이 연구에서 분석된 인간 뇌 표본을 제공해 주신 매사추세츠 종합 병원, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology의 Bruce Fischl에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 보조금 계약 번호 654148(Laserlab-Europe)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프레임워크 프로그램으로부터, 특정 보조금 계약 번호 785907(Human Brain Project SGA2) 및 No. 945539(Human Brain Project SGA3)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 Framework Programme for Research and Innovation으로부터 자금을 지원받았으며, 수상 번호 U01 MH117023에 따라 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 종합병원 법인 센터(General Hospital Corporation Center)로부터 보조금을 받았습니다. Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI 연구 인프라)의 틀에서 이탈리아 교육부에서. 마지막으로, 이 연구는 "Fondazione CR Firenze"의 기여로 수행되었습니다. 이 작업의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.

포르말린 고정 인체 조직 샘플은 매사추세츠 종합병원(MGH) 부검 서비스(미국 보스턴)의 신경병리학과에서 제공하였다. 서면 동의는 Partners Institutional Biosafety Committee(PIBC, 프로토콜 2003P001937)의 IRB 승인 조직 수집 프로토콜에 따라 사망 전에 건강한 참가자로부터 얻었습니다. 승인 문서는 미국 매사추세츠주 보스턴에 있는 MGH 부검 서비스에 보관되며 요청 시 제공됩니다.
1. 아가로스 임베딩 및 시료 절단
<ol><li>비커에 4x 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 1% w/v 아가로스 용액을 준비하고 내부에 조직 블록을 삽입합니다. 실온(RT)에 도달할 때까지 기다렸다가 4°C에서 24시간 동안 보관합니다.</li>
	<li>고정밀 절편을 얻으려면 샘플을 비브라톰의 시편 디스크에 붙이고 트레이를 차가운 1x PBS(pH 7.4)로 채웁니다. 슬라이스할 조직의 유형에 따라 주파수, 진폭 및 속도와 같은 진동 매개변수를 조정합니다(사용된 값: 주파수 = 5(50Hz), 진폭 = 0.4, 속도 = 3(0.15mm/s). 알림: 샘플 볼륨에 따라 다른 진동을 사용해야 합니다. 최대 부피가 70 x 40 x 15 mm인 샘플의 경우 진동체(예: Leica VT1000 S)를 사용할 수 있습니다. 더 큰 샘플의 경우, 압축체(예를 들어, VF-900-0Z 마이크로톰(18)) 또는 주문형 장치(21)를 사용할 수 있다. 여기에서는 400μm 또는 500μm 두께로 절단된 슬라이스를 제공합니다.</li>
	<li>절단 후 모든 슬라이스를 1x PBS(pH 7.4)와 0.01% w/v 아지드화나트륨(NaN3)으로 구성된 보존제 용액에 넣고 4°C에서 보관합니다. 알림: 삽입하기 전에 아가로스 용액이 37°C에 도달할 때까지 기다리십시오. 온도가 높으면 시편이 손상될 수 있습니다. 장기간 고정하면 항원이 손상되고 조직 자가형광이 증가하여 라벨링 절차를 방해할 수 있으므로 샘플을 PFA에 48시간 이상 방치하지 않는 것이 좋습니다. 인체 조직의 장기 보관을 위해 NaN3 가 함유 된 PBS를 사용하여 미생물 오염을 방지합니다. NaN3 의 독성으로 인해 화학 후드 아래에서 보존제 용액을 준비하십시오.</li>
</ol>2. 조직 고정
참고: 다음 프로토콜에 사용된 모든 용액은 동일한 조직 블록의 모든 슬라이스를 처리하고 기술적 변동성을 최소화하며 개별 단계의 시간을 줄이기에 충분한 대량으로 준비됩니다.
<ol><li>50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0.1M 염산(HCl), 25% v/v 0.1M 칼륨 수소 프탈레이트(KHP) 및 신선한 4% v/v 글루타르알데히드로 스위치 끄기 용액을 준비합니다. 모든 샘플을 나사 뚜껑(70 x 23mm)이 있는 접시에 넣고 4°C에서 1일 동안 부드럽게 흔들어 스위치 끄기 용액으로 배양하고 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호합니다.</li>
