분석을 시작하기 전에, 우리는 다음의 시약이 올바르게 준비되었는지 확인해야합니다 : <ol><li> 50 MM의 칼륨 인산 버퍼, 산도 7.5. 11.4 MG / 칼륨 phospate 이염, 물을 정화하고 1M HCL과 산도를 조정에 trihydrate의 ML을 사용하여 준비합니다. 이 솔루션은 사용하기 전에 ° C 37 배치됩니다. </li><li> 50 MM의 칼륨 인산 버퍼에 카제인의 6.5 MG / ML을 혼합하여 준비 0.65 % 중량 / 부피 카제인 솔루션. 점차적 ° C 10 분 정도 동질적인 분산이 이루어 때까지 80-85로 부드러운 감동과 솔루션 온도를 증가. 이 솔루션을 끓여서하지 않는 것이 매우 중요합니다. NaOH와 HCL와 함께 필요한 경우 산도 그런 다음 조정됩니다. </li><li> 물을 정화와 6.1N 재고 1시 55분을 diluting하여 준비 110 MM Trichloroacetic 산성 용액. Trichloroacetic의 산성이 강한 산성이며 유의해서 다루어 져야합니다. </li><li> 0.5 MM Folin &amp; Ciolcaltea의, 또는 직접적으로 프로 테아제의 활동과 관련이있을 것입니다 측정 색 변화를 생성하는 티로신과 반응 솔루션입니다 Folin의 페놀 시약. Folin의 페놀 시약은 산성이며 유의해서 다루어 져야합니다. </li><li> 물을 정화에 anyhydrous 나트륨 탄산의 53 MG / ML을 사용 준비 500 MM 나트륨 탄산 솔루션. 37 5mM 칼슘 아세테이트 10 MM의 아세트산 나트륨 버퍼, 산도 7.5의 효소로 구성되어 희석제 솔루션 ° C. 이 솔루션은 우리가 고체 테아제 샘플을 분해 또는 효소 솔루션을 희석하는 데 사용하는 어떤 것입니다. </li><li> 1.1 MM L - 티로신 표준 재고 솔루션입니다. 물을 정화하고 티로신이 해소 때까지 부드럽게 온수 0.2 MG / ML L - 티로신을 사용하여 준비 하였다. 카제인과 마찬가지로이 솔루션을 끓여하지 않습니다. L - 티로신 표준 실온으로 냉각하도록 허용합니다. 이 솔루션은 표준 곡선을 만들기 위해 더욱 희석됩니다. </li><li> 단백 분해 효소 솔루션입니다. 사용하기 전에 즉시, 6 단계에서 준비 효소 희석제 솔루션 테아제를 해산. </li></ol> 필요한 경우, 0.1-0.2 단위 / ML하는 효소 희석액을 사용하여 해산합니다 예정된 활동의 견고한 프로 테아제 샘플을 사용합니다. 이 솔루션은 품질 관리 분석에 대한 긍정적인 제어로 우리가 효소 활동을 결정하기 위해 수행되는 계산에 대한 검증 역할을합니다. 단백 분해 효소 분석 및 표준 곡선 설정 <ol><li> 이 분석을 시작하려면 약 15 MLS를 개최합니다 적절한 튜브를 찾으십시오. 테스트 각 효소에 대한 4 튜브가 필요합니다. 한 병에가 빈로 사용되며, 세 사람은 프로 테아제의 세 dilutions의 분석 활동하는 데 사용됩니다. 서로에 대한 최종 계산을 확인할 때 세 dilutions가 유용합니다. <ol><li> 네 튜브의 각 설정하려면, 우리의 0.65 %의 카제인 솔루션의 5mls를 추가합니다. 그들이 37 물 목욕으로 평형하자 ° C를 약 5 분하십시오. </li><li> 공백이 아닌 테스트 샘플 튜브 세 가지로 테스트됩니다 효소 솔루션의 볼륨을 변화하지만, 추가합니다. ° C 정확히 십분을 휘몰아치는 37에 대한 부화하여 섞는다. 이 배양 시간 동안 프로 테아제의 활동과 티로신의 결과적 해방은 측정 및 테스트 샘플 사이에 비교 될거야. </li></ol></li><li> 이 10 분 부화 후, 반응을 중지 각 튜브에 TCA 시약의 5​​ MLS를 추가합니다. 