게를 사용하여 비장을 제거합니다. RPMI와 페트리 접시에서 비장를 놓습니다. </li><li> 항에있어서 CD11c 양성 자성 비드를 사용하여 비장의 수지상 세포를 분리제조업체의 지침. </li></ol> 2. 정제 OTII 제닉 마우스의 T 세포의 라벨링 <ol><li> 순진한 OTII 마우스에서 수확 한 비장은 위의 단계 1.2에 설명 된 두 개의 슬라이드의 프로스트 끝 사이의 비장을 균질화있다. 14 ml의 RPMI 매체를 추가, 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 서스펜션은 5 분 동안 앉아서 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 13 ml의 전송 보자. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 CD4 + T 세포 단리 키트를 사용하여 비장 CD4 + T 세포를 분리. </li><li> 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 전송 세포는 PBS로 두 번 세척 하였다. 재현 탁 된 1 ㎖ 당 1 × 106 세포를 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 PBS에서 세포 및 CFSE가 0.5 μmol / ㎖를 추가한다. 빛으로부터 보호 된 10 분, 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 10 %의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청 5 ml의 차가운 완전 배지 (RPMI-1640을 추가, 1/100 권항생제 / antimycotics, 1/100 권 L- 글루타민 및 1000 X 2- 머 캅토 에탄올의 1 / 1,000 권). </li><li> 5 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 세척 된 세포는 PBS로 1 회, 2 % PFA로 0.2 × 10 6 표지 CD4 + T 세포를 고정하고 유세포에 취득. CFSE의 기초 수준을 결정하기 위해이 샘플을 사용하십시오. 완전 배지에서 표지화 된 세포의 나머지를 다시 일시. </li></ol> 웨스트 나일 바이러스에 감염된 쥐의 수지상 3. 공동 문화 OTII T 세포 <ol><li> 문화 2 × 10 OTII 마우스의 5 정제 CD4 + T 세포 단독으로 또는 야생형 또는에서 MyD88의 정제 DC가와 - / - 또는 OVA 잔류 323-339없이 24 웰 플레이트에 마우스 (2 × 10 4) (1g 웰 당 1ml의 완전 배지에서 / ㎖). </li><li> 5 일간 37 ℃에서 세포를 배양한다. 수확 세포는, (1 % FBS와 PBS) FACS 버퍼에 두 번 씻고 0.25 ml의 2 % PFA에 고정합니다. 소용돌이 즉시. </li></ol> 체외 4. 유동 세포 계측법 분석 &lt;/ EM&gt; T 세포 프라이밍 <ol><li> 인수를 들어, 이중 소프트웨어 아이콘 유동 세포 계측법을 클릭합니다. SSC-A에 20 만 FSC-A에 20 만 0 선형 FSC-A 대 선형 SSC-A의 밀도 플롯, 선택 채널 0하십시오. (; 그림 1A 참조 P2) 다음에 살아있는 세포에 게이트를 만들 수 있습니다. </li><li> CFSE의 형광 강도를 분석하기 위해, FL1 채널에 대한 히스토그램을 열고 게이트 인구에 20,000 이벤트를 취득. 단독 배양 (그림 1A) OTII의 세포 샘플에 마커를 설정합니다. </li><li> 야생형 수지상 세포 (도 1B)에서 MyD88 또는 함께 공 배양 OTII 셀들에 대한 샘플들을 획득 - / - 수지상 세포 (도 1C)을 유사한 방식. </li></ol> 5. 분리 및 사이토 카인 분석 실험에 대한 비장 세포의 자극 <ol><li> STE에 기술 된 바와 같은 절차를 이용 WNV NS4B-P38G 돌연변이 생쥐 - / - B6 및 감염에서 MyD88P 1.1. 하루 30 후 감염에 다시 도전 일 8 차 감염 다음 21 이후 주 웨스트 나일 바이러스 감염이나 4 일에에서 야생형 웨스트 나일 바이러스 균주의 IP 2000 PFU와 생존 마우스는 비장의 수집을 위해 CO 2와 쥐를 안락사 . 참고 : 우리는 각 시점에 대한 그룹 당 2 ~ 3 마우스를 사용했다. </li><li> 단계 1.2 단계 2.2에서 상술 한 바와 같이 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 만들기. 