	<li>1x PBS(pH 7.4)와 신선한 1% v/v 글루타르알데히드로 스위치 온 용액을 준비합니다. 모든 샘플을 새 접시에 넣고 4°C에서 1일 동안 부드럽게 흔들면서 스위치 온 용액으로 배양하고 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호합니다. 알림: 글루타르알데히드의 높은 독성과 빛에 민감하기 때문에 스위치 오프 및 스위치 온 용액은 항상 신선하게 준비해야 하며 얼음 위의 화학 후드 아래에 보관해야 합니다. 항상 접시에 각 용액 20mL를 채우고 파라필름으로 밀봉합니다.</li>
</ol>3. 비활성화 및 지우기
참고: 샘플의 반응성 글루타르알데히드는 1x PBS pH 7.4, 4% w/v 아세트아미드, 4% w/v 글리신, pH 9.0으로 구성된 불활성화 용액으로 배양하여 비활성화해야 합니다. 용액은 4°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다. 지질을 제거하고 조직을 투명하게 만들기 위해 200mM 도데실 설페이트(SDS), 20mM 아황산나트륨(Na2SO3) 및 20mM 붕산(H3BO3), pH 9.0으로 구성된 투명화 용액을 사용합니다. 용액은 SDS가 4°C에서 침전되므로 RT에 보관해야 합니다. 다음 단계는 모두 용액으로 채워진 튜브에서 수행됩니다.
<ol><li>샘플을 접시에서 튜브로 옮기고 RT에서 1x PBS pH 7.4로 3 x 2시간 동안 부드럽게 흔들어 세척합니다. 알림: 3.1단계의 경우 글루타르알데히드 독성 때문에 화학 후드 아래에서 작업해야 합니다. 아세트아미드, SDS 및 붕산도 독성 시약이므로 화학 후드 아래에서 취급해야 합니다. 항상 각 용액 50mL를 튜브에 채웁니다.</li>
	<li>샘플을 37°C의 불활화 용액에 넣고 수조에서 밤새 배양합니다(o/n).</li>
	<li>RT에서 1x PBS pH 7.4에서 3 x 2시간 동안 부드럽게 흔들어 세척합니다.</li>
	<li>샘플을 55°C의 세척액에서 3-7일 동안 수조에서 배양합니다. 2일마다 용액을 교체하십시오(표 1).</li>
</ol>4. 면역표지
참고: 라벨링 단계 전에 잔류 SDS를 제거하고, 자가형광을 줄이고, 10mM Tris 염기, 1mM EDTA 및 0.05% v/v 트윈 20, pH 9로 구성된 항원 회수 용액으로 에피토프를 가림을 해제해야 합니다. 용액의 pH 9는 효율적인 회수 공정에 최적화되어 있습니다. 트리스 베이스는 안정적인 pH 환경을 유지하기 위한 완충제 역할을 합니다. 킬레이트제인 EDTA는 항원의 접근성을 향상시킵니다. 비이온성 세제 Tween 20은 조직의 투과성을 개선하는 데 도움이 됩니다. 이 용액은 4°C에서 보관할 수 있습니다. 항원 회수 단계와 결합된 과산화수소는 비특이적 배경 신호(예: 리포푸신)를 담당하는 내인성 형광단을 분해 및/또는 변형하여 자가형광 신호를 감소시키는 데 시너지 효과를 갖는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
<ol><li>0.1% v/v Triton X-100(PBST)으로 PBS 1개를 준비하고 37°C로 예열한 다음 인큐베이터에서 37°C에서 부드럽게 흔들면서 낮 동안 3 x 3시간 동안 샘플을 세척합니다. 마지막 세탁 o/n은 그대로 두십시오. 알림: PBST 원액을 4°C에서 보관하십시오. SDS는 후속 취득 과정을 방해할 수 있는 저온에서 불용성 침전물을 형성할 수 있으므로 조직에서 제거하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>다음날 각 샘플에 30% v/v 과산화수소(H2O2) 10mL를 넣고 실온에서 45분 동안 부드럽게 흔들어 둡니다.</li>
	<li>1x PBS(pH 7.4)로 3 x 10분 동안 RT에서 부드럽게 흔들어 세척합니다.</li>
	<li>항원 회수 용액을 수조에서 95°C로 예열합니다. 샘플을 가열된 용액으로 옮기고 95°C에서 10분 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>표본을 부드럽게 흔들면서 40분 동안 RT로 식히십시오.</li>
	<li>3 x 5 분 동안 탈 이온수로 부드럽게 흔들어 씻으십시오.</li>
	<li>PBS에서 4°C에서 15분 동안 평형을 유지합니다.</li>