그런 다음, 각 튜브에 심지어 빈, 그래서 각각의 튜브에 효소 용액의 최종 부피가되는 한 ML을 효소 솔루션의 적절한 볼륨을 추가합니다. 이것은 효소 자체의 흡광도 값을 고려하여 각 튜브의 최종 볼륨이 동일한지 확인하는 일을합니다. 37 솔루션을 품어 ° C를 30 분. 이 30 분 동안 부화, 당신은 티로신 표준 dilutions을 설정할 수 있습니다. 쉽게 팔 MLS를 저장할 수있는 6 DRAM 튜브 (DRAM의 튜브가 폴리 프로필렌 튜브로 대체 수 있습니다)를 사용합니다. 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50 : 여섯 튜브하려면, MLS에서 다음 볼륨으로 1.1 MM 티로신 표준 재고 솔루션을 추가합니다. 빈 어떤 티로신 표준을 추가하지 마십시오. 낮은 표준은 약간의 색상 변화를 얻을 것입니다 불순한 테스트 샘플에 필요한 수 있습니다. 티로신 표준 솔루션이 추가되면, 2 MLS에 볼륨을 가져 기준 각 정화 물을 적절한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 30 분 부화 후, 테스트 솔루션의 각 필터와 빈이 0.45 음 polyethersulfone 주사기 필터를 사용합니다. 여과는 시료로부터 insolubles를 제​​거하는 데 필요합니다. <ol><li> 최소한 8 MLS를 저장할 수있는 4 DRAM의 튜브로 여과 2 테스트 샘플의 MLS와 빈 여과물을 추가합니다. 기준가 준비가되어있는 유리병의 동일한 유형을 사용하실 수 있습니다. </li><li> 기준 및 표준 공백이 들어있는 유리병 모든, 나트륨 탄산염의 5mls를 추가합니다. 최상의 결과를 얻으려면, 즉시 나중에 Folin의 시약 1 ML를 추가합니다. </li><li> Folin의 시약을 추가하여 만든 산도 드롭을 규제하기 위해 나트륨 탄산염을 추가합니다. </li><li> 테스트 샘플 드디어으로 나트륨 탄산 추가t 비워. 이러한 솔루션은 나트륨 탄산염의 추가 후 흐림된다. 무료 티로신과 주로 반응 Folin의 시약을 추가합니다. </li><li> 소용돌이 치는하여 DRAM의 튜브를 섞어 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 이 부화 후, 당신은 표준 티로신 추가의 금액과 연관 색상의 그라데이션이 있다고 통지해야한다 티로신의 최고 농도는 어두운 게재. 당신은 또한 우리의 테스트 샘플에서 감지할 수있을 정도의 색상 변경을 통지하실 수 있습니다. 이러한 솔루션 2mls는 적합한 cuvettes에 0.45 음 polyethersulfone 주사기 필터를 사용하여 필터링됩니다. 분석이 수행되는 이제, 당신은 우리의 흡광도 값을 기록 분광 광도계로 진행할 수 있습니다. </li></ol> 흡광도를 측정하고 효소 활동을 계산 <ol><li> 샘플의 흡광도는 660nm의 파장을 사용하여 분광 광도계로 측정됩니다. 조명 경로는 1cm로 설정됩니다. 표준, 표준 빈, 다른 시험 샘플 테스트 비워에 대한 흡광도 값을 기록합니다. 일단 모든 데이터가 수집되어, 표준 곡선을 만들 수 있습니다. 표준 및 표준 빈 사이의 흡광도의 곡선을 생성하기 위해 차이는 계산해야합니다. 이것은 표준 솔루션 티로신의 양에 기인 흡광도 값이다. 