Opracowanie normalnych terapii ukierunkowanych na przepuszczalność naczyń krwionośnych, prekursora powszechnych chorób, takich jak miażdżyca, wymaga rygorystycznych badań przedklinicznych. Jednak złożone metody wytwarzania często utrudniają odtwarzalność i wysoką przepustowość produkcji modeli in vitro, co jest warunkiem wstępnym dla badań farmakologicznych. W tym przypadku wykorzystujemy automatyzację technologii biodruku wielomateriałowego, aby rozwiązać ten problem.
Integrując konwencjonalny system płytek dołkowych ze sterowanym komputerowo drukiem 3D, usprawniamy proces wytwarzania, upraszczamy proces hodowli i umożliwiamy analizę w czasie rzeczywistym dzięki jego kompatybilności z czytnikami mikropłytek i zestawami obrazowania mikroskopowego. Jednak istniejące metody często obejmują wieloetapowe i ręczne procesy wytwarzania, co utrudnia ich odtwarzalność. Nasze badania wprowadzają związaną z oprogramowaniem produkcję modeli ludzkich naczyń krwionośnych in vitro o skomplikowanych parametrach geometrycznych.
Biodruk na płytach wieloobróbczych pozwala na produkcję o wysokiej przepustowości na żądanie. Postępy te sugerują, że modele tkanek in vitro będą miały kluczowe znaczenie dla przyszłych odkryć medycznych. Na początek odwiedź internetowe narzędzie do symulacji G-code, takie jak NCViewer, aby wygenerować i zwizualizować ścieżkę drukowania.
Kliknij ikonę Nowy plik w interfejsie, aby utworzyć nowy plik G-code. Ręcznie napisz polecenia G-code dla kanału protektorowego i komory krzemowej. Po zakończeniu G-code kliknij ikonę Zapisz plik w interfejsie, aby pobrać plik z rozszerzeniem nc.
Połącz polimery silikonowe SE1700 i PDMS w stosunku 10 do dwóch. Następnie dodaj utwardzacz dla każdego polimeru w stosunku 10 do jednego polimeru do utwardzacza. Za pomocą miksera planetarnego dokładnie wymieszaj i odgazuj mieszaninę polimerów przy 2 000 obr./min.
Teraz użyj szpatułki, aby przenieść zmieszany polimer silikonowy do jednorazowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów. Odwiruj załadowaną strzykawkę o masie 400 G przez trzy minuty w temperaturze pięciu stopni Celsjusza, aby zapewnić jednolitą konsystencję i uniknąć pęcherzyków powietrza podczas drukowania. Następnie dodaj zważoną ilość pluronu F127 do wody destylowanej i utwórz 40% roztwór podstawowy.
Mieszaj pluroniczny roztwór F127 w mikserze planetarnym przez trzy minuty w temperaturze 400G. Utrzymuj homogenizowaną mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do całkowitego rozpuszczenia ciała stałego. Przed drukowaniem należy wymieszać 100 mikrolitrów trombiny z 900 mikrolitrami pluronu F127, aby przygotować jeden mililitr tuszu ofiarnego.
Aby rozpocząć, przed wytwarzaniem, potraktuj sześciodołkową płytkę plazmą tlenową o mocy 100 watów przez jedną minutę. Ustaw temperaturę głowicy biodrukarki na 37 stopni Celsjusza dla tuszu protektorowego i pięć stopni Celsjusza dla tuszu silikonowego. Następnie przymocuj do silikonowej strzykawki dyszę stożkową z podwójnym gwintem o rozmiarze 22 mm.
Załaduj atramenty silikonowe i protektorowe do głowicy drukującej biodrukarki. Załaduj żądany kod G i naciśnij i przytrzymaj przez trzy sekundy funkcję Servo Ready w interfejsie oprogramowania biodrukarki. Umieść płytkę na stole montażowym w punkcie początkowym kodu G i kliknij przycisk Start, aby rozpocząć proces drukowania.
Teraz umieść pokrywkę na talerzu. Następnie utwardź silikonowe komory w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Wzór ofiarny na VOP pozostał wolny od wysuszenia.
Na początek rozpuść 0,01 grama LAP w 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej 20 mililitrów PBS. Do roztworu LAP dodać trzy gramy metakrylanu żelatyny i 0,2 grama fibrynogenu. Umieść mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Dodaj 300 mikrolitrów wstępnie podgrzanego żelu fib do każdej komory hydrożelowej platformy VOP, aby osadzić wzór ofiarny. Użyj światła UV, aby szybko usieciować metakrylan żelatyny. Po powtórzeniu sieciowania UV dla wszystkich innych studzienek, należy odpipetować jeden mililitr DPBS z każdej strony kanału naczyniowego każdej studzienki.
Umieść płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 15 minut, aby upłynnić pluroniczny F127. Przed wprowadzeniem komórek do kanałów należy przez 30 minut przepuszczać DMEM F12 zawierający 1% matrigel. Na początek zanurz fiolkę z kriokonserwowanymi HUVEC w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni na dwie minuty.
Następnie przepłukać fiolkę 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Odpipetować pięć mililitrów wstępnie podgrzanego ECGM do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Za pomocą mikropipety ostrożnie przenieść rozmrożone komórki z fiolki do stożkowej probówki.
Następnie dodaj jeden mililitr świeżego, wstępnie ciepłego podłoża do fiolki kriogenicznej, aby przepłukać wnętrze i przenieść pozostałe komórki do stożkowej probówki. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach świeżego podłoża. Następnie przenieść komórki do kolby T75.
Inkubować kolbę w nawilżanym inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przepłucz 90% zlewające się komórki HUVEC w kolbie T75 z 10 mililitrami DPBS. Następnie dodać jeden mililitr 0,25% TE do kolby.
Po inkubacji delikatnie postukać w boki kolby i dodać pięć mililitrów roztworu neutralizującego trypsynę. Następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Zbierz pozostałe komórki z pięcioma mililitrami świeżego EKG i przenieś je do stożkowej rurki.
Teraz odwiruj stożkową probówkę o sile 250 G przez trzy minuty, aby zebrać osad komórkowy. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawieś osad komórek w jednym mililitrze świeżego ECGM i policz komórki. Po ponownym odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 90 mikrolitrach świeżego EKGM.
Następnie na krótko odkurz kanały wydrukowanych naczyń na płycie, aby oczyścić światło. Za pomocą mikropipety delikatnie napełnij kanał 15 mikrolitrami zawiesiny komórek HUVEC. Umieść płytkę płasko w inkubatorze na dwie godziny.
Następnie odwróć płytkę do 180 stopni, utrzymując ją w płaskiej pozycji przez następne dwie godziny. Po czterech godzinach umyj kanał DPBS, aby usunąć nieprzylegające i martwe komórki. Następnie odpipetuj dwa mililitry świeżego ECGM do każdej studzienki.
Umieść dynamiczną kulturę na bujaku pod kątem nachylenia 10 stopni i pięciu obr./min. Komórki HUVEC szybko przyczepiały się i namnażały, pokrywając powierzchnię światła kanałów naczyniowych VOP. Dojrzewanie śródbłonka zweryfikowano za pomocą barwienia immunologicznego dla CD31 pięć dni po wysiewie komórek, co wykazało lokalizację CD31 w połączeniach ścisłych.