	<li>0.01% w/vNaN3 (1.3단계 참고 참조)의 PBST로 만든 새로운 항체 용액을 준비하고 1차 항체를 추가합니다. 부드럽게 흔들고 빛으로부터 보호하는 인큐베이터에서 37°C에서 n일(1-7) 동안 스크류 뚜껑이 있는 접시에 용액과 함께 샘플을 배양합니다(표 2). 참고: 배양 시간은 크기와 두께에 따라 다릅니다(표 1 및 표 2).</li>
	<li>n일 후 샘플을 튜브로 옮기고 인큐베이터에서 부드럽게 흔들면서 37°C에서 예열된 PBST로 3 x 2시간 세척합니다.</li>
	<li>0.01% w/vNaN3 의 PBST에 2차 항체를 추가하고 부드럽게 흔들고 빛으로부터 보호되는 인큐베이터에서 n일 동안 37°C(1-6)의 나사 뚜껑이 있는 새 접시에 샘플을 배양합니다(표 1 및 표 2).</li>
	<li>n일 후 샘플을 튜브로 옮기고 부드럽게 흔드는 인큐베이터에서 37°C에서 예열된 PBST로 낮 동안 3 x 3시간 동안 세척합니다. 마지막 세탁 o/n은 그대로 두십시오. 참고: Triton X-100 및 Tween 20은 점성이 있으므로 팁이 채워질 수 있도록 천천히 피펫팅합니다. 항상 각 용액 50mL를 튜브에 채웁니다. 각 샘플에 대해 10mL의 항체 용액을 사용하고 용액의 증발을 방지하기 위해 파라필름으로 접시를 밀봉합니다. 항체 용액에는 NaN3 가 포함되어 있기 때문에 4 °C에서 보관하고 2 주 이내에 새 검체를 라벨링하는 데 재사용할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 굴절률 매칭
알림: 높은 수준의 투명도를 얻으려면 조직 굴절률을 균질화해야 합니다. 여기서는 1x PBS에 희석된 2,2'-티오디에탄올(TDE)을 사용합니다. TDE 솔루션은 RT에 저장해야 합니다.
<ol><li>샘플을 새 접시로 옮기고 30% v/v TDE를 추가한 다음 RT에서 부드럽게 흔들면서 4시간 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>30% v/v TDE 용액을 제거하고 샘플에 68% v/v TDE를 추가한 다음 RT에서 부드럽게 흔들어 둡니다. 알림: TDE는 점성이 있으므로 팁이 채워질 수 있도록 천천히 피펫팅합니다. TDE 증기 또는 미스트 흡입은 호흡기를 자극할 수 있습니다. 따라서 환기가 잘 되는 곳에서 작업하거나 흄 후드를 사용하여 노출을 최소화하는 것이 좋습니다. TDE 용액은 RT에 보관해야 합니다. 각 샘플에 대해 10mL의 TDE 용액을 사용합니다.</li>
</ol>6. 샘플 장착
참고: 샘플 장착 및 LSFM 이미지 획득을 용이하게 하기 위해 현미경 슬라이드, 스페이서 및 커버슬립의 세 부분으로 구성된 맞춤형 밀봉된 샘플 홀더("샌드위치"라고 함)를 사용합니다.
<ol><li>강철 스페이서(56 x 56 x 0.5mm3)를 현미경 슬라이드(60 x 60 x 1mm3) 위에 놓고 샘플을 현미경 슬라이드에 놓습니다.</li>
	<li>석영 커버슬립(60 x 60 x 0.5mm3)을 조심스럽게 넣고 모든 것을 함께 클립으로 고정하고 1:1 비율로 2액형 실리콘 접착제를 준비합니다. 석영 커버슬립을 사용하여 굴절률을 일치시키고 획득 과정에서 광학 수차를 줄입니다.</li>
	<li>1mL 주사기를 사용하여 스페이서와 커버슬립 사이의 공간을 2액형 실리콘 접착제로 채우고 10분 동안 건조시킵니다.</li>
	<li>클립을 제거하고 작은 바늘을 사용하여 샌드위치 전체를 68% v/v TDE로 천천히 채웁니다.</li>
	<li>신선한 접착제를 만들고 샌드위치를 밀봉하십시오. 알림: TDE가 6.1단계에서 실수로 스페이서에 도달하면 접착제가 경화되지 않습니다. 6.2단계에서 기포가 형성되지 않도록 하십시오.</li>
</ol>7. 스트리핑
참고: SHORT의 구조적 보존과 향상된 에피토프 접근성은 항체를 제거하고 다른 마커로 샘플을 다시 염색하여 절편의 다중 라운드 라벨링을 가능하게 합니다.
<ol><li>칼날로 샌드위치를 열고 30% v/v TDE로 채워진 나사 뚜껑이 있는 새 접시에 표본을 넣고 3시간 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>샘플을 튜브로 옮기고 RT에서 1x PBS(pH 7.4)에서 부드럽게 흔들어 3 x 2시간 동안 세척한 다음 마지막 세척 o/n을 그대로 둡니다.</li>
	<li>샘플을 80°C의 수조에서 4시간 동안 세척액에 넣습니다.</li>
	<li>37°C에서 1x PBST(pH 7.4)에서 3 x 2시간 동안 부드럽게 흔들어 세척하고 마지막 세척 o/n을 그대로 둡니다. 이제 4.8단계부터 샘플에 다시 레이블을 지정할 준비가 되었습니다. 알림: 항상 튜브에 각 용액 50mL를 채우십시오. 각 샘플에 10mL의 TDE 용액을 사용합니다.</li>
</ol>

