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A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on <sup>15</sup>N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

university of kaiserslautern

&#x51E0;&#x79CD; RNA &#x6C89;&#x9ED8;&#x7B56;&#x7565;&#x91C7;&#x7528;&#x53CD;&#x4E49;&#x6216;&#x5012;&#x91CD;&#x590D;&#x6784;&#x9020;&#x5DF2;&#x5E94;&#x7528;&#x4E8E;&#x83B1;&#x8335;&#x8863;&#x85FB;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x6784;&#x9020;&#x7279;&#x5B9A;&#x4EBA;&#x5DE5; Microrna (amiRNAs) &#x7684;&#x5E38;&#x89C4;&#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#x5141;&#x8BB8;&#x4EE5;&#x524D;&#x89E3;&#x51B3;&#x95EE;&#x9898;&#x6240;&#x56FA;&#x6709;&#x7684;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6218;&#x7565;&#xFF0C;&#x50CF;&#x504F;&#x79BB;&#x76EE;&#x6807;&#x4E0D;&#x53EF;&#x9884;&#x77E5;&#x7684; siRNAs&#xFF0C;&#x4E00;&#x4EE3;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x5C1A;&#x672A;&#x5931;&#x8E2A;&#x662F;&#x4E00;&#x79CD;&#x65E5;&#x5E38;&#x5DE5;&#x5177;&#x5BF9;&#x4E8E;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x578B; amiRNA &#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#xFF0C;&#x7528;&#x4EE5;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x662F;&#x8FD9;&#x9879;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x7684;&#x76EE;&#x7684;&#x3002;&#x4E3A;&#x6B64;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x6700;&#x8FD1;&#x5F00;&#x53D1;&#x7684; amiRNA &#x8868;&#x8FBE;&#x8F7D;&#x4F53;&#x914D;&#x5907; NIT1 &#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x662F;&#x9547;&#x538B;&#x94F5;&#x548C;&#x785D;&#x9178;&#x76D0;&#x7684;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x6B64;&#x6761;&#x4EF6; amiRNA &#x5411;&#x91CF;&#x4E0E;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x56E0;&#x5B50; 1 (HSF1) &#x4F5C;&#x4E3A;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;&#x6297;&#x866B; HSF1 &#x6210;&#x7EE9;&#x5355;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x6CA6;&#x4E3A; ~ 2 h &#x540E;&#x8F6C;&#x8BA9;&#x94F5;&#x4ECE;&#x542B;&#x6709;&#x785D;&#x9178;&#x76D0;&#x7684;&#x4ECB;&#x8D28;&#x3002;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4E4B;&#x4E0B;&#xFF0C;HSF1 &#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x5E73;&#x4E0B;&#x964D;&#x53EA; ~ 8 h &#x540E;&#x8F6C;&#x53D8;&#x548C;&#x540E; 24 h&#xFF0C;&#x5EFA;&#x8BAE; 1 &#x662F;&#x4E00;&#x79CD;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x53CA;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x589E;&#x957F;&#x7A00;&#x91CA;&#x51FA;&#x5F3A;&#x70C8;&#x51CF;&#x5C11;&#x4E86;&#x3002;HSF1 &#x6C34;&#x5E73;&#x4E00;&#x5B9A;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x4E0A;&#x6062;&#x590D;&#x65F6;&#x8F6C;&#x5316;&#x5B50;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5C31;&#x8F6C;&#x79FB;&#x56DE;&#x4E3A; 72 h.&#x53D1;&#x8FBE;&#x56FD;&#x5BB6;&#x7684;&#x6297;&#x866B;&#x70ED;&#x654F;&#x94F5;&#x53EA;&#x5BF9;&#x785D;&#x9178;&#x76D0;&#x548C;&#x6E29;&#x5EA6;&#x654F;&#x611F;&#x6027;&#x4E0E; HSF1 &#x6C34;&#x5E73;&#xFF0C;&#x56E0;&#x6B64;&#x652F;&#x6301;&#x6211;&#x4EEC;&#x4EE5;&#x524D;&#x7684;&#x7ED3;&#x8BBA;&#xFF0C;HSF1 &#x662F;&#x5173;&#x952E;&#x8C03;&#x8282;&#x5668;&#x7684;&#x83B1;&#x8335;&#x8863;&#x85FB;&#x7684;&#x8010;&#x70ED;&#x6027;&#x5F3A;&#x51CF;&#x5C11;&#x76F8;&#x5173;&#x3002;

&#x83B1;&#x8335;&#x8863;&#x85FB;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x578B;&#x4EBA;&#x5DE5; microRNA &#x7CFB;&#x7EDF;&#x8BC1;&#x5B9E;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x56E0;&#x5B50; 1 &#x5728;&#x89C4;&#x7BA1;&#x8010;&#x70ED;&#x6027;&#x53D1;&#x6325;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

Several RNA silencing strategies employing antisense or inverted repeat constructs have been applied to Chlamydomonas reinhardtii. Problems inherent to these strategies, like off-target effects by unpredictable generation of siRNAs, were solved previously by constructs allowing for routine expression of specific artificial microRNAs (amiRNAs). Yet missing was a routine tool for inducible amiRNA expression, which to establish was the aim of this work. For this, we equipped a recently developed amiRNA expression vector with the NIT1 promoter, which is repressed by ammonium and activated by nitrate. We tested this conditional amiRNA vector with heat shock factor 1 (HSF1) as target. HSF1 transcripts in transformants were already reduced ~2 h after transfer from ammonium to nitrate-containing medium. In contrast, HSF1 protein levels declined only ~8 h after the shift and were strongly reduced after 24 h, suggesting that HSF1 is a stable protein and diluted out by growth. HSF1 levels recovered partly when transformant cells were shifted back to ammonium for 72 h. Transformants developed thermosensitivity only on nitrate and thermosensitivity correlated with strong reduction in HSF1 levels, hence supporting our earlier conclusion that HSF1 is a key regulator for thermotolerance in Chlamydomonas.

An inducible artificial microRNA system for Chlamydomonas reinhardtii confirms a key role for heat shock factor 1 in regulating thermotolerance.

Plusieurs strat&eacute;gies de silencieux de RNA employant antisens ou invers&eacute; r&eacute;p&eacute;ter des constructions ont &eacute;t&eacute; appliqu&eacute;es aux Chlamydomonas reinhardtii. Probl&egrave;mes inh&eacute;rents &agrave; ces strat&eacute;gies, telles que les effets hors-cible de g&eacute;n&eacute;ration impr&eacute;visible des siRNAs, ont &eacute;t&eacute; r&eacute;solus auparavant par des constructions permettant une expression courante des microARN artificielle sp&eacute;cifique (amiRNAs). Encore manquant &eacute;tait un outil syst&eacute;matique pour expression inductible amiRNA, soit d&#39;&eacute;tablir le but de ce travail. Pour ce faire, nous avons &eacute;quip&eacute; un vecteur d&#39;expression amiRNA r&eacute;cemment mis au point avec le promoteur NIT1, qui est r&eacute;prim&eacute; par l&#39;ammonium et activ&eacute; par le nitrate. Nous avons test&eacute; ce vecteur amiRNA conditionnelle avec facteur de choc thermique 1 (HSF1) comme cible. HSF1 transcrits dans les transformants ont &eacute;t&eacute; d&eacute;j&agrave; r&eacute;duits ~ 2 h apr&egrave;s le transfert de d&#39;ammonium &agrave; contenant du nitrate moyen. En revanche, le taux de prot&eacute;ines de HSF1 a diminu&eacute; de seulement environ 8 h apr&egrave;s le changement et ont &eacute;t&eacute; fortement r&eacute;duites apr&egrave;s 24h, sugg&eacute;rant que HSF1 est une prot&eacute;ine stable et dilu&eacute; sur la croissance. HSF1 niveaux r&eacute;cup&eacute;r&eacute; en partie quand transformant les cellules ont &eacute;t&eacute; d&eacute;plac&eacute;s vers d&#39;ammonium pendant 72 h. thermosensibilit&eacute; Transformants d&eacute;velopp&eacute;s uniquement sur les nitrates et thermosensibilit&eacute; corr&eacute;l&eacute; avec une forte r&eacute;duction des niveaux de HSF1, donc appuyer notre conclusion ant&eacute;rieure que HSF1 est un important r&eacute;gulateur pour la thermotol&eacute;rance chez Chlamydomonas.

Un syst&egrave;me inductible microARN artificiel pour Chlamydomonas reinhardtii confirme un r&ocirc;le cl&eacute; pour facteur de choc thermique 1 dans la r&eacute;gulation de tol&eacute;rance thermique.

Mehrere RNA silencing Strategien besch&auml;ftigen &quot;Antisense&quot; oder invertiert wiederholen Sie Konstrukte auf Chlamydomonas Reinhardtii angewendet wurden. Probleme in diesen Strategien, wie aus den Zielgruppen Effekte von unvorhersehbaren Generation von SiRNAs, wurden zuvor durch Konstrukte f&uuml;r routinem&auml;&szlig;ige Ausdruck der spezifischen k&uuml;nstlichen MicroRNAs (AmiRNAs) gel&ouml;st. Noch fehlende war eine routinem&auml;&szlig;ige Werkzeug f&uuml;r Induktion AmiRNA Ausdruck, denen hergestellt wurde das Ziel dieser Arbeit. Hierzu haben wir einen neu entwickelte AmiRNA Ausdruck Vektor mit dem NIT1-Projekttr&auml;ger, die unterdr&uuml;ckt von Ammonium und Nitrat aktiviert ausgestattet. Wir testeten diese bedingte AmiRNA-Vektor mit Hitze-Schock-Faktor 1 (HSF1) als Ziel. HSF1 Abschriften in Transformationen wurden bereits reduziert ~ 2 h nach dem Transfer von Ammonium zu Nitrat-haltigen Medium. Im Gegensatz dazu HSF1 Protein-Ebene nur ~ 8 h nach der Verschiebung gesunken und wurden nach 24 h, darauf hindeutet, dass HSF1 ein stabiles Protein ist und sich durch Wachstum verd&uuml;nnt stark reduziert. HSF1 Ebenen wiederhergestellt teilweise, wenn Transformant Zellen wieder zu Ammonium f&uuml;r 72 h. Transformationen entwickelt Thermosensitivity verschoben wurden, nur auf Nitrat- und Thermosensitivity korreliert mit starken Reduktion HSF1, daher unterst&uuml;tzt unsere fr&uuml;heren Schluss, dass HSF1 ein wichtiger Regulator f&uuml;r Trehalose in Chlamydomonas.

