Interesuje nas wydolność układu wzrokowego w mysim modelu zdrowia i choroby. Obecnie używamy odruchu optokinetycznego, w skrócie OKR, który jest mimowolnym ruchem gałek ocznych, który służy do stabilizacji obrazów siatkówki, aby zrozumieć, w jaki sposób układ wzrokowy przyczynia się do procesów adaptacyjnych w wrodzonych zachowaniach wzrokowych. Badania z wykorzystaniem modelu OKR poszerzyły naszą wiedzę na temat wrodzonego zachowania i plastyczności, wykazując, że długotrwała stymulacja wzrokowa lub upośledzona przez podobny odruch oczny może zwiększyć amplitudę zachowania, a także badając leżące u jej podstaw mechanizmy molekularne, synaptyczne i wydzielnicze.
Połączyliśmy wideookulografię i skomputeryzowaną wirtualną stymulację wizualną, aby precyzyjnie określić ilościowo zachowanie wywoływane przez OKR poprzez obcinanie z dowolnie zmieniającymi się parametrami. Ta procedura jest stosunkowo prosta i może być ustandaryzowana, aby dostosować się do badań na dużą skalę. Nasz protokół dokładnie analizuje kształty krzywych strojenia i preferowane cechy wizualne, wykrywa subtelne różnice w normalnych i patologicznych stanach, a także może monitorować zmiany OKR spowodowane leczeniem farmakologicznym lub wizualnym uczeniem motorycznym.
Wysoka precyzja i moc ilościowa umożliwiają porównywanie powtarzalnych pomiarów OKR tych samych myszy w badaniach podłużnych i ich różnych zabiegach farmakologicznych lub przy zachowaniu obwodów nerwowych. Daje również możliwość badania obwodów nerwowych i mechanizmów obwodów plastyczności OKR. Po znieczuleniu myszy umieść ją na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała.
Nałóż warstwę nawilżającej maści do oczu na oba oczy i przykryj je folią aluminiową, aby chronić je przed światłem, a następnie wstrzyknij podskórnie karprofen w dawce 20 miligramów na kilogram, aby zmniejszyć ból. Zwilż futro na czubku czaszki 4% glukonianem chlorheksydyny i ogol obszar. Dwukrotnie zdezynfekuj odsłoniętą skórę głowy za pomocą 70% alkoholu izopropylowego i alkoholu chlorheksydynowego.
Następnie należy wstrzyknąć bupiwakainę podskórnie w miejsce nacięcia, a następnie usunąć skórę głowy nożyczkami, aby odsłonić grzbietową powierzchnię czaszki, w tym tylną kość czołową, kość ciemieniową i kość międzyciemieniową. Nałóż kilka kropli 1% lidokainy i od jednej do 100 000 epinefryny na odsłoniętą czaszkę, aby zmniejszyć miejscowy ból i krwawienie. następnie zeskrob czaszkę łyżeczką Meyhoefera, aby usunąć powięź i wyczyść ją PBS.
Delikatnie wdmuchnij sprężone powietrze na powierzchnię czaszki, aż wilgoć zniknie, a kość zmieni kolor na białawy, a następnie nałóż cienką warstwę super kleju na odsłoniętą powierzchnię czaszki, w tym krawędź przeciętej skóry głowy, a następnie warstwę żywicy akrylowej. Teraz umieść drążek na głowę ze stali nierdzewnej wzdłuż linii środkowej na szczycie czaszki i nałóż więcej żywicy akrylowej, zaczynając od krawędzi drążka na głowę, aż jego podstawa zostanie całkowicie osadzona w żywicy akrylowej. Odczekaj około 15 minut, aż żywica akrylowa stwardnieje.
Podskórnie wstrzyknąć jeden mililitr roztworu Ringera z mleczanami, a następnie umieścić mysz z powrotem w klatce umieszczonej na poduszce grzewczej, aż zwierzę będzie w pełni mobilne. Po ustawieniu wirtualnego bębna i wideookulografii przymocuj głowę zwierzęcia do niestandardowej sceny. Dostosuj nachylenie głowy tak, aby lewe i prawe oko były wyrównane, a kąciki nosa i skroniowe oczu były wyrównane poziomo.
Przenieś stolik ze zwierzęciem umocowanym na głowie na środek pomieszczenia utworzonego przez trzy monitory. Otwórz oprogramowanie do śledzenia ruchu gałek ocznych i kliknij opcję swobodnego biegu, a następnie kliknij przycisk uruchamiania, aby włączyć kamerę. Dostosuj pozycję prawego oka, aż pojawi się na środku filmu.