SHORT 및 LSFM을 이용한 인간 뇌의 고해상도 3D 재구성

<ol>
	<li>Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+and+ex-vivo+optical+clearing+methods+for+biological+tissues:+review.">In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review.</a> Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).</li><li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing.">Tissue clearing.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+practical+considerations+for+tissue+clearing+and+imaging.">Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+Scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems.">Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale,+cell-resolution+volumetric+mapping+allows+layer-specific+investigation+of+human+brain+cytoarchitecture.">Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture.</a> Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).</li><li>Lai, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+histology+methods+for+three-dimensional+imaging+of+fresh+and+archival+human+brain+tissues.">Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues.</a> Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs.">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+enhancement+for+label-free+imaging+of+myelinated+fibers+in+mammalian+brains.">Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).</li><li>Pesce, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+molecular+phenotyping+of+cleared+human+brain+tissues+with+light-sheet+fluorescence+microscopy.">3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy.</a> Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).</li><li>Schueth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+3D+light-sheet+imaging+of+very+large-scale+optically+cleared+human+brain+and+prostate+tissue+samples.">Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples.</a> Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).</li><li>Morawski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+3D+microscopy+with+CLARITY+on+human+brain+tissue:+Towards+a+tool+for+informing+and+validating+MRI-based+histology.">Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology.</a> NeuroImage. 182, 417-428 (2018).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+platform+for+multi-scale+molecular+imaging+and+phenotyping+of+the+human+brain.">Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+resolution+atlas+of+Broca's+area.">A cellular resolution atlas of Broca's area.</a> Science Advances. (9), eadg3844 (2023).</li><li>Scardigli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+for+three-dimensional+reconstruction+of+human+brain+cellular+anatomy+using+advanced+imaging+techniques.">Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).</li><li>Pesce, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+human+cerebral+cortex+using+confocal+microscopy.">Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li><li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging.">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li><li>Belle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tridimensional+visualization+and+analysis+of+early+human+development.">Tridimensional visualization and analysis of early human development.</a> Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).</li><li>Sorelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+enhancement+and+3D+orientation+analysis+in+label-free+two-photon+fluorescence+microscopy.">Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology.">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), dev199369 (2021).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+The+human+brain+multiscale+imaging+challenge.">Editorial: The human brain multiscale imaging challenge.</a> Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).</li></ol>

저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.