이 간단한 계산 후, Y 축에 대한 기준 흡광도의 변화, 대 X 축에 대한 다섯 표준의 각 micromoles에 금액을 계획하는 그래프 프로그램을 사용하여 표준 곡선을 만듭니다. <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> 티로신 표준의 볼륨 </th><th style="text-align:center"> uMoles의 티로신 </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.05 </td><td style="text-align:center"> 0.055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.10 </td><td style="text-align:center"> 0.111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.20 </td><td style="text-align:center"> 0.221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.40 </td><td style="text-align:center"> 0.442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.50 </td><td style="text-align:center"> 0.553 </td></tr></tbody></table></li><li> 데이터 포인트가 입력되고 나면, 가장 적합한 및 해당 슬로프 방정식의 라인을 생성합니다. 테스트 샘플 흡광도 및 테스트 빈의 흡광도의 차이를 계산하여 테스트 샘플의 흡광도 변화를 찾으십시오. 슬로프 방정식에 테스트 샘플 중 하나에 대한 흡광도 값을 삽입 및 해결하면이 특정 proteolytic 반응 동안 티로신 해방의 micromoles가 발생합니다. / ML 당 단위로 효소의 활동을하려면, 다음과 같은 계산을 수행합니다 : (umole 티로신 등가물이 발표) X (11) 단위 / ML 효소 = __________________________________________ (1) X (10) X (2) 분석 11 = 총 볼륨 (밀리리터)을 분석 10 = 시간 (분)을 단위로 정의 당 한 효소의 효소 = 볼륨 (밀리리터)를 사용 Colorimetric 결정에 사용되는 2 = 볼륨 (밀리리터)을 슬로프 방정식에서 얻은 micromoles 티로신 동일한 릴리스의 개수를 가지고 우리의 경우에는 11mls있다 MLS에서 분석의 총 볼륨에 의해 그것을 곱하면됩니다. 세 가지 다른 수량하여이 값을 나누기 : 우리가 10 분 동안 실행된 분석의 시간, 분석에 사용되는 효소의 볼륨은, (가 1ml를 사용하자) 다양한되었던 colorimetric 검출에 사용 밀리리터의 부피, 어떤 수 있습니다 귀하의 쿠베트에 따라 다릅니다. 우리는 MLS 2를 사용합니다. </li><li> 티로신의 Micromoles는 &quot;단위&quot;라는 단백 분해 효소 활동의 분 수율 측정 시간으로 나눠 계산합니다. 우리는 단위 / ML의 관점에서 효소 활동의 measurment두고, 분자와 분모의 볼륨 측정 단위를 취소할 수 있습니다. 효소 희석액에 희석 솔리드 프로 테아제 샘플의 활동을 결정하기 위해, 우리는 단위 / MG의 관점에서 활동으로 우리를 떠나지에서 MG / ML. 원래이 분석에 사용되는 고체의 농도에 의해 단위 / ML 우리의 활동을 나누어 . 단위 / ML 효소 단위 / MG 고체 = _____________________ MG 솔리드 / ML 효소 </li></ol>