혈구 및 사용하여 세포 개수 10 ml의 완전한 매체에서 그들을 다시를 일시 중지합니다. </li><li> 2.5 × 106 세포 / ml로 완전 배지로 세포를 희석. 1.5 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에 비장 세포의 1 ML을 추가합니다. </li><li> DMSO에 1 ㎎ / ㎖로 WNV 특정 NS4B 및 E 펩티드 (SSVWNATTA 및 IALTFLAV)를, CD8 + T 세포를 시뮬레이션 희석. CD4 + T 세포의 자극, DMSO에 1 ㎎ / ㎖로 WNV 특정 NS3 및 E 펩티드 (RRWCFDGPRTNTILE 및 PVGRLVTVNPFVSVA)을 희석. followe 세포에 펩티드의 10 μl를 추가Brefeldin 용액 1 μL에 의해 개발. 컨트롤과 같은 펩타이드 처리없이 세포를 사용합니다. 세포를 섞는다. </li><li> 튜브의 뚜껑에 18 G 바늘 두 개의 구멍을 뚫습니다. 5 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어. </li></ol> 6. 세포 내 사이토 카인 염색법 <ol><li> 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브에 세포를 전송합니다. 300-400 XG에서 5 분 동안 세포를 스핀과 상층 액을 붓는다. 300-400 XG에 1 ml의 FACS 버퍼, 스핀 5 분을 추가하고 120 μL FACS 버퍼를 피펫으로 세포를 일시 중지 다시. </li><li> 2 μL의 Fc 차단제를 추가하고 실온에서 10 분 동안 세포를 배양한다. 각각의 튜브에 1 ㎖의 FACS 버퍼를 추가합니다. 스핀 (300)에서 5 분 - 400 × g으로. </li><li> 300 μL FACS 세포를 일시 중지 다시 버퍼와 세 개의 튜브 (튜브 당 약 0.8 × 10 6 세포)로 분할. 표 1에 나타낸 바와 같이, 쥐의 IgG-PE 염색 각 배양 조건의 제 1 튜브를 보유. 제 2 튜브의 경우, CD4의 안티 - CD4 APC의 3 μl를 추가 펩타이드를 처리 한 세포, 3 μCD8 펩타이드 처리 된 세포 또는 펩티드를 처리하지 않고 세포에 모두 항체 안티 CD8 FITC의 리터. 보상 염색에 대한 세 번째 튜브를 사용합니다. 각각의 배양 조건, APC - 복합 CD4, FITC - 복합 CD8 또는 FL1, FL2 및 FL4 채널에 대한 보상 컨트롤 등의 단독 PE- 표지 CD3 항체 (튜브 당 3 μL)로 염색 된 세포의 세 개의 튜브를 사용합니다. </li><li> 잠시 소용돌이 세포. 20 분 동안 얼음에두고 빛으로부터 보호합니다. 1.4 ml의 FACS 버퍼를 추가합니다. 300-400 XG에서 5 분 스핀과 상층 액을 붓는다. </li><li> 세포 펠릿 (또는 간단하게 소용돌이를) 혼란을 선동. 250 μL 고정 / 투과성으로의 solutionby 피펫의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 20 분 동안 실온에서 인큐베이션하고 빛으로부터 보호한다. </li><li> 1.2 ml의 FACS 버퍼를 추가합니다. 300 μL FACS 버퍼에 300 ~ 400 XG 및 재현 탁 세포에서 스핀 5 분. 주 :이 시점에서, 세포는 각각 U 광으로부터 추가 처리 BL2 실험실로 전송하거나 저장하고 냉장고에서 보호 될 수있다삼일에 페이지. </li><li> 500 μL FACS 버퍼를 추가합니다. 스핀 1X 투과성으로 / 세척 버퍼 500 μL에 300 ~ 400 XG 및 재현 탁 세포에서 5 분. 스핀 300 ~ 400 X g에서 5 분. </li><li> 이전에 예약 된 튜브의 단계 6.3 및 3.5 ㎕를 쥐의 IgG-PE에서 CD4에 대한 항체 및 / 또는 CD8 T 세포 마커로 추가 된 튜브에 3.5 μL 안티 IFNγ-PE를 추가, 100 μL 1X 파마 / 워시 세포를 다시 일시 중지 얼음에 25 분 동안의 IgG 제어를 빛으로부터 보호합니다. 1 배 투과성으로 / 세척 버퍼의 1.4 ml를 추가하여 세포를 씻으십시오. 스핀 300 ~ 400 X g에서 5 분. 1.4 ㎖의 1X 투과성으로 / 세척 완충액을 첨가하여 세정 공정을 반복한다. </li><li> 300-400 XG에서 5 분 스핀과 상층 액을 가만히 따르다. FACS 버퍼의 1.4 ml의 추가 및 최종 획득을위한 FACS 버퍼 400 μL에 re-중단에 의해 세포를 씻으십시오. </li></ol> 세포 내 사이토 카인 염색 7. 유동 세포 계측법 분석 <ol><li> 단계 4.1에서와 동일한 인수 설정을 사용한다. 크레아TE 생균에 게이트 (P2는도 2a 참조). 각 그룹에 대한 보상 튜브를 사용하여 전압을 조정합니다. </li><li> 오픈 두 가지 새로운 점 플롯, 하나는 대 FL1을 위해 수집 된 데이터를 표시합니다. FL2 (CD8 VS. IFN-γ) 및 다른 하나는 VS FL4 위해 수집 된 데이터를 표시하는 것이다. FL2 (CD4 대. IFN-γ). 각 샘플의 문이 인구 5 만 이벤트를 취득. </li></ol>