인간의 큰 뇌 부위를 고분해능 이미징 및 3D로 재구성하려면 기계적 조직 절편에 이어 광학 투명화 및 단일 절편의 면역 표지가 필요합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 LSFM을 사용한 세포 내 분해능으로 3D 뇌 재구성을 위해 여러 인간 뇌 두께 절편의 신속한 동시 처리에 SHORT 조직 형질전환 방법을 사용할 수 있는 방법을 설명합니다.
다른 접근 방식과 달리 SHORT 방법을 사용하?...

대량의 인간 뇌의 3D 분자 조직과 세포 구조를 분석하려면 광범위한 처리 시간이 소요되는 프로토콜을 통해 표본의 광학적 투명성이 필요합니다. 광학 투명화 기술은 조직 내 굴절률(RI)의 이질성을 최소화하여 광 산란을 줄이고 고해상도 이미징을 위한 광 투과 깊이를 증가시키기 위해 개발되었습니다 1,2,3,4,5. 투명화 및 심층 조직 표지 방법의 현재 발전은 최첨단 현미경 기술 6,7,8,9,10,11,12 을 활용하여 온전한 설치류 장기 및 배아의 체적 이미징을 가능하게 합니다.
그러나 사후 인간 뇌의 넓은 영역에 대한 체적 3D 재구성은 모델 유기체에 비해 여전히 어려운 작업입니다. 복잡한 생물학적 조성과 가변적인 사후 고정 및 보관 조건은 조직 투명화 효율, 항체 침투 깊이 및 항원결정기 인식을 손상시킬 수 있습니다 13,14,15,16,17,18,19. 더욱이, 큰 인간 뇌 영역의 효율적인 투명화 및 균일한 표지를 달성하기 위해서는 기계적 조직 절편과 각 절편의 후속 투명화 및 표지가 여전히 필요하며, 그 결과 모델 유기체에 비해 처리 시간이 길고 정교한 맞춤형 장비가 필요합니다 15,20,21,22.
SWITCH - H 2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) 조직 형질전환 기술은 인간 뇌18,23의 많은 양을 분석하기 위해 특별히 개발되었다. 이 방법은 에피토프 복원과 함께 SWITCH 프로토콜11의 조직 구조 보존과 고농도의 과산화수소를 사용하여 조직 자가형광을 감소시킵니다. SHORT는 다양한 신경 아형, 신경교세포, 혈관 및 수초화 섬유에 대한 마커를 사용하여 인간 뇌 절편의 균일한 염색을 허용합니다18,24. 그 결과는 저밀도 및 고밀도 단백질의 분석과 모두 호환됩니다. 그 결과 높은 투명도 수준과 균일한 라벨링은 형광 현미경으로 두꺼운 슬라이스의 체적 재구성을 가능하게 하며, 특히 빠른 획득을 위해 광시트 장치를 사용할 수 있습니다 18,24,25,26,27.
이 연구에서는 SHORT 조직 형질전환 기법을 사용하여 수십 개의 포르말린 고정 인간 뇌 절편을 동시에 투명화하고 다중으로 표지하는 방법을 설명합니다. 4개의 서로 다른 형광 마커를 함께 사용할 수 있어 서로 다른 세포 하위 집단을 식별할 수 있습니다. 투명화 후 형광 현미경으로 고해상도 체적 이미징을 수행할 수 있습니다. 여기서는 맞춤형 도립 LSFM 18,24,25,26,27을 사용하여 샘플의 빠른 광학 절편과 여러 채널을 병렬로 빠르게 수집할 수 있습니다. 이러한 일상적으로 높은 처리량의 프로토콜을 사용하여, 전체 Broca의 영역(23)의 매핑에서 이미 입증된 바와 같이 인간 뇌의 넓은 영역에 대한 세포 내 분해능으로 포괄적인 세포 및 구조적 특성 분석을 얻을 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2&#39;-thiodiethanol</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetamide &#62;= 99.0% (GC)</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressome VF-900-0Z Microtome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>LaserOptex</td>
			<td>/</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC_29096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator ISS-4075</td>
			<td>Lab companion&#160;</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Attak</td>
			<td>Henkel Italia srl</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Laborchimica</td>
			<td>/</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffer saline tablet</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picodent Twinsil</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>13005002</td>
			<td>out of production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phtalate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P1088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfite</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>S0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>Microlaser srl</td>
			<td></td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputum Containers (dishes with screw lids)</td>
			<td>Paul Boettger GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>07.061.2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>PanReac AppliChem (ITW reagents)</td>
			<td>A4577,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62 547254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath&#160;</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 7-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>611-545-215</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>805-545-180</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>611-605-215</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN Antibody</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>Dilution used, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin antibody (PV)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32895</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8069</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calretinin Polyclonal antibody</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>12278_1_AP</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Dilution used, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175700</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150107</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568) preadsorbed</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175475</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150169</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175711</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150171</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab194324</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin Antibody YC7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-47706</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vasoactive intestinal peptide (VIP)</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>16233-1-AP</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and labeling for light-sheet fluorescence microscopy in large-scale human brain imaging