Ein durch Induktion erh&auml;ltlichen k&uuml;nstlichen MicroRNA-System f&uuml;r Chlamydomonas Reinhardtii best&auml;tigt eine Schl&uuml;sselrolle f&uuml;r Hitze-Schock-Faktor 1 bei der Regulierung von Trehalose.

Diverse strategie silenziamento RNA che impiegano antisenso o invertito ripetere i costrutti sono stati applicati a Chlamydomonas reinhardtii. Problemi inerenti a queste strategie, come effetti fuori bersaglio da imprevedibile generazione di siRNA, sono stati risolti in precedenza da costrutti consentendo ordinaria espressione di microRNA artificiali specifici (amiRNAs). Ancora mancante &egrave; stato uno strumento di routine per l&#39;espressione inducibile amiRNA, che stabilire era lo scopo di questo lavoro. Per questo, abbiamo attrezzato un vettore di espressione amiRNA sviluppata di recente con il promotore NIT1, che &egrave; represso da ammonio e attivato da nitrato. Abbiamo testato questo vettore amiRNA condizionale con fattore di scossa di calore 1 (HSF1) come destinazione. HSF1 trascrizioni in transformants erano gi&agrave; ridotto ~ 2 h dopo il trasferimento da ammonio contenente nitrato medio. In contrasto, livelli di proteina HSF1 declin&ograve; solo ~ 8 h dopo il passaggio e sono state fortemente ridotte dopo 24 h, suggerendo che HSF1 &egrave; una proteina stabile e diluito fuori dalla crescita. HSF1 livelli parzialmente recupero quando transformant cellule sono state spostate indietro di ammonio per 72 h. termosensibilit&agrave; Transformants sviluppato solo sui nitrati e termosensibilit&agrave; correlato con forte riduzione dei livelli di HSF1, quindi sostenere la nostra conclusione precedente che HSF1 &egrave; un regolatore chiave per thermotolerance in Chlamydomonas.

Un sistema viscoelastico microRNA artificiali per Chlamydomonas reinhardtii conferma un ruolo chiave per il fattore di scossa di calore 1 nella regolazione thermotolerance.

&#x30A2;&#x30F3;&#x30C1;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B9;&#x3092;&#x63A1;&#x7528;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x53CD;&#x8EE2;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B; RNA &#x30B5;&#x30A4;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x6226;&#x7565;&#x30B3;&#x30F3;&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30AF;&#x30C8; &#x30AF;&#x30E9;&#x30DF;&#x30C9;&#x30E2;&#x30CA;&#x30B9;&#x306B;&#x9069;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3092;&#x7E70;&#x308A;&#x8FD4;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;Sirnas&#x3001;&#x4E88;&#x6E2C;&#x4E0D;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x4E16;&#x4EE3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8; &#x30AA;&#x30D5;&#x52B9;&#x679C;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x6226;&#x7565;&#x306B;&#x5185;&#x5728;&#x3059;&#x308B;&#x554F;&#x984C;&#x306F;&#x3001;&#x4EE5;&#x524D;&#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED; Rna (amiRNAs) &#x306E;&#x30EB;&#x30FC;&#x30C1;&#x30F3;&#x306E;&#x5F0F;&#x3092;&#x8A31;&#x53EF;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x89E3;&#x6C7A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x3060;&#x884C;&#x65B9;&#x4E0D;&#x660E;&#x306E;&#x30EB;&#x30FC;&#x30C1;&#x30F3;&#x306E;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x8A98;&#x5C0E; amiRNA &#x5F0F;&#x3092;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x306E;&#x4F5C;&#x696D;&#x306E;&#x76EE;&#x7684;&#x306F;&#x3001;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x6700;&#x8FD1;&#x958B;&#x767A;&#x3055;&#x308C;&#x305F; amiRNA &#x5F0F;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB; &#x30A2;&#x30F3;&#x30E2;&#x30CB;&#x30A6;&#x30E0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6291;&#x5727;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x785D;&#x9178;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316; NIT1 &#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x88C5;&#x5099;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3053;&#x306E;&#x6761;&#x4EF6;&#x4ED8;&#x304D; amiRNA &#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x71B1;&#x30B7;&#x30E7;&#x30C3;&#x30AF;&#x8981;&#x56E0; 1 (HSF1) &#x3092;&#x5BFE;&#x8C61;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3002;HSF1 &#x6210;&#x7E3E; transformants &#x306E;&#x65E2;&#x306B;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x305F; ~ 2 h &#x8EE2;&#x9001;&#x5F8C;&#x304B;&#x3089;&#x30A2;&#x30F3;&#x30E2;&#x30CB;&#x30A6;&#x30E0;&#x785D;&#x9178;&#x614B;&#x7A92;&#x7D20;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x306B;&#x5A92;&#x4F53;&#x3002;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;HSF1 &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306E;&#x307F; ~ 8 h &#x30B7;&#x30D5;&#x30C8;&#x306E;&#x5F8C;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x305F;&#x3057;&#x3001;&#x5F37;&#x304F; HSF1 &#x304C;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3057;&#x3001;&#x3046;&#x3061;&#x6210;&#x9577;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5E0C;&#x91C8;&#x3092;&#x793A;&#x5506; 24 h &#x306E;&#x5F8C;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;HSF1 &#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x3068;&#x304D;&#x5F62;&#x8CEA;&#x8EE2;&#x63DB;&#x690D;&#x7269;&#x7D30;&#x80DE;&#x30A2;&#x30F3;&#x30E2;&#x30CB;&#x30A6;&#x30E0;&#x306F; 72 h &#x958B;&#x767A; Transformants &#x611F;&#x5FDC;&#x306B;&#x623B;&#x308B;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x785D;&#x9178;&#x3068;&#x305D;&#x308C;&#x3086;&#x3048; HSF1 &#x76EE;&#x6307;&#x3057;&#x305F;&#x30AF;&#x30E9;&#x30DF;&#x30C9;&#x30E2;&#x30CA;&#x30B9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x4EE5;&#x524D;&#x306E;&#x7D50;&#x8AD6;&#x3092;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3059;&#x308B;&#x5F37;&#x3044;&#x6E1B;&#x5C11; HSF1 &#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3067;&#x76F8;&#x95A2;&#x611F;&#x5FDC;&#x79FB;&#x3063;&#x305F;&#x56DE;&#x5FA9;&#x3002;

&#x30AF;&#x30E9;&#x30DF;&#x30C9;&#x30E2;&#x30CA;&#x30B9;&#x306E;&#x8A98;&#x5C0E;&#x578B;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED; Rna &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3067;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x76EE;&#x6307;&#x3057;&#x305F;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x71B1;&#x30B7;&#x30E7;&#x30C3;&#x30AF;&#x8981;&#x56E0; 1 &#x3092;&#x78BA;&#x8A8D;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC1C;&#xC758; RNA silencing &#xC804;&#xB7B5; antisense &#xCC44;&#xC6A9; &#xB610;&#xB294; &#xAC70;&#xAFB8;&#xB85C; &#xBC18;&#xBCF5; &#xAD6C;&#xBB38; Chlamydomonas reinhardtii&#xC5D0; &#xC801;&#xC6A9; &#xB41C;. SiRNAs, &#xC608;&#xCE21;&#xD560; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xC138;&#xB300;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xB300;&#xC0C1; &#xC624;&#xD504; &#xD6A8;&#xACFC; &#xCC98;&#xB7FC; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC804;&#xB7B5;&#xC5D0; &#xB0B4;&#xC7AC; &#xB41C; &#xBB38;&#xC81C;&#xB294; &#xD2B9;&#xC815; &#xC778;&#xACF5; microRNAs (amiRNAs)&#xC758; &#xC77C;&#xC0C1;&#xC801;&#xC778; &#xD45C;&#xD604;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xD574;&#xACB0; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC544;&#xC9C1; &#xC2E4;&#xC885; &#xC77C;&#xC0C1;&#xC801;&#xC778; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB294; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; amiRNA &#xC2DD;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC124;&#xC815; &#xD558;&#xB294;&#xC774; &#xC791;&#xD488;&#xC758; &#xBAA9;&#xD45C;&#xB294;. &#xC774; &#xC704;&#xD574;, &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC7A5;&#xCC29; &#xD558;&#xB294; NIT1 &#xBAA8;&#xD130;&#xB294; &#xC554;&#xBAA8;&#xB284;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC5B5;&#xC555; &#xD558; &#xACE0; &#xC9C8; &#xC0B0;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB41C; &#xCD5C;&#xADFC;&#xC5D0; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xB41C; amiRNA &#xC2DD; &#xBCA1;&#xD130;. &#xC774; &#xC870;&#xAC74;&#xBD80; amiRNA &#xBCA1;&#xD130; &#xC5F4; &#xC1FC;&#xD06C; &#xC694;&#xC18C; 1 (HSF1)&#xC744; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;. Transformants&#xC5D0;&#xC11C; HSF1 &#xC131;&#xC801;&#xD45C; &#xC774;&#xBBF8; &#xAC10;&#xC18C; &#xD588;&#xB2E4; ~ 2 h &#xC804;&#xC1A1; &#xD6C4; &#xC554;&#xBAA8;&#xB284;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C8;&#xC0B0;&#xC5FC;&#xC774; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xB9E4;&#xCCB4;. &#xBC18;&#xBA74;, HSF1 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC218;&#xC900; &#xBCC0;&#xD654; &#xD6C4;&#xB9CC; ~ 8 h&#xB97C; &#xAC70;&#xC808; &#xD558; &#xACE0; 24 h, HSF1 &#xC548;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC774;&#xBA70;, &#xC131;&#xC7A5;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD76C;&#xC11D; &#xC81C;&#xC548; &#xD6C4; &#xAC15;&#xB825; &#xD558; &#xAC8C; &#xAC10;&#xC18C; &#xD588;&#xB2E4;. HSF1 &#xC218;&#xC900; &#xBCF5;&#xAD6C; &#xC77C;&#xBD80; &#xB54C; transformant &#xC140; &#xC9C8;&#xC0B0;&#xC5FC;&#xACFC; HSF1 &#xB808;&#xBCA8;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; HSF1 Chlamydomonas&#xC5D0; thermotolerance&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD0A4; &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774; &#xD130;&#xB294; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC774;&#xC804; &#xACB0;&#xB860;&#xC744; &#xC9C0; &#xC6D0;&#xD558;&#xB294; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xAC10;&#xC18C;&#xC640; &#xC0C1;&#xAD00; thermosensitivity&#xC5D0;&#xB9CC; 72 h. Transformants &#xAC1C;&#xBC1C; thermosensitivity&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC554;&#xBAA8;&#xB284;&#xC744; &#xB2E4;&#xC2DC; &#xC774;&#xB3D9; &#xD588;&#xB2E4;.