<ol>
	<li>Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus.">West Nile virus.</a> Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).</li><li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+an+attenuated+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain.">Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain.</a> Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+control+of+the+adaptive+immune+responses.">Toll-like receptor control of the adaptive immune responses.</a> Nat. 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웨스트 나일 바이러스는 BL3 병원체이다. 때문에 안전 규정, 웨스트 나일 바이러스에 감염된 샘플 면역 학적 분석은 종종 BL3 시설이나 수행이 더 길고 지루한에서 장비의 가용성에 의해 제한됩니다. 최근의 연구에서 우리는 웨스트 나일 바이러스 감염 5시 세포 매개 면역 반응을 연구하기 위해 두 개의 흐름 세포 계측법 기반의 방법을 사용했다. 모두 분석에서, 웨스트 나일 바이러스에 감?...

웨스트 나일 바이러스 (WNV), 신경성, 플러스 감지 플라 비 바이러스, 신흥 보건 위협이다. 현재, 백신은 인간의 사용 (1) 승인되지 않았다. 비 구조 (NS) (b) 단백질의 P38G 대체가 감쇠 웨스트 나일 바이러스 균주, 야생형 WNV NY99 변형이보다 마우스에는 마우스의 치사하지만 높은 타고난 사이토 카인 및 T 세포 반응을 유도하지 알려져있다. NS4B-P38G 돌연변이로 면역화 마우스는 모든 치명적인 야생형 웨스트 나일 바이러스와 보조 도전으로부터 보호했다. 이 NS4B-P38G 돌연변이 이상적인 백신 후보에 적합한 기능을 가지고 있음을 시사한다. NS4B-P38G 돌연변이가 높은 보호 후천성 면역을 유도하는 메커니즘은 명확하게 아직 이해되지 않습니다. 병원체 관련 분자 패턴을 인식 수신자 같은 수용체 (TLR에)는, 바이러스 감염에 대한 선천성 면역의 개시에 필수적인 역할을한다. 코어 TLR 신호 전달 경로가 골수 분화 일차 응답 GE를 이용기본 어댑터 3,4로 북동 88 (에서 MyD88). 최근 연구에서, 시그널링에서 MyD88 쥐 5 NS4B- P38G WNV 감염 중에 돌연변이 세포 성 면역의 개발에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 수지상 세포 (DCS)는 바이러스 감염시 -6,7- 차 T 세포 반응을 개시하는 독특한 능력을 나타내는 중요한 항원 제시 세포의 하나이다. CD4 + 및 CD8 + T 세포는 오랫동안 지속 면역 보호에 기여 야생형 WNV 감염 8,9 다음 숙주의 생존에 중요한 두. 두 면역 분석법 NS4B-P38G 돌연변이 감염된 마우스에서 이들 세포의 기능을 평가하기 위해 본 연구에 사용 하였다. - / - 생쥐 먼저, 시험 관내 T 세포 프라이밍 분석법 WNV 감염 야생형에서 MyD88의 수지상 세포의 항원 제시 능력을 비교하기 위해 사용 하였다. 분석, 순진한 CD4 &lt;의 감도를 높이려면CFSE (WNV 감염 마우스의 339 수지상 정제하고, 카르복시 숙신 부활절 공 배양 - SUP&gt; + T 세포를 323 (OVA) 펩티드 닭 오브 알부민 대 Vα2 / Vβ5 TCR의 구체적인 표현 OTII 트랜스 제닉 마우스로부터 단리 하였다 OVA 펩티드의 존재 하에서) 표지 된 CD4 + T 세포. 공동 배양 5 일 후에, 세포를 수확하고, 파라 포름 알데히드 (PFA)로 고정하고 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 증식 분석은 전통적으로, 5- 브로 모 -2&#39;- 데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 삼중 또는 티민 deoxyriboside (3 HTdr) (10)의 혼입을 통해 이루어지고있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 분석은 방사성 및 / 또는 웨스트 나일 바이러스 연구가 진행되어 바이오 안전성 레벨 (BL) 3 시설에서 특수 장비를 필요로 하나 있습니다. CFSE가 더 일반적으로되어 면역 학적 검정에 매우 중요 사용한 염료의 형광 강도 반감 의한 일련의 림프구 증식 유세포 분석은 염료보다 안정적이기균등하게, 세포 내로 혼입 유동 세포 계측법에 의해 검출이 용이하고, 방사능이 11이다. 분석은 또한 세포 분열 횟수를 평가하는 기능을 갖는다. WNV 연구에서이 분석을 이용하여 하나의 큰 장점은 1 ~ 2 % PFA로 감염된 세포의 정착이 BL2 실험실에서 유세포 샘플 획득을 가능하게 WNV 12 비활성화 할 수 있다는 것이다. 다음에, 개질 된 세포 내 사이토 카인 염색 (ICS)가 절차에서 MyD88 NS4B-P38G 변이체 감염된 마우스에서 WNV 특정 T 세포 반응의 조절에 시그널링의 역할을 연구하기 위해 사용되었다. 이 분석에서, 감염된 마우스 비장 세포로부터 단리 WNV 특정 펩타이드 체외에서 처리 하였다. Brefeldin는 셀 내 사이토 카인을 유지하기 위해 첨가 하였다. 5 시간 배양 한 후, 세포를 수확하여 세척하고, T 세포의 서브 세트에 대해 염색 하였다. 이어서 세포, PFA 고정 투과 가능 인터페론 (IFN) -γ 스테인드 유세포 분석 하였다.세포를 고정 및 PFA를 포함하는 투과성으로 완충액으로 처리하면 다른 유동 세포 계측법 기반 분석과 마찬가지로, 감염된 샘플 추가 처리 및 분석을 위해 BL2 실험실로 전달 될 수있다. 여러 발표 된 연구에서, 우리는 웨스트 나일 바이러스에 감염된 쥐 13, 14에서 T 세포의 이펙터 기능을 측정하는 ICS를 사용했다. 이 잘 설립을했지만,이 분석의 한 가지 큰 단점은 절차가 매우 긴이며, BL3 시설 내에서 수행 할 때 소요되는 시간이 될 수 있다는 것입니다. 여기서, 마이크로 원심 분리 튜브 기반 ICS 방법보다, 실현 가능한 쉽게 진행하고 시간이 적게 BL3 실험실 내에서 수행 할 때 소요되는 것으로 나타났다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11875</td>
			<td>warm up at 37C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD11c magnetic beads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-001</td>
			<td>follow the manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD4 magnetic beads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-248</td>
			<td>follow the manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFSE</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OVA residue 323-339</td>
			<td>Genscript Corporation</td>
			<td>RP10610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:216px;">Peptides</td>
			<td style="width:153px;">Proimmune</td>
			<td>PC0AD-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Brefeldin A solution</td>
			<td style="width:153px;">BD Bioscience</td>
			<td align="right">555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:216px;">Mouse Fc Blocker</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>14-0161-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">APC-conjugated CD4&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>17-0041-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">FITC-conjugated CD8&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e- bioscience</td>
			<td>11-0081-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td style="width:153px;">BD- Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Permeabilization/wash buffer</td>
			<td style="width:153px;">BD- Bioscience</td>
			<td align="right">554723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">anti-IFNg-PE&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>12-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:216px;">Accuri flow cytometer</td>
			<td style="width:153px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of myd88-mediated cellular immune response to west nile virus mutant strain infection