지난 10년 동안 등장한 수많은 클리어링 기술에도 불구하고 사후 인간 뇌를 처리하는 것은 크기와 복잡성으로 인해 마이크로미터 해상도의 이미징을 특히 어렵게 만드는 어려운 작업으로 남아 있습니다. 이 논문은 광시트 형광 현미경(LSFM)으로 샘플의 투명화, 라벨링 및 순차 이미징을 가능하게 하는 SHORT(SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) 조직 형질 전환 프로토콜로 수십 개의 섹션을 동시에 처리하여 인간 뇌의 체적 부분을 재구성하는 프로토콜을 제시합니다. SHORT는 여러 신경 세포 마커가 있는 두꺼운 절편의 신속한 조직 투명화 및 균질한 다중 표지를 제공하여 백질 및 회백질 모두에서 다양한 신경 하위 집단을 식별할 수 있습니다. 클리어링 후 슬라이스는 LSFM을 통해 마이크로미터 해상도로 여러 채널에서 동시에 이미징되어 신속한 3D 재구성이 가능합니다. 일상적으로 높은 처리량의 프로토콜 내에서 SHORT와 LSFM 분석을 결합함으로써 짧은 시간에 고해상도로 큰 부피 영역의 3D 세포 구조 재구성을 얻을 수 있으므로 인간 뇌의 포괄적인 구조적 특성 분석이 가능합니다.

Analyzing the 3D molecular organization and cytoarchitecture of large volumes of the human brain requires optical transparency of specimens, achieved through protocols with extensive processing time. Optical clearing techniques were developed to minimize heterogeneity in refractive index (RI) within the tissues, thereby reducing light scattering and increasing the light penetration depth for high-resolution imaging1,2,3,4,5. Current advances in clearing and deep tissue-labeling methods allow volumetric imaging of intact rodent organs and embryos by exploiting cutting-edge microscopy techniques6,7,8,9,10,11,12.
However, volumetric 3D reconstruction of large areas of the postmortem human brain still represents a challenging task compared with model organisms. The complex biological composition and the variable postmortem fixation and storage conditions can compromise the tissue clearing efficiency, the antibody penetration depth, and the epitope recognition13,14,15,16,17,18,19. Moreover, mechanical tissue sectioning and subsequent clearing and labeling of each slice is still required to achieve an efficient clearing and uniform labeling of large human brain areas, resulting in long processing times and the need for sophisticated custom equipment,&#160;compared with model organisms15,20,21,22.
The SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) tissue transformation technique has been developed specifically to analyze large volumes of the human brain18,23. This method employs the tissue structural preservation of the SWITCH protocol11 and high concentrations of peroxide hydrogen to decrease tissue autofluorescence, in combination with epitope restoration. SHORT allows uniform staining of human brain slices with markers for different neuronal subtypes, glial cells, vasculature, and myelinated fibers18,24. Its results are compatible with the analysis of both low- and high-density proteins. The resulting high transparency levels and uniform labeling enable volumetric reconstruction of thick slices with fluorescence microscopy, in particular, for fast acquisition light-sheet apparatus can be used18,24,25,26,27.
In this work, we describe how the SHORT tissue transformation technique can be used for simultaneous clearing and multi-round labeling of tens of formalin-fixed human brain sections. Four different fluorescent markers can be used together, leading to the identification of different cellular sub-populations. After clearing, high-resolution volumetric imaging can be performed with fluorescence microscopy. Here, we used a custom-made inverted LSFM18,24,25,26,27, which enables fast optical sectioning of the sample and rapid acquisition of multiple channels in parallel. With this routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain a comprehensive cellular and structural characterization with a sub-cellular resolution of large areas of the human brain as already demonstrated in the mapping of an entire Broca&#39;s area23.