Chlamydomonas reinhardtii&#xB294; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC778;&#xACF5; microRNA &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xC5F4; &#xC1FC;&#xD06C; &#xC694;&#xC18C; 1 thermotolerance &#xC870;&#xC808;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xD655;&#xC778; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Varias estrategias silenciamiento de RNA antisentido de emplear o invertido repetici&oacute;n construcciones se han aplicado a Chlamydomonas reinhardtii. Problemas inherentes a estas estrategias, como objetivo efectos impredecibles generaci&oacute;n de siRNAs, fueron resueltos anteriormente por construcciones permitiendo la expresi&oacute;n rutinaria de microRNAs artificiales espec&iacute;ficos (amiRNAs). Todav&iacute;a falta era una herramienta de rutina para la expresi&oacute;n inducible amiRNA que establecer era el objetivo de este trabajo. Para ello, equipamos un vector de expresi&oacute;n amiRNA recientemente desarrollados con el promotor NIT1, que es reprimido por amonio y activado por el nitrato. Probamos este vector amiRNA condicional con factor de choque de calor 1 (HSF1) como destino. HSF1 transcripciones en transformantes ya redujeron ~ 2 h despu&eacute;s de la transferencia de amonio a que contienen nitrato medio. En cambio, niveles de prote&iacute;na HSF1 disminuyeron solamente 8 h tras el desplazamiento y redujeron fuertemente despu&eacute;s de 24 h, sugiriendo que HSF1 es una prote&iacute;na estable y diluido hacia fuera por el crecimiento. HSF1 niveles recuperaron en parte cuando las c&eacute;lulas de la planta fueron cambiados de puesto a amonio para 72 h. thermosensitivity transformantes desarrollado solamente en nitrato y thermosensitivity con fuerte reducci&oacute;n en los niveles de HSF1, ah&iacute; apoyando nuestra conclusi&oacute;n anterior que HSF1 es un regulador clave para thermotolerance en Chlamydomonas.

Un sistema inducible microRNA artificial para Chlamydomonas reinhardtii confirma un rol clave en factor de choque de calor 1 en la regulaci&oacute;n thermotolerance.

&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50;&#x5982;&#x4F55;&#x5F71;&#x54CD;&#x67D3;&#x8272;&#x8D28;&#x7ED3;&#x6784;&#xFF0C;&#x5BF9;&#x73AF;&#x5883;&#x6761;&#x4EF6;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x53CD;&#x5E94;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x8C03;&#x8282;&#x4E0D;&#x5F53;&#x7684;&#x7406;&#x89E3;&#x7EFF;&#x8272;&#x7684;&#x6CBF;&#x88AD;&#x3002;&#x8981;&#x9610;&#x660E;&#x8FD9;&#x4E00;&#x95EE;&#x9898;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x4E8E;&#x67D3;&#x8272;&#x8D28;&#x6C89;&#x6DC0;&#x548C;&#x7532;&#x919B;&#x534F;&#x52A9;&#x5206;&#x79BB;&#x7684;&#x8C03;&#x63A7;&#x5143;&#x4EF6;&#x8C03;&#x67E5; 1 CRR1&#xFF0C;&#x5173;&#x952E;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8C03;&#x8282;&#x7684;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x548C;&#x94DC;&#x9965;&#x997F;&#x7684;&#x53CD;&#x5E94;&#x53CA;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x9776;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x67D3;&#x8272;&#x8D28;&#x7ED3;&#x6784;&#x5206;&#x522B;&#x5728;&#x5355;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7EFF;&#x85FB;&#x83B1;&#x8335;&#x8863;&#x85FB;&#x3002;&#x4E00;&#x822C;&#x6765;&#x8BF4;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5230;&#x5165;&#x4F4F;&#x6838;&#x5C0F;&#x4F53;&#x66F4;&#x4F4E;&#x3001; &#x66F4;&#x9AD8;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x4E59;&#x9170;&#x5316; H3/4 &#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x548C;&#x8F83;&#x4F4E;&#x7EA7;&#x522B;&#x7684;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D; H3 Lys 4 (H3K4) monomethylation &#x76F8;&#x6BD4;&#x5904;&#x4E8E;&#x975E;&#x6D3B;&#x52A8;&#x72B6;&#x6001;&#x7684;&#x5BA3;&#x4F20;&#x5458;&#x548C;&#x8F6C;&#x5F55;&#x6D3B;&#x8DC3;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x533A;&#x57DF;&#x548C;&#x57FA;&#x56E0;&#x533A;&#x57DF;&#x3002;&#x5177;&#x4F53;&#x800C;&#x8A00;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x627E;&#x5230;&#x6FC0;&#x6D3B; 1 CRR1 &#x53CA;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50;&#x8FDB;&#x884C;&#x8C03;&#x89E3;&#x7684; H3/4&#xFF0C;&#x9A71;&#x9010;&#x6838;&#x5C0F;&#x4F53;&#xFF0C;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x4E59;&#x9170;&#x5316;&#x91CD;&#x6784;&#x7684; H3K4 &#x5355;&#x548C; dimethylation &#x6807;&#x8BB0;&#x548C;&#x8F6C;&#x5F55;&#x542F;&#x52A8;/&#x65AD;&#x88C2;&#x4F38;&#x957F;&#x7387;&#x3002;&#x7531;&#x6B64;&#xFF0C;1 CRR1 &#x53CA;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x5F88;&#x4E2A;&#x522B;&#x6539;&#x578B;&#x548C;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x53EF;&#x80FD;&#x5904;&#x4E8E;&#x975E;&#x6D3B;&#x52A8;&#x72B6;&#x6001;&#x548C;&#x5D4C;&#x5165;&#x5230;&#x5C01;&#x95ED;&#x67D3;&#x8272;&#x8D28; &#xFF08;HSP22F/CYC6) &#x6216;&#x5F31;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x53D1;&#x8D77;&#x4EBA;&#x79EF;&#x6781;&#x548C;&#x5D4C;&#x5165;&#x5230;&#x90E8;&#x5206;&#x5F00;&#x653E; (CPX1) &#x6216;&#x5B8C;&#x5168;&#x6253;&#x5F00;&#x67D3;&#x8272;&#x8D28; &#xFF08;HSP70A/CRD1&#xFF09;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x6CE8;&#x610F;&#x5230;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x540E;&#x7684;&#x5728; RBCS2 &#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x533A; HSF1 &#x72EC;&#x7ACB;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D; H3/4 &#x8131;&#x4E59;&#x9170;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x5177;&#x4F53;&#x548C;&#x5927;&#x6982;&#x66F4;&#x4E00;&#x822C;&#x4EE3;&#x7406;&#x7684;&#x56E0;&#x7D20;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x9002;&#x5E94;&#x4E0D;&#x65AD;&#x53D8;&#x5316;&#x7684;&#x73AF;&#x5883;&#x7684;&#x65B0;&#x8981;&#x6C42;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50;&#x4F9D;&#x8D56;&#x7684;&#x67D3;&#x8272;&#x8D28;&#x91CD;&#x5851;&#x5728;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x548C;&#x83B1;&#x8335;&#x8863;&#x85FB;&#x7684;&#x94DC;&#x53CD;&#x5E94;&#x5BA3;&#x4F20;&#x5458;&#x3002;

How transcription factors affect chromatin structure to regulate gene expression in response to changes in environmental conditions is poorly understood in the green lineage. To shed light on this issue, we used chromatin immunoprecipitation and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements to investigate the chromatin structure at target genes of HSF1 and CRR1, key transcriptional regulators of the heat shock and copper starvation responses, respectively, in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. Generally, we detected lower nucleosome occupancy, higher levels of histone H3/4 acetylation, and lower levels of histone H3 Lys 4 (H3K4) monomethylation at promoter regions of active genes compared with inactive promoters and transcribed and intergenic regions. Specifically, we find that activated HSF1 and CRR1 transcription factors mediate the acetylation of histones H3/4, nucleosome eviction, remodeling of the H3K4 mono- and dimethylation marks, and transcription initiation/elongation. By this, HSF1 and CRR1 quite individually remodel and activate target promoters that may be inactive and embedded into closed chromatin (HSP22F/CYC6) or weakly active and embedded into partially opened (CPX1) or completely opened chromatin (HSP70A/CRD1). We also observed HSF1-independent histone H3/4 deacetylation at the RBCS2 promoter after heat shock, suggesting interplay of specific and presumably more generally acting factors to adapt gene expression to the new requirements of a changing environment.

Transcription factor-dependent chromatin remodeling at heat shock and copper-responsive promoters in Chlamydomonas reinhardtii.

L&#39;incidence des facteurs de transcription sur la structure de la chromatine pour r&eacute;guler l&#39;expression des g&egrave;nes en r&eacute;ponse aux changements de conditions environnementales est mal comprise dans la lign&eacute;e verte. Pour faire la lumi&egrave;re sur cette question, nous avons utilis&eacute; l&#39;immunopr&eacute;cipitation de la chromatine et formald&eacute;hyde assist&eacute;e par isolement des &eacute;l&eacute;ments r&eacute;gulateurs pour &eacute;tudier la structure de la chromatine dans les g&egrave;nes cibles de HSF1 et CRR1, des r&eacute;gulateurs transcriptionnels cl&eacute;s du choc thermique et r&eacute;ponses de la famine en cuivre, respectivement, dans l&#39;algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii. En r&egrave;gle g&eacute;n&eacute;rale, nous avons d&eacute;tect&eacute; plus faible occupation du nucl&eacute;osome, des niveaux plus &eacute;lev&eacute;s de l&#39;ac&eacute;tylation des histones H3/4 et des niveaux inf&eacute;rieurs de l&#39;histone H3 Lys 4 (H3K4) monom&eacute;thylation dans les r&eacute;gions promotrices des g&egrave;nes actifs par rapport aux promoteurs inactifs et transcrit et r&eacute;gions interg&eacute;niques. Plus pr&eacute;cis&eacute;ment, nous trouvons que les facteurs de transcription activ&eacute;s HSF1 et CRR1 m&eacute;dient l&#39;ac&eacute;tylation des histones H3/4, expulsion de nucl&eacute;osome, remodelage de la H3K4 mono - marques de MBD et transcription initiation/allongement. Par la pr&eacute;sente, HSF1 et CRR1 tout &agrave; fait individuellement remodeler et activer les promoteurs cible qui peuvent &ecirc;tre inactif et incorpor&eacute; dans la chromatine ferm&eacute;e (HSP22F/CYC6) ou faiblement actif et incorpor&eacute; dans partiellement ouvert (CPX1) ou compl&egrave;tement ouverte la chromatine (HSP70A/CRD1). Nous avons &eacute;galement observ&eacute; HSF1 ind&eacute;pendants de l&#39;histone H3/4 d&eacute;sac&eacute;tylation au promoteur RBCS2 apr&egrave;s un choc thermique, sugg&eacute;rant l&#39;interaction de facteurs sp&eacute;cifiques et sans doute plus g&eacute;n&eacute;ralement par int&eacute;rim pour s&#39;adapter aux nouvelles exigences d&#39;un environnement changeant l&#39;expression des g&egrave;nes.