마우스에서 야생형보다 높게 WNV 타고난 사이토킨 및 T 세포 반응을 유도 감쇠 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 비 구조적 (NS) 4B-P38G 변이체. 최근 골수 분화 인자 88 (에서 MyD88) 시그널링 WNV NS4B-P38G 돌연변이 감염시 초기 T 세포 프라이밍 및 메모리 T 세포의 발달에 중요한 것으로 나타났다. 본 연구에서 두 계측법 기반의 방법을 흐름 - 시험 관내 T 세포 프라이밍 분석 ​​및 세포 내 사이토 카인 염색 (ICS)는 - 수지상 세포 및 T 세포의 기능을 평가하기 위해 사용 하였다. OTII 트랜스 제닉 마우스의 CD4 + T 세포를 표지 - 분석 프라이밍 T 세포에서 세포 증식은 카르복시 플루오 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)으로 두 군의 쥐들로부터 수지상 세포의 공동 배양에 따라 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 보다 크게 전통 전체적인 감도를 개선하여 이러한 접근법은 CD4 + T 세포 증식의 비율의 정확한 결정을 제공알 방사성 시약 분석. microcentrifuge 관 시스템은 ICS 프로토콜 모두 세포 배양 및 사이토킨 염색 절차에서 사용 하였다. 기존의 조직 배양 플레이트 기반 시스템에 비해,이 수정 절차는 바이오 안전성 레벨 (BL) 3 시설에서 수행 쉬웠다. 또한, WNV- 감염된 세포는 BL3 시설 외부의 추가 분석을 가능 모두 분석에 파라 포름 알데히드로 처리 하였다. 전반적으로, 이러한 시험 관내 면역 분석법 효율적 WNV 감염시 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다.