Obróć ramię kamery do lewego skrajnego końca, a następnie ręcznie przesuń pozycję prawego oka zwierzęcia na płaszczyznę poziomą prostopadłą do osi optycznej z precyzyjną regulacją etapu translacyjnego 2D, aż odbicie rogówki X znajdzie się w poziomym środku obrazu. Teraz obróć ramię kamery na drugi koniec, a jeśli odbicie rogówki X ucieka od środka obrazu, przesuń prawe oko wzdłuż osi optycznej z precyzyjną regulacją, aż odbicie rogówki X znajdzie się na środku. Powtórz kilka razy, aż odbicie rogówki X pozostanie pośrodku, gdy ramię aparatu kołysze się w lewo i w prawo.
Kliknij przycisk kalibracji, a następnie przycisk uruchom. Włącz diodę LED odbicia rogówki Y i zapisz jej położenie na wideo, a następnie przełącz się na diodę LED odbicia rogówki X i zarejestruj jej pozycję. Aby zmierzyć promień obrotu źrenicy, obróć ramię kamery do lewego końca.
Nagraj pozycje źrenicy i odbicia rogówki X na filmie, klikając prawym przyciskiem myszy, a następnie obróć ramię kamery w prawo. Nagraj pozycje źrenicy i X odbicia rogówki na filmie. Na podstawie zarejestrowanych wartości oblicz promień obrotu źrenicy, RP, korzystając z tego wzoru.
Aby rozwinąć zależność między obrotem źrenicy a średnicą źrenicy, wyreguluj luminancję monitorów od zera do 160 kandeli na metr kwadratowy, aby kontrolować rozmiar źrenicy i rejestrować średnicę źrenicy dla każdej wartości luminancji. Dla każdej wartości luminancji zmierz promień obrotu źrenicy od ośmiu do 10 razy i zapisz średnicę źrenicy. Następnie użyj regresji liniowej, aby przeanalizować zależność między promieniem obrotu źrenicy RP a średnicą źrenicy oraz wyprowadzić nachylenie i punkt przecięcia modelu liniowego.
Po zamocowaniu główki myszy w statywie i skalibrowaniu ruchów gałek ocznych, zablokuj ramię kamery w pozycji środkowej. Uruchom oprogramowanie do stymulacji wzrokowej i śledzenia ruchu gałek ocznych. W przypadku fototopowego pomiaru OKR upewnij się, że krata bębna oscyluje poziomo zgodnie z trajektorią sinusoidalną.
W przypadku skotopowego OKR, aby uzyskać skotopową stymulację wizualną, przykryj ekran każdego monitora niestandardowym filtrem wykonanym z pięciu warstw folii o neutralnej gęstości 1,2 i wyłącz światło w pomieszczeniu. Nałóż jedną kroplę roztworu pilokarpiny na prawe oko i odczekaj 15 minut, aby zmniejszyć źrenicę do odpowiedniego rozmiaru do śledzenia wzroku w warunkach skotopowych. Upewnij się, że kropla pozostaje na oku i nie jest wycierana przez mysz.
Następnie przepłucz prawe oko solą fizjologiczną, aby dokładnie zmyć roztwór pilokarpiny. Na koniec opuść kurtynę, aby całkowicie uszczelnić obudowę, co zapobiega zakłócaniu widzenia skotopowego przez rozproszone światło. Uruchom oprogramowanie do stymulacji wzrokowej i śledzenia ruchu gałek ocznych.
W przypadku skotopowego pomiaru OKR upewnij się, że krata bębna dryfuje ze stałą prędkością od lewej do prawej, w kierunku skroniowym nosa wokół lewego oka. Wzmocnienie OKR różniło się w zależności od wartości częstotliwości przestrzennej, częstotliwości oscylacji i kierunku ruchu siatki. Krzywa dostrajania częstotliwości przestrzennej zachowania OKR osiągnęła szczyt przy pośredniej częstotliwości przestrzennej wynoszącej 0,16 cykli na stopień.
Krzywa strojenia częstotliwości oscylacji monotonicznie zmniejszała się wraz ze wzrostem częstotliwości oscylacji kraty bębna. Horyzontalny OKR może być również indukowany przez siatki poruszające się w różnych kierunkach, ale najsilniejsze poziome zachowanie OKR było wywoływane przez skroniowy ruch nosa. Po 45 minutach ciągłej stymulacji OKR-ów amplituda zachowania OKR-ów uległa znacznemu wzmocnieniu.