Transcription remodelage de la chromatine facteur d&eacute;pendant &agrave; un choc thermique et promoteurs cuivre-r&eacute;active chez Chlamydomonas reinhardtii.

Wie Transkriptionsfaktoren Chromatin-Struktur zur Regulierung der Genexpression in Reaktion auf &Auml;nderungen der Umweltbedingungen auswirken werden in der gr&uuml;nen Linie schlecht verstanden. Um Aufschluss &uuml;ber diese Frage haben wir Chromatin Immunopr&auml;zipitation und Formaldehyd-assistierte Isolation von regulatorischen Elementen um die Chromatin-Struktur beim Zielgene HSF1 und CRR1, wichtige transkriptionelle Regulatoren der Hitzeschock und Kupfer Hunger Antworten, bzw. in die einzellige gr&uuml;ne Alge Chlamydomonas Reinhardtii zu untersuchen. Im Allgemeinen erkannt wir niedrigere Nukleosom-Belegung, h&ouml;here Histon H3/4 Acetylierung und unteren Ebenen des Histon H3 Lys 4 (H3K4) Monomethylation Projekttr&auml;ger Regionen der aktiven Gene verglichen mit inaktiven Promotoren und transkribiert und intergenetischer Regionen. Insbesondere finden wir, dass aktivierte HSF1 und CRR1 Transkriptionsfaktoren die Acetylierung der Histone H3/4, Nukleosom R&auml;umung vermitteln, Umbau der H3K4 Mono- und Dimethylation Marken und Transkription Einleitung/Dehnung. Dadurch HSF1 und CRR1 ganz individuell umgestalten und aktivieren deiner Promotoren, die inaktiv und embedded in geschlossenen Chromatin (HSP22F/CYC6) oder schwach aktive und embedded in teilweise ge&ouml;ffneten (CPX1) oder vollst&auml;ndig ge&ouml;ffneten Chromatin (HSP70A/CRD1). Wir beobachteten auch HSF1-unabh&auml;ngige Histon H3/4 Deacetylierung an der RBCS2-Projekttr&auml;ger nach Hitzeschock, schl&auml;gt Zusammenspiel von spezifischen und vermutlich im allgemeinen handeln Faktoren Genexpression an die neuen Anforderungen des sich ver&auml;ndernden Umfelds anzupassen.

Transkription Faktor-abh&auml;ngige Chromatin Umbau am Hitzeschock und Kupfer-responsive Projekttr&auml;gern in Chlamydomonas Reinhardtii.

Come fattori di trascrizione possono influenzare la struttura della cromatina per regolare l&#39;espressione genica in risposta ai cambiamenti nelle condizioni ambientali &egrave; scarsamente compreso nel lignaggio verde. Per fare luce su questo problema, abbiamo usato immunoprecipitazione della cromatina e formaldeide-assistita isolamento degli elementi normativi per indagare la struttura della cromatina in geni bersaglio di HSF1 e CRR1, chiavi regolatori trascrizionali della scossa di calore e rame fame risposte, rispettivamente, nell&#39;alga verde unicellulare Chlamydomonas reinhardtii. In genere, abbiamo rilevato bassa occupazione nucleosoma, livelli pi&ugrave; elevati di acetilazione di istone H3/4 e pi&ugrave; bassi livelli di istone H3 Lys 4 (H3K4) monomethylation a regioni del promotore di geni attivi rispetto ai promotori inattivi e trascritto e intergenic. In particolare, troviamo che i fattori di trascrizione attivati HSF1 e CRR1 mediano l&#39;acetilazione di istoni H3/4, sfratto nucleosoma, rimodellamento del H3K4 mono - e dimethylation marchi e trascrizione iniziazione/allungamento. Da questo, HSF1 e CRR1 abbastanza individualmente rimodellare e attivare promotori di destinazione che possono essere inattivo e incorporato nel chiusa della cromatina (HSP22F/CYC6) o debolmente attivo e incorporato in parzialmente aperto (CPX1) o completamente aperta della cromatina (HSP70A/CRD1). Abbiamo anche osservato HSF1 indipendente dell&#39;istone H3/4 deacetilazione presso il promotore di RBCS2 dopo la scossa di calore, suggerendo l&#39;interazione di fattori specifici e presumibilmente pi&ugrave; in generale ad interim di adattare l&#39;espressione genica alle nuove esigenze di un ambiente in continua evoluzione.

Trascrizione dipendente dal fattore di cromatina rimodellamento di scossa di calore ed i promotori del rame-reattive in Chlamydomonas reinhardtii.

&#x74B0;&#x5883;&#x6761;&#x4EF6;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x306B;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C1;&#x30F3;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x8EE2;&#x5199;&#x56E0;&#x5B50;&#x306F;&#x3001;&#x7DD1;&#x306E;&#x8840;&#x7D71;&#x3067;&#x3088;&#x304F;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x554F;&#x984C;&#x306B;&#x5149;&#x3092;&#x5F53;&#x3066;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C1;&#x30F3;&#x514D;&#x75AB;&#x6C88;&#x964D;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30DB;&#x30EB;&#x30E0;&#x30A2;&#x30EB;&#x30C7;&#x30D2;&#x30C9; &#x30A2;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C8;&#x5206;&#x96E2;&#x898F;&#x5236;&#x8981;&#x7D20;&#x306E;&#x5358;&#x7D30;&#x80DE;&#x7DD1;&#x85FB;&#x30AF;&#x30E9;&#x30DF;&#x30C9;&#x30E2;&#x30CA;&#x30B9;&#x306E;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x3001;HSF1 &#x3068;&#x30AD;&#x30FC;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x71B1;&#x885D;&#x6483;&#x30FB;&#x9285;&#x98E2;&#x9913;&#x5FDC;&#x7B54;&#x8EE2;&#x5199;&#x56E0;&#x5B50; CRR1 &#x306E;&#x6A19;&#x7684;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C1;&#x30F3;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3002;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x4F4E;&#x3044;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x5360;&#x6709;&#x3001;&#x30D2;&#x30B9;&#x30C8;&#x30F3; H3/4 &#x306E;&#x30A2;&#x30BB;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3068;&#x4E0B;&#x4F4D;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306E;&#x30D2;&#x30B9;&#x30C8;&#x30F3; H3 &#x306E; Lys 4 (h3k4 &#x30C8;&#x30EA;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;) &#x691C;&#x51FA;&#x3068;&#x975E;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306A;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3001;&#x8EE2;&#x5199;&#x6D3B;&#x6027;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x9818;&#x57DF;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x9593;&#x9818;&#x57DF;&#x3067;&#x306E; monomethylation&#x3002;&#x5177;&#x4F53;&#x7684;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x6D3B;&#x6027; HSF1 &#x3068; CRR1 &#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x56E0;&#x5B50;&#x30A2;&#x30BB;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x30D2;&#x30B9;&#x30C8;&#x30F3; H3/4&#x3001;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x7ACB;&#x3061;&#x9000;&#x304D;&#x306E;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x898B;&#x3064;&#x3051;&#x308B;&#x3001;h3k4 &#x30C8;&#x30EA;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x30E2;&#x30CE;&#x30E9;&#x30EB; - &#x3068; dimethylation &#x30DE;&#x30FC;&#x30AF;&#x3068;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x3001;&#x4F38;&#x9577;&#x306E;&#x6539;&#x9020;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306B;&#x3088;&#x308A;, HSF1 &#x3068; CRR1 &#x304B;&#x306A;&#x308A;&#x500B;&#x5225;&#x306B;&#x6539;&#x9020;&#x3057;&#x3001;&#x9589;&#x3058;&#x3089;&#x308C;&#x305F; chromatin (HSP22F/CYC6) &#x306B;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5F31;&#x306F;&#x975E;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x3068;&#x57CB;&#x3081;&#x8FBC;&#x307E;&#x308C;&#x305F;&#x304B;&#x3082;&#x3057;&#x308C;&#x306A;&#x3044;&#x6A19;&#x7684;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x3092;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306B;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x3068;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x306B;&#x958B;&#x3044;&#x305F; (CPX1) &#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5B8C;&#x5168;&#x306B;&#x958B;&#x304B;&#x308C;&#x305F;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C1;&#x30F3; &#xFF08;HSP70A/CRD1) &#x306B;&#x57CB;&#x3081;&#x8FBC;&#x307E;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x5909;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x74B0;&#x5883;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x8981;&#x4EF6;&#x306B;&#x9069;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x8981;&#x56E0;&#x3092;&#x7279;&#x5B9A;&#x3057;&#x3001;&#x304A;&#x305D;&#x3089;&#x304F;&#x3088;&#x308A;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306B;&#x6F14;&#x6280;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x8131;&#x30A2;&#x30BB;&#x30C1;&#x30EB; HSF1 &#x72EC;&#x7ACB;&#x30D2;&#x30B9;&#x30C8;&#x30F3; H3/4 &#x5316; RBCS2 &#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3067;&#x71B1;&#x30B7;&#x30E7;&#x30C3;&#x30AF;&#x5F8C;&#x3082;&#x89B3;&#x6E2C;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x8EE2;&#x5199;&#x56E0;&#x5B50;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C1;&#x30F3; &#x30D2;&#x30FC;&#x30C8; &#x30B7;&#x30E7;&#x30C3;&#x30AF;&#x3068;&#x9285;&#x5FDC;&#x7B54;&#x6027;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC; &#x30AF;&#x30E9;&#x30DF;&#x30C9;&#x30E2;&#x30CA;&#x30B9;&#x306E;&#x6539;&#x9020;&#x3002;