- / - OVA 펩티드의 존재 또는 부재 쥐 T 세포 프라이밍 분석에서, CFSE 표지 된 CD4 + T 세포는 NS4B-P38G 감염된 변이체 야생형에서 MyD88 정제 수지상에서 배양 하였다. 오일은 음성 대조군으로 사용 하였다 표지 T 세포 또는 OVA없이 단독으로 배양 하였다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 총 T 세포 FL1 채널상의 형광 강도의 분석을 위해 게이팅 하였다. 마커는 수지상 세포를 공동 배...

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In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

in-vitro-analysis-myd88-mediated-cellular-immune-response-to-west

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

8.1K 조회수.  The University of Texas Medical Branch. Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

연구

면역학 및 감염병학

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

의 기생충 말벌에 대한 소개<em&gt; Drosophila</em&gt; 그리고 Antiparasite 면역 반응

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, transmission of antibiotic resistant bacteria between animals and humans, and the high cost of treating infections.
In this study, we disclose a new strategy that may be effective in preventing implant-associated infection based on the potential antimicrobial properties of platelet-rich plasma (PRP). Due to its well-studied properties for promoting healing, PRP (a biological product) has been increasingly used for clinical applications including orthopaedic surgeries, periodontal and oral surgeries, maxillofacial surgeries, plastic surgeries, sports medicine, etc.
PRP could be an advanced alternative to conventional antibiotic treatments in preventing implant-associated infections. The use of PRP may be advantageous compared to conventional antibiotic treatments since PRP is less likely to induce antibiotic resistance and PRP's antimicrobial and healing-promoting properties may have a synergistic effect on infection prevention. It is well known that pathogens and human cells are racing for implant surfaces, and PRP's properties of promoting healing could improve human cell attachment thereby reducing the odds for infection. In addition, PRP is inherently biocompatible, and safe and free from the risk of transmissible diseases.
For our study, we have selected several clinical bacterial strains that are commonly found in orthopaedic infections and examined whether PRP has in vitro antimicrobial properties against these bacteria. We have prepared PRP using a twice centrifugation approach which allows the same platelet concentration to be obtained for all samples. We have achieved consistent antimicrobial findings and found that PRP has strong in vitro antimicrobial properties against bacteria like methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Group A Streptococcus, and Neisseria gonorrhoeae. Therefore, the use of PRP may have the potential to prevent infection and to reduce the need for costly post-operative treatment of implant-associated infections.

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is a significant clinical complication. This study describes an approach using platelet-rich plasma (PRP) to prevent implant-associated infections, presents the protocol for preparing PRP with constant platelet concentration, and reports the newly identified antimicrobial properties of PRP and related protocols for examining such antimicrobial properties in vitro.

준비를 한 다음 감염을 방지하기 위해 새로운 접근 방식으로 PRP<em&gt; 체외에서</emPRP의&gt; 항균 속성

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

마우스 모델을 평가 타고 난 면역 반응 포도 상 구 균 감염

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...