저자 스포트라이트: Advancing 3D Cytoarchitecture Analysis - Rapid Volumetric Reconstruction of the Human Brain (3D 세포구조 분석의 발전 - 인간 뇌의 신속한 체적 재구성) 

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging(대규모 인간 뇌 영상에서 광시트 형광 현미경을 위한 광학 투명화 및 라벨링)

The human brain is a complex organ spanning different skills. To understand its functionality, it's essential to construct a detailed cell sensors across the whole brain. Our routinely high-throughput protocol permits the analysis of 3D cytoarchitecture of volumetric areas of the human brain with micrometer resolution, enabling its structural characterization.Volumetric reconstruction of large areas of the human brain presents several experimental challenges linked to the massive dimensions of brain samples, the complex biological composition, the variable postmortem fixation and storage conditions, and the autofluorescent signals from lipofuscin-type pigments. All these can compromise the optical clearing efficiency and demonstrating quality. Compared to other clearing techniques, the short tissue transformation method combined with light sheet microscopy imaging can be used for rapid and simultaneous processing of multiple human brain sections.These result in 3D brain reconstruction with a subcellular resolution.

여기에 설명된 프로토콜은 SHORT 방법을 사용하여 두께가 100μm에서 500μm에 이르는 여러 슬라이스를 동시에 처리할 수 있습니다. 이 접근 방식은 전체 절차의 전체 처리 시간을 크게 줄입니다. 이 작업에서는 여러 사후 인간 뇌 두께 절편을 동시에 처리하기 위한 전체 파이프라인(그림 1)에 대한 포괄적인 설명을 제공하고 한 번에 24개 슬라이스에 대한 프로토콜을 시연합니다(<...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing 3D Cytoarchitecture Analysis — Rapid Volumetric Reconstruction of the Human Brain at JoVE.com

본 프로토콜은 (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its ...

인간의 뇌는 다양한 기술을 가진 복잡한 기관입니다. 그 기능을 이해하려면 뇌 전체에 걸쳐 상세한 세포 센서를 구성하는 것이 필수적입니다. 당사의 일상적으로 높은 처리량 프로토콜을 사용하면 마이크로미터 분해능으로 인간 뇌의 체적 영역에 대한 3D 세포 구조를 분석할 수 있어 구조적 특성 분석이 가능합니다.인간 뇌의 넓은 영역에 대한 체적 재구성은 뇌 샘플의 방대한 크기, 복잡한 생물학적 구성, 다양한 사후 고정 및 보관 조건, 리포푸신형 색소의 자가형광 신호와 관련된 몇 가지 실험적 과제를 제시합니다. 이 모든 것이 광학 투명화 효율성과 품질 입증을 손상시킬 수 있습니다. 다른 투명화 기법과 비교했을 때, 광시트 현미경 이미징과 결합된 단조직 형질전환 방법은 여러 인간 뇌 절편의 빠르고 동시적인 처리에 사용할 수 있습니다.그 결과 세포 내 해상도로 3D 뇌 재구성이 가능합니다.

optical-clearing-labeling-for-light-sheet-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

1.4K 조회수.  University of Florence. 인간의 뇌는 다양한 기술을 가진 복잡한 기관입니다. 그 기능을 이해하려면 뇌 전체에 걸쳐 상세한 세포 센서를 구성하는 것이 필수적입니다. 당사의 일상적으로 높은 처리량 프로토콜을 사용하면 마이크로미터 분해능으로 인간 뇌의 체적 영역에 대한 3D 세포 구조를 분석할 수 있어 구조적 특성 분석이 가능합니다.인간 뇌의 넓은 영역에 대한 체적 재구성은 뇌 샘플의 ...