&#xB179;&#xC74C; &#xBC29;&#xC1A1; &#xC694;&#xC778; &#xBCC0;&#xD654; &#xD658;&#xACBD; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC751;&#xB2F5;&#xC73C;&#xB85C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC744; &#xC870;&#xC808; &#xD558;&#xB294; chromatin &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0; &#xBBF8;&#xCE58;&#xB294; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC81C;&#xB300;&#xB85C; &#xB179;&#xC0C9; &#xD608;&#xD1B5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC774;&#xD574; &#xB41C;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBB38;&#xC81C;&#xC5D0; &#xBE5B;&#xC744; &#xBC1C;&#xC0B0; &#xD558; &#xAC8C; &#xC6B0;&#xB9AC; chromatin immunoprecipitation &#xBC0F; &#xADDC;&#xC81C; &#xC694;&#xC18C; &#xD3EC; &#xB984; &#xC54C; &#xB370;&#xD788;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC774;&#xC6A9;&#xD55C; &#xC808;&#xC5F0; &#xB2E8; &#xC138;&#xD3EC; &#xB179;&#xC0C9; &#xC870;&#xB958; Chlamydomonas reinhardtii&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC01;&#xAC01; HSF1 &#xBC0F; CRR1, &#xC5F4; &#xCDA9;&#xACA9; &#xBC0F; &#xAD6C;&#xB9AC; &#xAE30;&#xC544; &#xC751;&#xB2F5; &#xD0A4; transcriptional &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774; &#xD130;&#xC758; &#xB300;&#xC0C1; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0;&#xC11C; chromatin &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xC870;&#xC0AC; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9;. &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB0AE;&#xC740; nucleosome &#xC778;, &#xD788;&#xC2A4;&#xD1A4; H3/4 acetylation&#xC758; &#xC0C1;&#xBD80;&#xC640; &#xD788;&#xC2A4;&#xD1A4; H3 &#xB9AC;&#xC2A4; 4&#xC758; &#xB0AE;&#xC740; &#xC218;&#xC900; (H3K4) &#xAC10;&#xC9C0; &#xBE44;&#xD65C;&#xC131; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xACE0; &#xBCC0;&#xD558;&#xAC8C; &#xD65C;&#xC131; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xC9C0;&#xAD6C; &#xBC0F; intergenic &#xC601;&#xC5ED;&#xC5D0;&#xC11C; monomethylation. &#xD2B9;&#xD788;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xCC3E;&#xC744; &#xC218; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; hsf1&#xC640; CRR1 &#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790; &#xD788;&#xC2A4;&#xD1A4; H3/4, nucleosome &#xD1F4;&#xAC70;&#xC758; acetylation &#xC911;&#xC7AC; H3K4 &#xBAA8;&#xB178;-&#xBC0F; dimethylation &#xAE30;&#xD638; &#xBC0F; &#xC804;&#xC0AC; &#xAC1C;&#xC2DC;/&#xC2E0;&#xC7A5; &#xAC1C;&#xC7A5;. &#xC774;&#xAC83;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574;, HSF1 &#xBC0F; CRR1 &#xAF64; &#xAC1C;&#xBCC4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC1C;&#xC7A5; &#xBC0F; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB300;&#xC0C1; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; closed chromatin (HSP22F/CYC6) &#xB610;&#xB294; &#xC57D;&#xD558;&#xAC8C; &#xBE44;&#xD65C;&#xC131; &#xBC0F; &#xC784;&#xBCA0;&#xB514;&#xB4DC; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC801;&#xADF9;&#xC801;&#xC774; &#xACE0; &#xBD80;&#xBD84;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC5F4;&#xB9B0;&#xB41C; (CPX1) &#xB610;&#xB294; &#xC644;&#xC804;&#xD788; &#xC5F4;&#xB9B0;&#xB41C; chromatin (HSP70A/CRD1)&#xC5D0; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604; &#xBCC0;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xD658;&#xACBD;&#xC758; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC694;&#xAD6C; &#xC0AC;&#xD56D;&#xC5D0; &#xB9DE;&#xAC8C; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xC801;&#xC774; &#xACE0; &#xC544;&#xB9C8;&#xB3C4; &#xB354; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD589;&#xB3D9; &#xC694;&#xC778;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; HSF1 &#xB3C5;&#xB9BD;&#xC801;&#xC778; &#xD788;&#xC2A4;&#xD1A4; H3/4 deacetylation &#xC5F4; &#xCDA9;&#xACA9; &#xD6C4; RBCS2 &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778;&#xC5D0; &#xAD00;&#xCC30;.

&#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790; &#xC885;&#xC18D; chromatin &#xC5F4; &#xCDA9;&#xACA9; &#xBC0F; Chlamydomonas reinhardtii &#xAD6C;&#xB9AC; &#xC751;&#xB2F5; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778;&#xC5D0; &#xAC1C;&#xC7A5;.

Como factores de transcripci&oacute;n afectan la estructura de la cromatina para regular la expresi&oacute;n g&eacute;nica en respuesta a cambios en las condiciones ambientales es mal entendida en el linaje verde. Para arrojar luz sobre esta cuesti&oacute;n, utilizamos inmunoprecipitaci&oacute;n de cromatina y aislamiento de formaldeh&iacute;do-asistida de elementos reguladores para investigar la estructura de la cromatina en genes diana de HSF1 y CRR1, reguladores transcripcionales claves del choque del calor y hambre cobre respuestas, respectivamente, en el alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii. En general, detectamos menor ocupaci&oacute;n de nucleosoma, niveles m&aacute;s altos de acetilaci&oacute;n de histona H3/4 y niveles m&aacute;s bajos de la histona H3 Lys 4 (H3K4) monomethylation en regiones promotoras de los genes activos en comparaci&oacute;n con promotores inactivos y transcrito y regiones interg&eacute;nicas. Espec&iacute;ficamente, encontramos que los factores de transcripci&oacute;n HSF1 y CRR1 activados median la acetilaci&oacute;n de histonas H3/4, desalojo del nucleosoma, remodelaci&oacute;n de la H3K4 mono - dimetilaci&oacute;n marcas e iniciaci&oacute;n/elongaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n. Por esto, HSF1 y CRR1 bastante individualmente remodelar y activar los promotores blanco que pueden ser inactivo o incrustados en cromatina cerrada (HSP22F/CYC6) o d&eacute;bil activo o incrustados en parcialmente abierta (CPX1) o cromatina completamente abierta (HSP70A/CRD1). Tambi&eacute;n observamos HSF1 independiente histona H3/4 desacetilaci&oacute;n en el promotor de RBCS2 despu&eacute;s de choque t&eacute;rmico, lo que sugiere la interacci&oacute;n de factores espec&iacute;ficos y presumiblemente m&aacute;s generalmente actuando para adaptar la expresi&oacute;n g&eacute;nica a las nuevas exigencias de un entorno cambiante.

Transcripci&oacute;n factor dependiente cromatina remodelaci&oacute;n en choque t&eacute;rmico y promotores sensibles al cobre en Chlamydomonas reinhardtii.

Zusammenfassung: Wir berichten &uuml;ber eine detaillierte Chromatin Immunopr&auml;zipitation (ChIP) Protokoll f&uuml;r das einzellige gr&uuml;ne Alge Chlamydomonas Reinhardtii. Das Protokoll ist geeignet f&uuml;r die Analyse von Nukleosom Belegung, Histon-Modifikationen und Transkription Faktor Bindungsstellen auf der Ebene der Mononucleosomes f&uuml;r gezielte und genomweiten Studien. Wir beschreiben die Optimierung der Rahmenbedingungen f&uuml;r Vernetzung, Chromatin-Fragmentierung und Antik&ouml;rper-Titer-Bestimmung und bieten Empfehlungen und ein Beispiel f&uuml;r die Normalisierung der ChIP-Ergebnisse wie durch Echtzeit-PCR bestimmt.

Protokoll: Methodik zur Chromatin Immunopr&auml;zipitation (ChIP) in Chlamydomonas Reinhardtii.

ABSTRACT: Segnaliamo su un protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) cromatina dettagliato per l&#39;alga verde unicellulare Chlamydomonas reinhardtii. Il protocollo &egrave; adatto per l&#39;analisi dell&#39;occupazione del nucleosoma, modifiche dell&#39;istone e siti di legame del fattore trascrizione a livello di mononucleosomes per studi mirati e genome-wide. Ci descrivono l&#39;ottimizzazione delle condizioni di reticolazione, frammentazione della cromatina e determinazione del titolo anticorpale e fornire raccomandazioni e un esempio per la normalizzazione dei risultati ChIP come determinato da PCR in tempo reale.

Protocollo: metodologia per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in Chlamydomonas reinhardtii.

&#x6458;&#x8981;&#xFF1A; &#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x5355;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7EFF;&#x85FB;&#x83B1;&#x8335;&#x8863;&#x85FB;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x67D3;&#x8272;&#x8D28;&#x6C89;&#x6DC0; &#xFF08;&#x82AF;&#x7247;&#xFF09; &#x534F;&#x8BAE;&#x3002;&#x8BAE;&#x5B9A;&#x4E66; &#x300B; &#x9002;&#x5408;&#x5165;&#x4F4F;&#x6838;&#x5C0F;&#x4F53;&#xFF0C;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x4FEE;&#x9970;&#x4E0E;&#x4E00;&#x7EA7;&#x76EE;&#x6807;&#x548C;&#x5168;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x7814;&#x7A76;&#x7684; mononucleosomes &#x7684;&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F4D;&#x70B9;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x7684;&#x4EA4;&#x8054;&#x3001; &#x67D3;&#x8272;&#x8D28;&#x788E;&#x7247;&#x548C;&#x6297;&#x4F53;&#x6EF4;&#x5EA6;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x6761;&#x4EF6;&#x4F18;&#x5316;&#x548C;&#x6B63;&#x5E38;&#x5316;&#x7684;&#x82AF;&#x7247;&#x7ED3;&#x679C;&#x786E;&#x5B9A;&#x7684;&#x5B9E;&#x65F6;&#x8367;&#x5149;&#x5B9A;&#x91CF; PCR &#x63D0;&#x4F9B;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x548C;&#x793A;&#x4F8B;&#x3002;

&#x83B1;&#x8335;&#x8863;&#x85FB;&#x7684;&#x67D3;&#x8272;&#x8D28;&#x6C89;&#x6DC0; &#xFF08;&#x82AF;&#x7247;&#xFF09; &#x7684;&#x8BAE;&#x5B9A;&#x4E66; &#x300B;&#xFF1A; &#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

ABSTRACT: We report on a detailed chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. The protocol is suitable for the analysis of nucleosome occupancy, histone modifications and transcription factor binding sites at the level of mononucleosomes for targeted and genome-wide studies. We describe the optimization of conditions for crosslinking, chromatin fragmentation and antibody titer determination and provide recommendations and an example for the normalization of ChIP results as determined by real-time PCR.