<ol>
	<li>Anson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li><li>Folin, O., Ciocalteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Biol. Chem. 73, 627 (1929).</li></ol>

우리는 시그마의 보편적인 프로 테아제 활동 분석을 사용하는 프로 테아제 활동을 분석하는 방법을 보여했습니다. 또한,이 분석은 실험을 위해 그들을 받게하기 전에 우리 프로 테아제는 정확하게 활동을 결정했는지 확인하는 데 유용합니다. 당신이 본 것처럼,이 절차를 수행할 때, 그것은 천천히 아니라 그들을 끓일 수있는 카제인과 티로신 솔루션을 모두 열을 기억 파라마운트 중요 하군요. 또한, 둘 다 표준과 당신이 가진 각 테스트 샘플에 대해 서로 다른 공백을 준비하는 매우 중요하다.

<table><tbody><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;amp; Ciocalteu&#039;s Phenol Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate, Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine, Free Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Protease Profiler Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Protease Fluorescent Detection Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate

프로 테아제는 펩티드 채권을 깰. 연구실에서, 그것은 종종 프로 테아제의 활동을 측정 및 / 또는 비교하는 것이 필요합니다. 시그마의 불특정 프로 테아제 활동 분석은 우리의 품질 관리 절차 동안 어떤 일을 프로 테아제의 활동을 결정하는 표준화된 절차로 사용할 수 있습니다. 이 분석에서는 카제인은 기판 역할을합니다. 우리가 테스트하는 프로 테아제가 카제인 소화되면 아미노산 티로신은 다른 아미노산과 펩타이드 조각과 함께 해방됩니다. Folin 및 Ciocalteus 페놀, 또는 Folin의 시약은 주로 같지는와 분광 광도계에 흡광도 값으로 측정하는 파란 색깔의 발색단를 생산하는 무료 티로신과 반응. 카제인에서 릴리스 더 티로신, 더 chromophores이 프로 테아제의 활동을 생성하고 강한입니다. 단백 분해 효소의 활동에 의해 생성된 흡광도 값 micromoles에서 티로신의 양을와 흡광도의 변화를 상호 연관시킬 FC 시약과 티로신 알려진 수량 반응에 의해 생성된 표준 곡선에 비교됩니다. 표준 곡선에서 프로 테아제 샘플의 활동은 분당 카제인에서 출시 티로신 등가물의 micromoles에서 금액 단위의 측면에서 결정 수 있습니다. 중국어로이 문서를 보려면 <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">여기를 클릭하십시오</a>

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Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

프로 테아제는 펩티드 채권을 깰. 연구실에서, 그것은 종종 프로 테아제의 활동을 측정 및 / 또는 비교하는 것이 필요합니다. 시그마의 불특정 프로 테아제 활동 분석은 프로 테아제의 활동을 결정하는 표준화된 절차로 사용할 수 있습니다.

시그마의 비 특정 프로 테아제의 활동 분석 - 카제인 기판으로

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

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The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

연구

생화학

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

암 연구학

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

분해 활동에 대 한 화면에 Fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과: 코로나 바이러스에 대 한 응용 프로그램 스파이크 단백질 활성화

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

단백 분해 효소의 활동을 확인하는 프로 테아제 형광 검출 키트의 사용

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

생물학

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

면역학 및 감염병학

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

글루칸 포스파타제의 기질 결합을 측정하기 위한 Concanavalin A 기반 침강 분석

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Zymography의 기능 매트릭스 Metalloproteinases의 감지

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to inflammation and various diseases including hypertension. Detection of IsoLG accumulation in tissues is crucial in shedding light on their involvement in the disease processes. However, measurement of IsoLGs in tissues is extremely difficult, and currently available tools, including mass spectrometry analysis, are laborious and extremely expensive. Here we describe a novel method for in situ detection of IsoLGs in tissues using alkaline phosphatase-conjugated D11 ScFv and a recombinant phage-display antibody produced in E. coli by immunofluorescent microscopy. Four controls were used for validating the staining: (1) staining with and without D11, (2) staining with bacterial periplasmic extract with the alkaline phosphatase linker, (3) irrelevant scFV antibody staining, and (4) competitive control with IsoLG prior to the staining. We demonstrate the effectiveness of the alkaline phosphatase-conjugated D11 in both human and mouse tissues with or without hypertension. This method will likely serve as an important tool to study the role of IsoLGs in a wide variety of disease processes.

This article provides a detailed methodology for the measurement of isolevuglandins in tissues by immunofluorescence using alkaline phosphatase-conjugated ScFv D11 antibody. Hypertension models in both mice and humans are used to explain the step-by-step procedures and fundamental principles associated with isolevuglandin measurement in tissue samples.

D11 scFv-알칼리성 포스파타제 융합 단백질 및 면역형광을 이용한 조직 내 이솔레부글란딘의 직접 검출

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

시그마의 비 특정 프로 테아제의 활동 분석 - 카제인 기판으로

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