Protocol: methodology for chromatin immunoprecipitation (ChIP) in Chlamydomonas reinhardtii.

R&eacute;sum&eacute; : Nous pr&eacute;sentons un protocole d&#39;immunopr&eacute;cipitation (ChIP) de chromatine d&eacute;taill&eacute;es pour l&#39;algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii. Le protocole est adapt&eacute; pour l&#39;analyse de l&#39;occupation du nucl&eacute;osome, modifications d&#39;histone et les sites de liaison de facteurs de transcription au niveau de mononucl&eacute;osomes d&#39;&eacute;tudes cibl&eacute;es et g&eacute;nome. Nous d&eacute;crire l&#39;optimisation des conditions de r&eacute;ticulation, la fragmentation de la chromatine et d&eacute;termination du titre anticorps et formuler des recommandations et un exemple pour la normalisation des r&eacute;sultats de la puce telle que d&eacute;termin&eacute;e par la PCR en temps r&eacute;el.

Protocole : m&eacute;thode d&#39;immunopr&eacute;cipitation de la chromatine (ChIP) dans Chlamydomonas reinhardtii.

&#x8981;&#x7D04;&#xFF1A; &#x5358;&#x7D30;&#x80DE;&#x7DD1;&#x85FB;&#x30AF;&#x30E9;&#x30DF;&#x30C9;&#x30E2;&#x30CA;&#x30B9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x306A;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C1;&#x30F3;&#x514D;&#x75AB;&#x6C88;&#x964D; (ChIP) &#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306B;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306F;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x5360;&#x6709;&#x3001;&#x30D2;&#x30B9;&#x30C8;&#x30F3;&#x4FEE;&#x98FE;&#x3068;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x30EF;&#x30A4;&#x30C9;&#x306A;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E; mononucleosomes &#x306E;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3067;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x56E0;&#x5B50;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306E;&#x89E3;&#x6790;&#x306B;&#x9069;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x67B6;&#x6A4B;, &#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C1;&#x30F3;&#x306E;&#x65AD;&#x7247;&#x5316;&#x3068;&#x6297;&#x4F53;&#x4FA1;&#x306E;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x6761;&#x4EF6;&#x306E;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0; PCR &#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5B9A;&#x3081;&#x3089;&#x308C;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x30C1;&#x30C3;&#x30D7;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x6B63;&#x898F;&#x5316;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x63A8;&#x5968;&#x4E8B;&#x9805;&#x3068;&#x4F8B;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3002;

&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C1;&#x30F3;&#x514D;&#x75AB;&#x6C88;&#x964D; (ChIP) &#x30AF;&#x30E9;&#x30DF;&#x30C9;&#x30E2;&#x30CA;&#x30B9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;: &#x65B9;&#x6CD5;&#x8AD6;&#x3002;

&#xAC1C;&#xC694;: &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB2E8; &#xC138;&#xD3EC; &#xB179;&#xC0C9; &#xC870;&#xB958; Chlamydomonas reinhardtii&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC790;&#xC138;&#xD55C; chromatin immunoprecipitation (&#xCE69;) &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;. &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC740; nucleosome &#xC810;&#xB839;, &#xD788;&#xC2A4;&#xD1A4; &#xC218;&#xC815; &#xBC0F; &#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xD0C0;&#xAC9F;&#xACFC; &#xAC8C;&#xB188; &#xC218;&#xC900;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; mononucleosomes&#xC758; &#xC218;&#xC900;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xC801;&#xD569; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAC00;&#xAD50;, chromatin &#xC870;&#xAC01;&#xD654; &#xBC0F; &#xD56D; &#xCCB4; titer &#xACB0;&#xC815;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC870;&#xAC74;&#xC758; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654;&#xC5D0; &#xC124;&#xBA85; &#xD558; &#xACE0; &#xCE69; &#xACB0;&#xACFC; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04; PCR&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xACB0;&#xC815; &#xB41C; &#xB300;&#xB85C; &#xC815;&#xC0C1;&#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAD8C;&#xC7A5; &#xC0AC;&#xD56D; &#xBC0F; &#xC608;&#xC81C;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;: chromatin immunoprecipitation (&#xCE69;) Chlamydomonas reinhardtii&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xB860;.

Resumen: Divulgamos sobre un protocolo de inmunoprecipitaci&oacute;n (ChIP) de cromatina detallada para el alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii. El protocolo es conveniente para el an&aacute;lisis de la ocupaci&oacute;n del nucleosoma, modificaciones de las histonas y sitios de uni&oacute;n del factor de transcripci&oacute;n en el nivel de mononucleosomes de estudios espec&iacute;ficos y genoma. Describimos la optimizaci&oacute;n de las condiciones para la reticulaci&oacute;n, la fragmentaci&oacute;n de la cromatina y la determinaci&oacute;n del t&iacute;tulo de anticuerpos y proporcionar recomendaciones y un ejemplo para la normalizaci&oacute;n de los resultados de la viruta por PCR en tiempo real.

Protocolo: metodolog&iacute;a de inmunoprecipitaci&oacute;n de cromatina (ChIP) en Chlamydomonas reinhardtii.

La prot&eacute;ine induisant la v&eacute;sicule dans les plastes (VIPP1) a &eacute;t&eacute; propos&eacute;e de jouer un r&ocirc;le dans la formation de membrane thylako&iuml;de par l&#39;interm&eacute;diaire de v&eacute;sicules membranaires. Comme cette attribution fonctionnelle est sujet &agrave; d&eacute;bat, nous avons &eacute;tudi&eacute; la fonction de VIPP1 chez Chlamydomonas reinhardtii. &Agrave; l&#39;aide d&#39;immunofluorescence, nous localis&eacute; VIPP1 &agrave; taches distinctes dans le chloroplaste. Dans les cellules de micro-ARN interf&eacute;rence/artificielles VIPP1-RNA, nous avons constamment observ&eacute; aberrantes, structures ressemblant &agrave; des corps prolamellaires &agrave; l&#39;origine de multiples couches de membrane de thylakoid, qui semblent co&iuml;ncider avec les taches VIPP1 par immunofluorescence et sugg&egrave;rent un d&eacute;faut dans la biogen&egrave;se des membranes thylako&iuml;des. En cons&eacute;quence, &agrave; l&#39;aide de prot&eacute;omique quantitative de fusil de chasse, nous avons constat&eacute; que cellules mutantes vipp1 atones s&#39;accumulent les photosyst&egrave;mes 14 &agrave; 20 % de moins, du cytochrome b (6) f complexe et ATP synthase mais 30 % plus l&eacute;ger-r&eacute;colte complexe II que la commande cellules, tandis que l&#39;assemblage complexe, ultrastructure de membranes thylako&iuml;des, et en vrac la composition lipidique semble intacte. Photosyst&egrave;mes vipp1 mutants sont sensibles &agrave; la lumi&egrave;re forte, qui co&iuml;ncide avec un potentiel de point m&eacute;dian abaiss&eacute;e du couple redox Q(A)/Q(A)(-) et thermosensibilit&eacute; accrue du photosyst&egrave;me II (PSII), sugg&eacute;rant des d&eacute;fauts structurels de PSII. En outre, thylako&iuml;des enfl&eacute;s, malgr&eacute; la mise sous tension de membrane r&eacute;duite, chez les mutants vipp1 cultiv&eacute; sur d&#39;ammonium sugg&egrave;rent d&eacute;fauts dans l&#39;organisation supermol&eacute;culaire des complexes membranaires thylako&iuml;des. Dans l&#39;ensemble, nos r&eacute;sultats sugg&egrave;rent un r&ocirc;le de VIPP1 dans la biogen&egrave;se/assemblage des complexes de noyau membrane de thylakoid, probables en fournissant des lipides structuraux.

Preuve d&#39;un r&ocirc;le de VIPP1 dans l&#39;organisation structurale de l&#39;appareil photosynth&eacute;tique chez Chlamydomonas.

&#x56CA;&#x6CE1;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x8D28; (VIPP1) &#x6709;&#x4EBA;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x5728;&#x7C7B;&#x56CA;&#x4F53;&#x819C;&#x901A;&#x8FC7;&#x819C;&#x5C0F;&#x6CE1;&#x7684;&#x819C;&#x5F62;&#x6210;&#x4E2D;&#x53D1;&#x6325;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x7531;&#x4E8E;&#x6B64;&#x529F;&#x80FD;&#x5206;&#x914D;&#x662F;&#x6839;&#x636E;&#x8FA9;&#x8BBA;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8C03;&#x67E5;&#x7684; VIPP1 &#x83B1;&#x8335;&#x8863;&#x85FB;&#x4E2D;&#x7684;&#x51FD;&#x6570;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5229;&#x7528;&#x514D;&#x75AB;&#x8367;&#x5149;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x672C;&#x5730;&#x5316; VIPP1 &#x4E3A;&#x53F6;&#x7EFF;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x4E0D;&#x540C;&#x70B9;&#x3002;&#x5728; VIPP1 RNA &#x5E72;&#x6270;/&#x4EBA;&#x5DE5; microRNA &#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4E00;&#x8D2F;&#x9075;&#x5B88;&#x5F02;&#x5E38;&#xFF0C;&#x7167;&#x4F53;&#x6837;&#x7ED3;&#x6784;&#x591A;&#x7C7B;&#x56CA;&#x4F53;&#x819C;&#x819C;&#x5C42;&#xFF0C;&#x4F3C;&#x4E4E;&#x514D;&#x75AB;&#x8367;&#x5149; VIPP1 &#x70B9;&#x76F8;&#x543B;&#x5408;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x5728;&#x7C7B;&#x56CA;&#x4F53;&#x819C;&#x819C;&#x751F;&#x7269;&#x53D1;&#x751F;&#x7F3A;&#x9677;&#x7684;&#x6E90;&#x5934;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7528;&#x730E;&#x67AA;&#x5B9A;&#x91CF;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EC4;&#x5B66;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x8F7B;&#x58F0;&#x7684; vipp1 &#x7A81;&#x53D8;&#x7EC6;&#x80DE;&#x79EF;&#x7D2F;&#x5C11; 14 &#x5230; 20%&#x5149;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x3001; &#x590D;&#x6742;&#xFF0C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8272;&#x7D20; b (6) f &#x548C; ATP &#x5408;&#x6210;&#x9176;&#x4F46; 30%&#x66F4;&#x591A;&#x6355;&#x5149;&#x590D;&#x5408;&#x7269; II &#x6BD4;&#x63A7;&#x5236;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x800C;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x96C6;&#x3001; &#x7C7B;&#x56CA;&#x4F53;&#x819C;&#x819C;&#x8D85;&#x5FAE;&#x7ED3;&#x6784;&#xFF0C;&#x6279;&#x91CF;&#x51FA;&#x73B0;&#x4E0D;&#x53D8;&#x7684;&#x8102;&#x8D28;&#x6210;&#x5206;&#x3002;Vipp1 &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x5149;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x533A;&#x5206;&#x9AD8;&#x706F;&#xFF0C;&#x6B63;&#x503C; Q(A)/Q(A)(-) &#x6C27;&#x5316;&#x8FD8;&#x539F;&#x592B;&#x5987;&#x964D;&#x4F4E;&#x4E2D;&#x70B9;&#x6F5C;&#x529B;&#x548C;&#x589E;&#x52A0;&#x7684;&#x6E29;&#x5149;&#x7CFB;&#x7EDF; II (PSII)&#xFF0C;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x5728; PSII &#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x6027;&#x7F3A;&#x9677;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x80BF;&#x7684;&#x5F31;&#x5149;&#xFF0C;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684;&#x819C;&#x5408;&#x95F8;&#xFF0C;vipp1 &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x751F;&#x957F;&#x5728;&#x94F5;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x7C7B;&#x56CA;&#x4F53;&#x819C;&#x819C;&#x590D;&#x5408;&#x4F53;&#x7684;&#x8D85;&#x5206;&#x5B50;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x7684;&#x7F3A;&#x9677;&#x3002;&#x603B;&#x4F53;&#x800C;&#x8A00;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x8868;&#x660E;&#x5728;&#x7C7B;&#x56CA;&#x4F53;&#x819C;&#x819C;&#x6838;&#x5FC3;&#x590D;&#x5408;&#x7269;&#xFF0C;&#x6700;&#x6709;&#x53EF;&#x80FD;&#x901A;&#x8FC7;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7ED3;&#x6784;&#x6027;&#x8840;&#x8102;&#x751F;&#x7269;&#x53D1;&#x751F;/&#x7A0B;&#x5E8F;&#x96C6;&#x7684; VIPP1 &#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

VIPP1 &#x5728;&#x83B1;&#x8335;&#x8863;&#x85FB;&#x5149;&#x5408;&#x673A;&#x6784;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x8BC1;&#x636E;&#x3002;

The vesicle-inducing protein in plastids (VIPP1) was suggested to play a role in thylakoid membrane formation via membrane vesicles. As this functional assignment is under debate, we investigated the function of VIPP1 in Chlamydomonas reinhardtii. Using immunofluorescence, we localized VIPP1 to distinct spots within the chloroplast. In VIPP1-RNA interference/artificial microRNA cells, we consistently observed aberrant, prolamellar body-like structures at the origin of multiple thylakoid membrane layers, which appear to coincide with the immunofluorescent VIPP1 spots and suggest a defect in thylakoid membrane biogenesis. Accordingly, using quantitative shotgun proteomics, we found that unstressed vipp1 mutant cells accumulate 14 to 20% less photosystems, cytochrome b(6)f complex, and ATP synthase but 30% more light-harvesting complex II than control cells, while complex assembly, thylakoid membrane ultrastructure, and bulk lipid composition appeared unaltered. Photosystems in vipp1 mutants are sensitive to high light, which coincides with a lowered midpoint potential of the Q(A)/Q(A)(-) redox couple and increased thermosensitivity of photosystem II (PSII), suggesting structural defects in PSII. Moreover, swollen thylakoids, despite reduced membrane energization, in vipp1 mutants grown on ammonium suggest defects in the supermolecular organization of thylakoid membrane complexes. Overall, our data suggest a role of VIPP1 in the biogenesis/assembly of thylakoid membrane core complexes, most likely by supplying structural lipids.

Evidence for a role of VIPP1 in the structural organization of the photosynthetic apparatus in Chlamydomonas.

Das Vesikel-induzierende Protein in Plastiden (VIPP1) wurde vorgeschlagen, eine Rolle in der Thylakoid Membrane Anordnung &uuml;ber Membran Vesikel. Wie diese funktionale Zuordnung unter Debatte, untersuchten wir die Funktion des VIPP1 in Chlamydomonas Reinhardtii. Mit Immunfluoreszenz, lokalisiert wir VIPP1 auf unterschiedliche Flecken innerhalb der Chloroplasten. In VIPP1-RNA Interferenz/k&uuml;nstliche MicroRNA Zellen, beobachten wir konsequent aberrant, Prolamellar K&ouml;rper-Strukturen am Ursprung der Thylakoid Membrane Mehrschichtigkeit, die anscheinend mit der Immunfluoreszenz VIPP1 Spots zusammenfallen und schlagen einen Defekt im Thylakoid Membrane Biogenese. Dementsprechend fanden Verwendung quantitativer Schrotflinte Proteomics, wir, dass unbetontes vipp1 mutierten Zellen ansammeln von 14 bis 20 % weniger Photosystems, f-Komplex, Cytochrom-b (6) und ATP-Synthase aber 30 % mehr Licht-ernten Komplex II als Steuerelement, w&auml;hrend komplexe Montage, Thylakoid Membrane Ultrastruktur, Zellen und bulk-Lipid-Komposition erschien unver&auml;ndert. Photosystems in vipp1 Mutanten sind empfindlich gegen&uuml;ber high-Light, zusammen mit einem gesenkten Mittelpunkt-Potential des Paares Redox Q(A)/Q(A)(-) und erh&ouml;hte Thermosensitivity von Photosystem II (PSII), strukturelle Defekte in PSII vorschlagen. Dar&uuml;ber hinaus schlagen geschwollene Granalamelle, trotz reduzierter Membran energetisieren, in vipp1 Mutanten auf Ammonium angebaut M&auml;ngel in der supermolecular Organisation der Thylakoid Membrane komplexe. Insgesamt weisen unsere Daten auf eine Rolle der VIPP1 in der Biogenese/Montage der Thylakoid Membrane Kernkomplexe, am ehesten durch strukturelle Lipide bereitstellen.

Beweise f&uuml;r eine Rolle der VIPP1 in der strukturellen Organisation des photosynthetischen Apparats in Chlamydomonas.

La proteina che induce la vescicola in plastidi (VIPP1) &egrave; stata suggerita di giocare un ruolo nella formazione membrana tilacoide tramite vescicole di membrana. Come questa assegnazione funzionale &egrave; in discussione, abbiamo studiato la funzione del VIPP1 in Chlamydomonas reinhardtii. Mediante immunofluorescenza, abbiamo localizzato VIPP1 punti distinti all&#39;interno del cloroplasto. Nelle cellule di microRNA interferenze/artificiale VIPP1-RNA, abbiamo costantemente osservato aberrante, prolamellar corpo-come le strutture all&#39;origine di pi&ugrave; strati di membrana tilacoide, che sembrano coincidere con le macchie VIPP1 immunofluorescenza e suggeriscono un difetto nella biogenesi membrana tilacoide. Di conseguenza, utilizzando proteomica quantitativa fucile, abbiamo scoperto che cellule mutanti atone vipp1 accumulano fotosistema 14 al 20% in meno, citocromo b (6) f complesse e ATP sintasi, ma 30% pi&ugrave; luce-raccolta II complesso di controllo celle, mentre il complesso assemblaggio, ultrastruttura membrana tilacoide, e composizione lipidica &egrave; apparso inalterato di massa. Fotosistema vipp1 mutanti &egrave; sensibili alla luce alta, che coincide con un potenziale di punto mediano abbassato della coppia redox Q(A)/Q(A)(-) e maggiore termosensibilit&agrave; del fotosistema II (PSII), suggerendo di difetti strutturali nel PSII. Inoltre, gonfio granario, nonostante inserzione membrana ridotta, mutanti vipp1 coltivate su ammonio suggerisce difetti nell&#39;organizzazione dei complessi di membrana tilacoide degrada. Nel complesso, i nostri dati suggeriscono un ruolo di VIPP1 nell&#39;assembly/biogenesi dei complessi di tilacoide membrana nucleo, probabilmente fornendo lipidi strutturali.

Prova per un ruolo di VIPP1 nell&#39;organizzazione strutturale dell&#39;apparato fotosintetico in Chlamydomonas.

&#x5C0F;&#x80DE;&#x3092;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3059;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C1;&#x30C9; (VIPP1) &#x306E;&#x30C1;&#x30E9;&#x30B3;&#x30A4;&#x30C9;&#x819C;&#x5F62;&#x6210;&#x819C;&#x5C0F;&#x80DE;&#x3092;&#x7D4C;&#x7531;&#x3067;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x5272;&#x308A;&#x5F53;&#x3066;&#x306E;&#x4E0B;&#x3067;&#x306E;&#x8B70;&#x8AD6;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x30AF;&#x30E9;&#x30DF;&#x30C9;&#x30E2;&#x30CA;&#x30B9;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B; VIPP1 &#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x305F;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x6297;&#x4F53;&#x6CD5;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005; VIPP1&#x3001;&#x8449;&#x7DD1;&#x4F53;&#x5185;&#x306E;&#x500B;&#x5225;&#x306E;&#x70B9;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3002;VIPP1 RNA &#x5E72;&#x6E09;/&#x4EBA;&#x5DE5;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED; Rna &#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x4E00;&#x8CAB;&#x3057;&#x3066;&#x7570;&#x5E38;&#x3001;&#x89B3;&#x5BDF;&#x82BD;&#x751F;&#x3048;&#x306E;&#x4F53;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x69CB;&#x9020;&#x86CD;&#x5149; VIPP1 &#x30B9;&#x30DD;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x4E00;&#x81F4;&#x3057;&#x3001;&#x30C1;&#x30E9;&#x30B3;&#x30A4;&#x30C9;&#x819C;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x6B20;&#x9665;&#x306E;&#x3082;&#x306E;&#x306B;&#x898B;&#x3048;&#x308B;&#x8907;&#x6570;&#x30C1;&#x30E9;&#x30B3;&#x30A4;&#x30C9;&#x819C;&#x5C64;&#x306E;&#x539F;&#x70B9;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x30B7;&#x30E7;&#x30C3;&#x30C8;&#x30AC;&#x30F3;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30AA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x3001;unstressed vipp1 &#x5909;&#x7570;&#x7D30;&#x80DE; 14 &#xFF5E; 20% &#x3088;&#x308A;&#x5C11;&#x306A;&#x3044;&#x5F37;&#x3001;&#x30C1;&#x30C8;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30E0; b (6) f &#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x3068; ATP &#x5408;&#x6210;&#x9175;&#x7D20;&#x304C; 30% &#x3088;&#x308A;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x5149;&#x53CE;&#x7A6B;&#x306E;&#x8907;&#x5408;&#x4F53; II &#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x3088;&#x308A;&#x7D30;&#x80DE;&#x3001;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x3001;&#x30C1;&#x30E9;&#x30B3;&#x30A4;&#x30C9;&#x819C;&#x306E;&#x5FAE;&#x7D30;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x84C4;&#x7A4D;&#x3057;&#x3001;&#x4E0D;&#x5909;&#x767B;&#x5834;&#x8102;&#x8CEA;&#x7D44;&#x6210;&#x304C;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;2P327 vipp1 &#x5909;&#x7570;&#x4F53; Q(A)/Q(A)(-) &#x306E;&#x9178;&#x5316;&#x9084;&#x5143;&#x30AB;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306E;&#x4E0B;&#x3052;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x4E2D;&#x70B9;&#x96FB;&#x4F4D;&#x3068;&#x306E;&#x5149;&#x5316;&#x5B66;&#x7CFB; II (PSII) PSII &#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x69CB;&#x9020;&#x6B20;&#x9665;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x5897;&#x52A0;&#x611F;&#x5FDC;&#x3068;&#x4E00;&#x81F4;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x9AD8;&#x3044;&#x5149;&#x306B;&#x654F;&#x611F;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x30A2;&#x30F3;&#x30E2;&#x30CB;&#x30A6;&#x30E0;&#x306B;&#x6210;&#x9577;&#x3057;&#x305F; vipp1 &#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x6E1B;&#x5C11;&#x819C;&#x901A;&#x96FB;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;&#x816B;&#x308C;&#x306E;&#x30C1;&#x30E9;&#x30B3;&#x30A4;&#x30C9; &#x30C1;&#x30E9;&#x30B3;&#x30A4;&#x30C9;&#x819C;&#x932F;&#x4F53;&#x306E;&#x8D85;&#x5206;&#x5B50;&#x7D44;&#x7E54;&#x4E2D;&#x306E;&#x6B20;&#x9665;&#x3092;&#x304A;&#x52E7;&#x3081;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5168;&#x4F53;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x30C1;&#x30E9;&#x30B3;&#x30A4;&#x30C9;&#x819C;&#x30B3;&#x30A2;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x3001;&#x69CB;&#x9020;&#x8102;&#x8CEA;&#x3092;&#x4F9B;&#x7D66;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x6700;&#x3082;&#x9AD8;&#x3044;&#x5668;&#x5B98;/&#x7D44;&#x7ACB;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B; VIPP1 &#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x304A;&#x52E7;&#x3081;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30AF;&#x30E9;&#x30DF;&#x30C9;&#x30E2;&#x30CA;&#x30B9;&#x306E;&#x5149;&#x5408;&#x6210;&#x5668;&#x5B98;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x7D44;&#x7E54;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B; VIPP1 &#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x306E;&#x8A3C;&#x62E0;&#x3002;

Plastids (VIPP1)&#xC5D0;&#xC11C; &#xAE30; &#xC720;&#xB3C4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB9C9; &#xC18C;&#xD3EC;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; thylakoid &#xB9C9; &#xD615;&#xC131;&#xC5D0; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB17C;&#xC7C1;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC774; &#xAE30;&#xB2A5; &#xD560;&#xB2F9;&#xC73C;&#xB85C; &#xC6B0;&#xB9AC; Chlamydomonas reinhardtii&#xC5D0;&#xC11C; vipp1&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC870;&#xC0AC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBA74;&#xC5ED; &#xD615;&#xAD11; &#xAC80;&#xC0AC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC5FD;&#xB85D;&#xCCB4; &#xB0B4;&#xC758; &#xACE0;&#xC720;&#xD55C; &#xBA85;&#xC18C; VIPP1 &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;. VIPP1 RNA &#xAC04;&#xC12D;/&#xC778;&#xACF5; microRNA &#xC140;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC77C;&#xAD00; &#xB418; &#xAC8C; &#xAD00;&#xCC30; &#xD0C8; &#xC120;, thylakoid &#xB9C9; &#xB808;&#xC774;&#xC5B4; immunofluorescent VIPP1 &#xAD00;&#xAD11; &#xBA85;&#xC18C;&#xC5D0; &#xB9DE;&#xCDB0; thylakoid &#xB9C9; &#xC18D;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xD568;&#xC744; &#xCD94;&#xCC9C; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB418;&#xB294; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xCD9C;&#xCC98;&#xC5D0;&#xC11C; prolamellar &#xBC14;&#xB514; &#xBAA8;&#xC591;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;. &#xC774; &#xB530;&#xB77C; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xAC15;&#xC138; vipp1 &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC138;&#xD3EC; 14 ~ 20% &#xB354; &#xC801;&#xC740; photosystems, &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD558; &#xACE0;, &#xC2DC; &#xD1A0; &#xD06C;&#xB86C; b (6) f&#xC640; ATP synthase &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;, thylakoid &#xB9C9; &#xB300;&#xAD8C; &#xB3D9;&#xC548; &#xCEE8;&#xD2B8;&#xB864; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB354; &#xB9CE;&#xC740; &#xBE5B; &#xC218;&#xD655; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; II &#xC138;&#xD3EC; 30% &#xCD95;&#xC801; &#xD558; &#xACE0; &#xB300;&#xB7C9;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCC0;&#xACBD; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xCC44; &#xB4F1;&#xC7A5; &#xD558;&#xB294; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xC870;&#xC131; &#xBC1C;&#xACAC; &#xC591;&#xC801; &#xC0F7;&#xAC74; proteomics&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;. Vipp1 &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC5D0; Photosystems photosystem II (PSII), &#xC81C;&#xC548; PSII&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xACB0;&#xD568;&#xC758; &#xC99D;&#xAC00; thermosensitivity Q(A)/Q(A)(-) redox &#xBD80;&#xBD80;&#xC758; &#xB0AE;&#xCD98;&#xB41C; &#xC911;&#xAC04;&#xC810; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xB825;&#xACFC; &#xC77C;&#xCE58; &#xD558;&#xB294; &#xB192;&#xC740; &#xBE5B;&#xC5D0; &#xBBFC;&#xAC10;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xAC10;&#xC18C; &#xB41C; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; energization vipp1 &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC554;&#xBAA8;&#xB284;&#xC5D0; &#xC131;&#xC7A5;&#xC5D0; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; &#xBD80; &#xC5B4; thylakoids &#xACB0;&#xD568;&#xC744; thylakoid &#xB9C9; &#xB2E8;&#xC9C0;&#xC758; supermolecular &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC804;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xB370;&#xC774;&#xD130; thylakoid &#xB9C9; &#xCF54;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xC9C0;, &#xAD6C;&#xC870; &#xC9C0;&#xC9C8;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558; &#xC5EC; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC758; &#xC18D;/&#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC5D0; vipp1&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC81C;&#xC548;.

Chlamydomonas&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD11;&#xD569;&#xC131; &#xAE30;&#xAD6C; &#xAD6C;&#xC870; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0;&#xC11C; vipp1&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC99D;&#xAC70;.

La prote&iacute;na inductora de ves&iacute;cula en pl&aacute;stidos (VIPP1) sugiri&oacute; a desempe&ntilde;ar un papel en la formaci&oacute;n de la membrana TILACOIDE mediante ves&iacute;culas de membrana. Como esta asignaci&oacute;n funcional es objeto de debate, investigamos la funci&oacute;n de VIPP1 en Chlamydomonas reinhardtii. Mediante inmunofluorescencia, que localizado VIPP1 a distintos lugares en el cloroplasto. En las c&eacute;lulas de microRNA interferencia artificial VIPP1-RNA, constantemente observamos aberrantes, prolamellar cuerpo-como las estructuras en el origen de m&uacute;ltiples capas de la membrana TILACOIDE, que parecen coincidir con los puntos de VIPP1 inmunofluorescentes y sugieren un defecto en la biog&eacute;nesis de la membrana TILACOIDE. En consecuencia, utilizando prote&oacute;mica cuantitativa de la escopeta, encontramos que las c&eacute;lulas mutantes vipp1 unstressed acumulan 14 a 20% menos fotosistemas, citocromo b (6) f complejo y ATP sintasa pero 30% c&eacute;lulas II complejo recolecci&oacute;n de luz m&aacute;s que control, mientras el conjunto complejo, ultraestructura de la membrana TILACOIDE, y a granel composici&oacute;n lip&iacute;dica aparecido sin alteraciones. Fotosistemas en vipp1 mutantes son sensibles a la luz alta, que coincide con un potencial punto medio de la bajada de los pares redox Q(A)/Q(A)(-) y creciente thermosensitivity del fotosistema II (PSII), sugiriendo defectos estructurales en PSII. Por otra parte, tilacoides hinchadas, a pesar de energizaci&oacute;n reducida de la membrana, en mutantes de vipp1 cultivadas en amonio sugieren defectos en la organizaci&oacute;n supermolecular de complejos de membrana TILACOIDE. En general, nuestros datos sugieren un papel de VIPP1 en la biog&eacute;nesis/Asamblea de complejos de base de la membrana TILACOIDE, probablemente mediante el suministro de l&iacute;pidos estructurales.

Stefan Schmollinger

Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on ¹⁵N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Stefan Schmollinger

Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on ¹⁵N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation