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Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

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A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Harvard Medical School

Rutgers University

DNA &#x8FDE;&#x63A5;&#x9176; IIIalpha &#x8FDB;&#x884C;&#x7684;&#x57FA;&#x5207;&#x9664;&#x4FEE;&#x590D; (BER) &#x548C;&#x5355;&#x94FE;&#x65AD;&#x88C2;&#x7684;&#x6700;&#x540E;&#x7ED3;&#x624E;&#x6B65;&#x4FEE;&#x590D; (&#x6EB6;&#x805A;&#x4E01;&#x82EF;&#x6A61;&#x80F6;) &#x7684; DNA &#x4FEE;&#x590D;&#x673A;&#x5236;&#x3002;&#x5355;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x7EDD;&#x7F18;&#x5C42;&#x6709;&#x65E0;&#x7834;&#x635F;&#x548C;&#x53CC;&#x94FE; DNA&#xFF0C;&#x901A;&#x8FC7;&#x5305;&#x542B;&#x5355;&#x4E00;&#x950C;&#x624B;&#x6307; N &#x7EC8;&#x7AEF;&#x57DF;&#x548C;&#x50AC;&#x5316;&#x5176;&#x4ED6;&#x635F;&#x5BB3;&#x529F;&#x80FD;&#xFF0C;&#x8BA4;&#x8BC6;&#x5230;&#x8FD9;&#x79CD;&#x9176;&#x3002;&#x540E;&#x8005;&#x662F;&#x540C;&#x6E90;&#x8BA4;&#x8BC6;&#x5230;&#x635F;&#x574F;&#x7684; DNA &#x91CC;&#xFF0C;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5728; N &#x603B;&#x7AD9;&#x7684;&#x5176;&#x4ED6;&#x950C;&#x6307; poly(adenosine-ribose) &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x548C;&#x4E09;&#x4E2D;&#x7684;&#x62DF;&#x5357;&#x82A5;&#x5357;&#x82A5;&#x5C3C;&#x514B;&#x9065;&#x611F; DNA 3&#39;-phosphoesterase N &#x7EC8;&#x70B9;&#x7AD9;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x76EE;&#x524D;&#x7684;&#x950C;&#x6307;&#x57DF;&#x7684;&#x4EBA;&#x7C7B; DNA &#x8FDE;&#x63A5;&#x9176; IIIalpha&#xFF0C;&#x624B;&#x6307;&#x4ECE;&#x8FD9;&#x4E00;&#x7EC4;&#x7684;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B21;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x7ED3;&#x6784;&#x3002;&#x5B83;&#x5173;&#x4E4E;&#x7CFB;&#x7956;&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50;&#x795E;&#x7ECF;&#x7CFB;&#x7EDF;-1&#xFF0C;&#x4F46;&#x6709;&#x989D;&#x5916; N &#x7EC8;&#x7AEF;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x7248;-&#x94A2;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x548C; C &#x7EC8;&#x7AEF;&#x963F;&#x5C14;&#x6CD5;&#x87BA;&#x65CB;&#x3002;&#x5316;&#x5B66;&#x4F4D;&#x79FB;&#x6620;&#x5C04;&#x4F7F;&#x7528;&#x542B;&#x5355;&#x7EDE;&#x65AD; DNA &#x914D;&#x4F53;&#x8868;&#x660E; dna &#x8868;&#x9762;&#x7684; DNA &#x8FDE;&#x63A5;&#x9176; IIIalpha &#x950C;&#x6307;&#x662F;&#x5927;&#x4E0D;&#x76F8;&#x540C;&#x7684;&#x795E;&#x7ECF;&#x7CFB;&#x7EDF; 1&#xFF0C;&#x7B26;&#x5408;&#x8FD9;&#x4E00;&#x4E8B;&#x5B9E;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x8BC6;&#x522B; DNA &#x4E2D;&#x975E;&#x5E38;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x3002;DNA &#x7ED1;&#x5B9A;&#x53EF;&#x80FD;&#x4EA7;&#x751F;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x8FDB;&#x884C;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x3002;

&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C; DNA &#x4ECE; DNA &#x8FDE;&#x63A5;&#x9176; IIIalpha &#x7684;&#x950C;&#x6307;&#x57DF;&#x540D;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x3002;

DNA ligase IIIalpha carries out the final ligation step in the base excision repair (BER) and single strand break repair (SSBR) mechanisms of DNA repair. The enzyme recognises single-strand nicks and other damage features in double-stranded DNA, both through the catalytic domain and an N-terminal domain containing a single zinc finger. The latter is homologous to other zinc fingers that recognise damaged DNA, two in the N terminus of poly(adenosine-ribose)polymerase and three in the N terminus of the Arabidopsis thaliana nick-sensing DNA 3'-phosphoesterase. Here, we present the solution structure of the zinc-finger domain of human DNA ligase IIIalpha, the first structure of a finger from this group. It is related to that of the erythroid transcription factor GATA-1, but has an additional N-terminal beta-strand and C-terminal alpha-helix. Chemical shift mapping using a DNA ligand containing a single-stranded break showed that the DNA-binding surface of the DNA-ligase IIIalpha zinc finger is substantially different from that of GATA-1, consistent with the fact that the two proteins recognise very different features in the DNA. Likely implications for DNA binding are discussed.

Solution structure and DNA binding of the zinc-finger domain from DNA ligase IIIalpha.

DNA ligase IIIalpha proc&egrave;de &agrave; l&#39;&eacute;tape finale de la ligature dans la r&eacute;paration d&#39;excision de base (BER) et rupture monocat&eacute;naire de r&eacute;paration de l&#39;ADN, les m&eacute;canismes de r&eacute;paration (SSBR). L&#39;enzyme reconna&icirc;t monocat&eacute;naire pseudos et autres fonctionnalit&eacute;s de dommages dans l&#39;ADN bicat&eacute;naire, que ce soit par le domaine catalytique et un domaine N-terminal contenant un doigt de zinc unique. Ce dernier est homologue aux autres doigts de zinc qui reconnaissent l&#39;ADN endommag&eacute;, deux &agrave; l&#39;extr&eacute;mit&eacute; N terminale de poly(adenosine-ribose) polym&eacute;rase et trois &agrave; l&#39;extr&eacute;mit&eacute; N terminale de l&#39;Arabidopsis thaliana nick d&eacute;tection ADN 3&#39;-phosphoesterase. Nous pr&eacute;sentons ici la structure de la solution du domaine doigt de zinc de ligase d&#39;ADN humain IIIalpha, la premi&egrave;re structure d&#39;un doigt de ce groupe. Elle est li&eacute;e &agrave; celle du facteur de transcription &eacute;rythro&iuml;des GATA-1, mais a un brin b&ecirc;ta suppl&eacute;mentaire N-terminal et C-terminal-h&eacute;lice alpha. Mappage de d&eacute;placement chimique &agrave; l&#39;aide d&#39;un ligand d&#39;ADN contenant une rupture monocat&eacute;naire a montr&eacute; que la surface de liaison &agrave; l&#39;ADN de l&#39;ADN-ligase IIIalpha doigt de zinc est sensiblement diff&eacute;rente de celle de GATA-1, compatible avec le fait que les deux prot&eacute;ines reconnaissent des caract&eacute;ristiques tr&egrave;s diff&eacute;rentes dans l&#39;ADN. Les auteurs discutent les implications possibles pour la liaison de l&#39;ADN.

Structure de solution et DNA binding du domaine de DNA ligase IIIalpha doigt de zinc.

L&#xF6;sung und DNA-Bindung des Zink-Finger-Dom&#xE4;ne von DNA-Ligase IIIalpha.

Ligasi del DNA IIIalpha effettua il passaggio di legatura finale nella base di escissione riparazione (BER) e single strand break repair (SSBR) meccanismi di riparazione del DNA. L&#39;enzima riconosce single-strand nicks e altre caratteristiche di danni nel DNA double-stranded, sia attraverso il dominio catalitico e un dominio N-terminale contenente un singolo zinc finger. Quest&#39;ultimo &egrave; omologato alle altre dita di zinco che riconoscono il DNA danneggiato, due in N terminale della poly(adenosine-ribose) della polimerasi e tre in N terminale di thaliana di Arabidopsis nick-rilevazione del DNA 3&#39;-phosphoesterase. Qui, vi presentiamo la struttura della soluzione del dominio zinc-finger della ligasi del DNA umano IIIalpha, la prima struttura di un dito da questo gruppo. Esso &egrave; legato a quello del fattore di trascrizione eritroidi GATA-1, ma ha un&#39;ulteriore N-terminale beta-strand e alfa-elica C-terminale. Mapping di spostamento chimico utilizzando un ligando di DNA contenente una rottura a singolo filamento ha dimostrato che la superficie della barretta dello zinco ligasi del DNA IIIalpha DNA-binding &egrave; sostanzialmente diversa da quello di GATA-1, coerente con il fatto che le due proteine riconoscono caratteristiche molto differenti nel DNA. Probabili implicazioni per il grippaggio del DNA sono discussi.

Struttura della soluzione e grippaggio del DNA del dominio zinc-finger da ligasi del DNA IIIalpha.

DNA &#x30EA;&#x30AC;&#x30FC;&#x30BC; IIIalpha &#x5869;&#x57FA;&#x9664;&#x53BB;&#x4FEE;&#x5FA9; (BER) &#x3068;&#x5358;&#x9396;&#x5207;&#x65AD;&#x306E;&#x6700;&#x7D42;&#x7684;&#x306A;&#x7D50;&#x7D2E;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7; DNA &#x4FEE;&#x7406;&#x306E;&#x4FEE;&#x7406; (SSBR) &#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x884C;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9175;&#x7D20;&#x3067;&#x306F;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3068;&#x4E8C;&#x672C;&#x9396; DNA &#x306E;&#x4ED6;&#x640D;&#x50B7;&#x6A5F;&#x80FD;&#x89E6;&#x5A92;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x30B8;&#x30F3;&#x30AF;&#x30D5;&#x30A3;&#x30F3;&#x30AC;&#x30FC;&#x3092;&#x542B;&#x3080; N &#x672B;&#x7AEF;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x901A;&#x3058;&#x3066;&#x4E21;&#x65B9;&#x3092;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5F8C;&#x8005;&#x306E;&#x640D;&#x50B7; DNA &#x306F;&#x3001;2 &#x3064;&#x306E; N &#x672B;&#x7AEF;&#x306B;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3059;&#x308B;&#x4ED6;&#x306E;&#x4E9C;&#x925B;&#x306E;&#x6307;&#x306B;&#x76F8;&#x540C;&#x3067;&#x3059; poly(adenosine-ribose) &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068; DNA &#x306E;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF; &#x30BB;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0; &#x30B7;&#x30ED;&#x30A4;&#x30CC;&#x30CA;&#x30BA;&#x30CA;&#x306E; N &#x672B;&#x7AEF; 3 3&#39;-phosphoesterase&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E; DNA &#x30EA;&#x30AC;&#x30FC;&#x30BC; IIIalpha&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30B0;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x304B;&#x3089;&#x6307;&#x306E;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x30B8;&#x30F3;&#x30AF;&#x30D5;&#x30A3;&#x30F3;&#x30AC;&#x30FC; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x63D0;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x8D64;&#x82BD;&#x7403;&#x7CFB;&#x8EE2;&#x5199;&#x56E0;&#x5B50; GATA 1 &#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3067;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x8FFD;&#x52A0; N &#x672B;&#x7AEF; &beta;-&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C9;&#x3068; C &#x672B;&#x7AEF; &alpha; &#x3078;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;&#x4F11;&#x61A9;&#x3092;&#x542B;&#x3080; DNA &#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x5316;&#x5B66;&#x30B7;&#x30D5;&#x30C8; &#x30DE;&#x30C3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0; DNA &#x30EA;&#x30AC;&#x30FC;&#x30BC; IIIalpha &#x4E9C;&#x925B;&#x30D5;&#x30A3;&#x30F3;&#x30AC;&#x30FC;&#x306E; DNA &#x7D50;&#x5408;&#x8868;&#x9762;&#x306F;&#x6F5F; 1&#x3001;2 &#x3064;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E; DNA &#x3092;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x4E8B;&#x5B9F;&#x3068;&#x77DB;&#x76FE;&#x306E;&#x5B9F;&#x8CEA;&#x7684;&#x306B;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;DNA &#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x9AD8;&#x3044;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3068; DNA &#x306E;&#x7D50;&#x5408; DNA &#x30EA;&#x30AC;&#x30FC;&#x30BC; IIIalpha &#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x4E9C;&#x925B;&#x30D5;&#x30A3;&#x30F3;&#x30AC;&#x30FC; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x3002;

DNA &#xB9AC;&#xAC00; IIIalpha DNA &#xC218;&#xB9AC; &#xC218;&#xB9AC; (SSBR) &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC808;&#xB2E8; &#xC218;&#xB9AC; (BER) &#xBC0F; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; &#xBE0C;&#xB808;&#xC774;&#xD06C;&#xC758; &#xCD5C;&#xC885; &#xACB0; &#xCC30; &#xB2E8;&#xACC4;&#xB97C; &#xC218;&#xD589;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD6A8;&#xC18C;&#xB294; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; &#xB2C9;&#xC2A4; &#xBC0F; &#xCD09;&#xB9E4; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC544;&#xC5F0; &#xC190;&#xAC00;&#xB77D;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; N &#xB9E8;&#xB05D; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xD1B5;&#xD574; &#xBAA8;&#xB450; &#xC774;&#xC911; &#xAC00;&#xB2E5; DNA&#xC758; &#xC190;&#xC0C1; &#xAE30;&#xB2A5; &#xB2E4;&#xB978; &#xC778;&#xC2DD; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xD6C4;&#xC790;&#xB294; &#xC190;&#xC0C1; &#xB41C; DNA&#xC758; N &#xB9D0;&#xB2E8;&#xC5D0; 2 &#xAC1C;&#xB97C; &#xC778;&#xC2DD; &#xD558;&#xB294; &#xC544;&#xC5F0; &#xC190;&#xAC00;&#xB77D; &#xB2E4;&#xB978; &#xB3D9;&#xC885; poly(adenosine-ribose) &#xD6A8;&#xC18C;&#xC640;&#xB294; Arabidopsis thaliana &#xB2C9; &#xAC10;&#xC9C0; DNA 3&#39;-phosphoesterase&#xC758; N &#xB9D0;&#xB2E8;&#xC5D0; &#xC138;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; DNA &#xB9AC;&#xAC00; IIIalpha,&#xC774; &#xADF8;&#xB8F9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC190;&#xAC00;&#xB77D;&#xC758; &#xCCAB; &#xBC88;&#xC9F8; &#xAD6C;&#xC870;&#xC758; &#xC544;&#xC5F0; &#xC190;&#xAC00;&#xB77D; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158; &#xAD6C;&#xC870; &#xC81C;&#xC2DC;. Erythroid &#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790; GATA 1&#xC758; &#xAD00;&#xB828;&#xB9CC; &#xCD94;&#xAC00; N &#xB9E8;&#xB05D; beta-&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB79C;&#xB4DC;&#xC640; C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC54C;&#xD30C;-&#xD5EC;&#xB9AD;&#xC2A4;. &#xD654;&#xD559; &#xBCC0;&#xD654; &#xB9E4;&#xD551;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; &#xBE0C;&#xB808;&#xC774;&#xD06C; DNA &#xB9AC;&#xAC04;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; DNA &#xB9AC;&#xAC00; IIIalpha &#xC544;&#xC5F0; &#xC190;&#xAC00;&#xB77D; DNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD45C;&#xBA74; GATA-1, &#xB450; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; DNA&#xC5D0; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC778;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xC0AC;&#xC2E4;&#xC640; &#xC77C;&#xCE58;&#xC758; &#xC2E4;&#xC9C8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xB978; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC8FC;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xC758;&#xBBF8; DNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0; &#xB300;&#xD574; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC194;&#xB8E8;&#xC158; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; DNA &#xB9AC;&#xAC00; Iiialpha&#xC5D0;&#xC11C; &#xC544;&#xC5F0; &#xC190;&#xAC00;&#xB77D; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; DNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529;.

ADN ligasa IIIalpha lleva a cabo el paso de la final de la ligadura en la reparaci&oacute;n de la supresi&oacute;n de base (BER) y rotura de la hebra reparaci&oacute;n (SSBR) mecanismos de reparaci&oacute;n del ADN. La enzima reconoce monocatenarias mellas y otras caracter&iacute;sticas de da&ntilde;o en el ADN de doble hebra, tanto a trav&eacute;s del dominio catal&iacute;tico y un dominio N-terminal que contiene un solo zinc finger. Este &uacute;ltimo es hom&oacute;logo a otros dedos de cinc que reconocen el ADN da&ntilde;ado, dos en la terminal N de poly(adenosine-ribose) polimerasa y tres en el extremo N terminal de la Arabidopsis thaliana detecci&oacute;n nick ADN 3&#39;-phosphoesterase. Aqu&iacute;, presentamos la estructura de la soluci&oacute;n del dominio zinc-finger de ligasa de ADN humano IIIalpha, la primera estructura de un dedo de este grupo. Que se relaciona con la del factor de transcripci&oacute;n eritroides GATA-1, pero tiene un adicional beta-strand del N-terminal y c-terminal alfa-h&eacute;lice. Asignaci&oacute;n de cambio qu&iacute;mico mediante un ligando de ADN que contiene un descanso monocatenario demostr&oacute; que la superficie de uni&oacute;n al ADN de la DNA-ligasa IIIalpha zinc finger es sustancialmente diferente de la de GATA-1, consistente con el hecho de que las dos prote&iacute;nas reconocen caracter&iacute;sticas muy diferentes en el ADN. Probables para el atascamiento de la DNA se discuten las implicaciones.

Soluci&oacute;n estructura y enlace de ADN del dominio de zinc-finger de ADN ligasa IIIalpha.

Udk&#xFF0C;&#x7F16;&#x7801;&#x5C3F;&#x82F7;/&#x80DE;&#x82F7;&#x6FC0;&#x9176;&#x3001; &#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x8FC7;&#x5EA6;&#x8868;&#x8FBE;&#x5E72;&#x6270; T7 &#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x751F;&#x957F;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x5C55;&#x793A; udk &#x8868;&#x8FBE; T7 &#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x751F;&#x957F;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x4F5C;&#x7528;&#x53EF;&#x4EE5;&#x514B;&#x670D;&#x7531;&#x4E3B;&#x673A; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;2&#x3001; &#x5176;&#x4EA7;&#x54C1;&#x6291;&#x5236;&#x5BBF;&#x4E3B; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x3001; &#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x8FC7;&#x5EA6;&#x8868;&#x8FBE;&#x8FD8;&#x539F; T7 &#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x751F;&#x957F;&#x91CF; udk &#x7684;&#x4E3B;&#x673A;&#x4E0A;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x5229;&#x798F;&#x5E73;&#x3001; &#x4E3B;&#x673A; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x6062;&#x590D;&#x7A81;&#x53D1;&#x5927;&#x5C0F;&#x7684; T7 &#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x6B63;&#x5E38; udk &#x8D85;&#x91CF;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x4E3B;&#x673A;&#x4E0A;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#xFF0C;&#x540C;&#x610F;&#x514B;&#x670D;&#x6240;&#x4EA7;&#x751F;&#x7684; udk &#x8FC7;&#x5EA6;&#x8868;&#x8FBE;&#x6291;&#x5236;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x83B7;&#x5F97;&#x6210;&#x957F;&#x5BF9; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0; 2 &#x86CB;&#x767D;&#x548C;&#x514B;&#x670D;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x4F5C;&#x7528;&#x6709;&#x6297;&#x836F;&#x6027;&#x57FA;&#x56E0; 2 &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7F3A;&#x4E4F;&#x83B7;&#x5F97;&#x6210;&#x957F;&#x5728;&#x4E3B;&#x673A;&#x4E0A;&#x7684; overexpress udk &#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x7684;&#x4E3B;&#x673A;&#x4E0A;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x3002;&#x6D88;&#x9664;&#x6216;&#x524A;&#x5F31;&#x5F3A;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x7684;&#x4E3B;&#x673A; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; T7 DNA &#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x548C;&#x7A81;&#x53D8;&#x57FA;&#x56E0; T7 3.5 &#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x53CA;&#x5176;&#x4E0E; T7 RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x8FD8;&#x51CF;&#x5C11; T7 &#x589E;&#x957F;&#x7531;&#x5BBF;&#x4E3B; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x7684;&#x5E72;&#x6270;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E3B;&#x673A; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x6291;&#x5236;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x8981;&#x6C42;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x4E00;&#x822C;&#x6A21;&#x578B;&#x3002;

&#x4E0D;&#x8DB3;&#x7684;&#x4E3B;&#x673A; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x4F5C;&#x7528;&#x9650;&#x5236;&#x8D85;&#x91CF;&#x8868;&#x8FBE; udk &#x7684;&#x4E3B;&#x673A;&#x4E0A;&#x7684; T7 &#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x751F;&#x957F;&#x3002;

Overexpression of udk, an Escherichia coli gene encoding a uridine/cytidine kinase, interferes with T7 bacteriophage growth. We show here that inhibition of T7 phage growth by udk overexpression can be overcome by inhibition of host RNA polymerase. Overexpression of gene 2, whose product inhibits host RNA polymerase, restores T7 phage growth on hosts overexpressing udk. In addition, rifampicin, an inhibitor of host RNA polymerase, restores the burst size of T7 phage on udk-overexpressing hosts to normal. In agreement with these findings, suppressor mutants that overcome the inhibition arising from udk overexpression gain the ability to grow on hosts that are resistant to inhibition of RNA polymerase by gene 2 protein, and suppressor mutants that overcome a lack of gene 2 protein gain the ability to grow on hosts that overexpress udk. Mutations that eliminate or weaken strong promoters for host RNA polymerase in T7 DNA, and mutations in T7 gene 3.5 that affect its interaction with T7 RNA polymerase, also reduce the interference with T7 growth by host RNA polymerase. We propose a general model for the requirement of host RNA polymerase inhibition.

Inadequate inhibition of host RNA polymerase restricts T7 bacteriophage growth on hosts overexpressing udk.

La surexpression d&#39;udk, un g&egrave;ne de Escherichia coli codant une kinase uridine/cytidine, interf&egrave;re avec la croissance du bact&eacute;riophage T7. Nous montrons ici que l&#39;inhibition de la croissance bact&eacute;riophage T7 par overexpression udk peut &ecirc;tre surmont&eacute;e par l&#39;inhibition de l&#39;ARN polym&eacute;rase de l&#39;h&ocirc;te. La surexpression du g&egrave;ne 2, dont le produit inhibe l&#39;h&ocirc;te de l&#39;ARN polym&eacute;rase, restaure la croissance bact&eacute;riophage T7 sur h&ocirc;tes surexprimant udk. En outre, la rifampicine, un inhibiteur de l&#39;h&ocirc;te de l&#39;ARN polym&eacute;rase, restaure la taille de l&#39;&eacute;clatement du bact&eacute;riophage T7 sur udk-surexprimant les h&ocirc;tes &agrave; la normale. En accord avec ces conclusions, les mutants suppresseur surmonter l&#39;inhibition d&eacute;coulant de la surexpression d&#39;udk acqui&egrave;rent la capacit&eacute; de cro&icirc;tre sur les h&ocirc;tes que sont r&eacute;sistantes &agrave; l&#39;inhibition de l&#39;ARN polym&eacute;rase de g&egrave;ne 2 prot&eacute;ines et mutants suppresseur qui surmontent un manque de prot&eacute;ine du g&egrave;ne 2 acqui&egrave;rent la capacit&eacute; de cro&icirc;tre sur des h&ocirc;tes qu&#39;udk overexpress. Mutations qui &eacute;liminent ou affaiblissent les promoteurs forts pour l&#39;h&ocirc;te de l&#39;ARN polym&eacute;rase T7 ADN et mutations de g&egrave;ne T7 3,5 qui affectent son interaction avec l&#39;ARN polym&eacute;rase T7, &eacute;galement r&eacute;duisent l&#39;interf&eacute;rence avec la croissance de l&#39;h&ocirc;te de l&#39;ARN polym&eacute;rase T7. Nous proposons un mod&egrave;le g&eacute;n&eacute;ral pour l&#39;exigence de l&#39;inhibition de l&#39;ARN polym&eacute;rase d&#39;accueil.

Inhibition insuffisante de l&#39;ARN polym&eacute;rase d&#39;accueil limite la croissance bact&eacute;riophage T7 sur h&ocirc;tes surexprimant udk.

Eine &Uuml;berexpression von Udk, ein Escherichia-coli-gen f&uuml;r eine Uridin/Cytidin-Kinase, behindert T7 Bakteriophage Wachstum. Wir zeigen hier, dass die Hemmung der T7 Phage Wachstum von Udk &Uuml;berexpression durch Hemmung der RNS-Polymerase Host &uuml;berwunden werden kann. Eine &Uuml;berexpression von Gen 2, dessen Produkt Host der RNS-Polymerase hemmt, stellt T7 Phage Wachstum auf Hosts &uuml;berexprimierenden Udk. Dar&uuml;ber hinaus stellt Rifampicin, ein Inhibitor der Host der RNS-Polymerase, die Burst-Gr&ouml;&szlig;e von T7 Phage auf Udk-&uuml;berexprimierenden Hosts auf Normal. Im Einvernehmen mit diesen Ergebnissen k&ouml;nnen Tumorsuppressor-Mutanten, die die Hemmung aus Udk &Uuml;berexpression &uuml;berwunden, auf Hosts zu wachsen, sind best&auml;ndig gegen Hemmung der RNA-Polymerase von Gen 2 Eiwei&szlig; und Tumorsuppressor-Mutanten, die &Uuml;berwindung mangelnder Gen 2 Protein die F&auml;higkeit auf Hosts dieser HER2-Udk wachsen gewinnen. Mutationen, die zu beseitigen oder starke F&ouml;rderern f&uuml;r Host-RNS-Polymerase in T7-DNA zu schw&auml;chen und Mutationen im T7-Gen 3.5, die die Interaktion mit T7-RNA-Polymerase beeinflussen reduziert auch die St&ouml;rungen mit T7 Wachstum von Host der RNS-Polymerase. Wir schlagen ein allgemeines Modell f&uuml;r die Anforderung des Hosts Hemmung der RNS-Polymerase.

Unzureichende Hemmung der Host der RNS-Polymerase schr&auml;nkt T7 Bakteriophage Wachstum auf Hosts &uuml;berexprimierenden Udk.

Sovraespressione di udk, un gene che Escherichia coli codifica per una chinasi citidina/uridina, interferisce con la crescita del batteriofago T7. Mostriamo qui che l&#39;inibizione della crescita fago T7 di udk sovraespressione pu&ograve; essere superata tramite inibizione di host RNA polimerasi. Iperespressione del gene 2, il cui prodotto inibisce la RNA polimerasi ospite, ripristina la crescita fago T7 su host con sovraesprimono relativa udk. Inoltre, la rifampicina, un inibitore della polimerasi del RNA host, ripristina la dimensione di burst del fago T7 su host con sovraesprimono udk relativa alla normalit&agrave;. D&#39;accordo con questi risultati, mutanti soppressore che superare l&#39;inibizione derivante dalla sovraespressione di udk acquisire la capacit&agrave; di crescere su host che sono resistenti alla inibizione della RNA polimerasi di gene 2 proteine e mutanti soppressore che superare una carenza di proteine gene 2 acquisire la capacit&agrave; di crescere su host che udk overexpress. Le mutazioni che eliminano o indeboliscono forti promotori per host RNA polimerasi T7 del DNA e mutazioni nel gene T7 3.5 che influiscono sulla sua interazione con T7 RNA polimerasi, anche riducono l&#39;interferenza con una crescita dall&#39;host di RNA polimerasi T7. Vi proponiamo un modello generale per il requisito dell&#39;host inibizione della RNA polimerasi.

Inadeguata inibizione della RNA polimerasi host limita la crescita del batteriofago T7 su host con sovraesprimono relativa udk.

Udk&#x3001;&#x30A6;&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;/&#x30B7;&#x30C1;&#x30B8;&#x30F3; &#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x3001;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x904E;&#x5270;&#x767A;&#x73FE;&#x306F;&#x3001;T7 &#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x306E;&#x6210;&#x9577;&#x3092;&#x59A8;&#x3052;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x79C1;&#x9054;&#x306F;&#x3053;&#x3053; udk &#x904E;&#x5270;&#x767A;&#x73FE;&#x306B;&#x3088;&#x308B; T7 &#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x306E;&#x5897;&#x6B96;&#x6291;&#x5236;&#x306B;&#x95A2;&#x3059;&#x308B;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x514B;&#x670D;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x904E;&#x5270;&#x767A;&#x73FE;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x305D;&#x306E;&#x88FD;&#x54C1;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3092;&#x963B;&#x5BB3;&#x3059;&#x308B;&#x3001;2 &#x306E; T7 &#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x6210;&#x9577; udk &#x904E;&#x5270;&#x306E;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x306B;&#x5FA9;&#x5143;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x30EA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30F3;&#x30D4;&#x30B7;&#x30F3;&#x3001;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264; T7 &#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8; udk &#x904E;&#x5270;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x306B;&#x6B63;&#x5E38;&#x306B;&#x4E0A;&#x306E;&#x30D0;&#x30FC;&#x30B9;&#x30C8; &#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x3092;&#x5FA9;&#x5143;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x6240;&#x898B;&#x3068;&#x4E00;&#x81F4;&#x3057;&#x3066; udk &#x904E;&#x5270;&#x767A;&#x73FE;&#x304B;&#x3089;&#x751F;&#x3058;&#x308B;&#x963B;&#x5BB3;&#x3092;&#x514B;&#x670D;&#x30B5;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30B5;&#x30FC;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x4E0A;&#x306E;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50; 2 &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3068;&#x514B;&#x670D;&#x30B5;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30B5;&#x30FC;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306B;&#x3088;&#x308B; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x306B;&#x8010;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50; 2 &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x6B20;&#x4E4F;&#x4E0A;&#x306E;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x306F;&#x904E;&#x5270; udk &#x6210;&#x9577;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x5F97;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x6210;&#x9577;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x5F97;&#x308B;&#x3002;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x6392;&#x9664;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8; T7 &#x306E; DNA&#x3001;RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x5F31;&#x3081;&#x308B;&#x3068; T7 RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53CA;&#x307C;&#x3059; T7 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50; 3.5 &#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x3082;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306B;&#x3088;&#x308B; T7 &#x6210;&#x9577;&#x3068;&#x306E;&#x5E72;&#x6E09;&#x3092;&#x6E1B;&#x3089;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x963B;&#x5BB3;&#x306E;&#x8981;&#x4EF6;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x4E0D;&#x5341;&#x5206;&#x306A;&#x963B;&#x5BB3; T7 &#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x6210;&#x9577; udk &#x904E;&#x5270;&#x306E;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x306B;&#x5236;&#x9650;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

Udk, uridine/cytidine &#xB2C8; &#xC778;&#xCF54;&#xB529; Escherichia&#xC758; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; overexpression T7 &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0; &#xC131;&#xC7A5;&#xC744; &#xBC29;&#xD574; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0;&#xC11C; udk overexpression T7 &#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C; &#xC131;&#xC7A5;&#xC758; &#xC800;&#xD574; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xC800;&#xD574;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xADF9;&#xBCF5;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC81C;&#xD488; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB97C; &#xC5B5;&#xC81C;, 2 overexpression T7 &#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C; &#xC131;&#xC7A5; udk overexpressing &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCF5;&#xC6D0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xB9AC; &#xD31C; &#xD53C;&#xC2E0;, &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; T7 &#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C; &#xC815;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; udk overexpressing &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xBC84;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD06C;&#xAE30;&#xB97C; &#xBCF5;&#xC6D0;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC;&#xC640; udk overexpression&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xC800;&#xD574;&#xB97C; &#xADF9;&#xBCF5; &#xC5B5;&#xC555; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; 2 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xACFC; &#xADF9;&#xBCF5; &#xC5B5;&#xC555; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC758;&#xD574; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xC800;&#xD574;&#xC5D0; &#xAC15;&#xD55C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; 2 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xBD80;&#xC871; &#xC5BB;&#xC744; &#xB2A5;&#xB825;&#xC744; overexpress udk &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xC131;&#xC7A5;&#xC5D0; &#xC131;&#xC7A5; &#xD558;&#xB294; &#xB2A5;&#xB825;&#xC744; &#xC5BB;&#xC744;. &#xBCC0;&#xC774; &#xC81C;&#xAC70; &#xB610;&#xB294; &#xC57D;&#xD654; T7 DNA&#xC5D0; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC15;&#xD55C; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xBC0F; T7 RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC640;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xB294; T7 &#xC720;&#xC804;&#xC790; 3.5&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; T7 &#xC131;&#xC7A5; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xAC04;&#xC12D;&#xC744; &#xC904;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC800;&#xD574;&#xC758; &#xC694;&#xAD6C; &#xC0AC;&#xD56D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC77C;&#xBC18; &#xBAA8;&#xB378;&#xC744; &#xC81C;&#xC548;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xBD88; &#xCDA9; &#xBD84; &#xD55C; &#xC800;&#xD574; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; udk overexpressing T7 &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0; &#xC131;&#xC7A5;&#xC744; &#xC81C;&#xD55C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Sobreexpresi&oacute;n de udk, un gen de Escherichia coli codificaci&oacute;n una quinasa de Uridina/citidina, interfiere con el crecimiento de bacteri&oacute;fago T7. Aqu&iacute; demostramos que se puede superar la inhibici&oacute;n del crecimiento de Fago T7 por la sobreexpresi&oacute;n de udk por inhibici&oacute;n de la RNA polimerasa de anfitri&oacute;n. Sobreexpresi&oacute;n del gen 2, cuyo producto inhibe la polimerasa del RNA del anfitri&oacute;n, restaura crecimiento de Fago T7 en hosts overexpressing udk. Adem&aacute;s, rifampicina, un inhibidor de la polimerasa del RNA del anfitri&oacute;n, restaura el tama&ntilde;o de r&aacute;faga de Fago T7 en udk-overexpressing hosts a la normalidad. De acuerdo con estos resultados, mutantes supresor que superar la inhibici&oacute;n de sobreexpresi&oacute;n de udk ganan la habilidad de crecer en los hosts que son resistentes a la inhibici&oacute;n de la RNA polimerasa por prote&iacute;nas del gen 2 y mutantes supresor que superar una carencia de la prote&iacute;na del gen 2 ganar la habilidad de crecer en los hosts sobrexpresan udk. Las mutaciones que eliminan o debilitan fuertes promotores de anfitri&oacute;n RNA polimerasa de T7 DNA y mutaciones en el gene de T7 3.5 que afectan su interacci&oacute;n con T7 ARN polimerasa, tambi&eacute;n reducen la interferencia con el crecimiento anfitri&oacute;n ARN polimerasa T7. Proponemos un modelo general para el requisito de inhibici&oacute;n de la RNA polimerasa del hu&eacute;sped.

Inadecuada inhibici&oacute;n de host ARN polimerasa restringe el crecimiento de bacteri&oacute;fago T7 en hosts overexpressing udk.

&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53; T7 5 &#x5C06;&#x7F16;&#x7801; DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; (5 &#x57FA;&#x56E0;&#xFF09; &#x8D1F;&#x8D23;&#x7684;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53; DNA &#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x3002;5 &#x57FA;&#x56E0; polymerizes &#x4E0E;&#x4F4E; processivity&#xFF0C;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x540E;&#x7684; 1 &#x5230; 50 &#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7EB3;&#x5165;&#x907F;&#x514D;&#x8BEF;&#x5165;&#x6B67;&#x9014;&#x3002;&#x786B;&#x6C27;&#x8FD8;&#x86CB;&#x767D; (trx) &#x81F4;&#x75C5;&#x6027;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x7684;&#x7D27;&#x5BC6;&#x7ED1;&#x5B9A; &#xFF08;&#x79D1;&#x5A01;&#x7279;&#x7B2C;&#x7EB3;&#x5C14; = 5 nM&#xFF09; 5 &#x57FA;&#x56E0;&#x548C;&#x589E;&#x52A0; processivity &#x7684;&#x62C7;&#x6307;&#x5B50;&#x57DF;&#x4E2D;&#x7684;&#x72EC;&#x7279;&#x90E8;&#x5206;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x63A2;&#x6D4B;&#x5728; processivity &#x4E2D;&#x589E;&#x52A0;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x57FA;&#x7840;&#x3002;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86;&#x9176;&#x7684;&#x6D3B;&#x6027;&#x548C; processivity &#x7387; 5 &#x57FA;&#x56E0;&#x548C; 5 &#x57FA;&#x56E0;/trx &#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x5DEE;&#x5F02;&#x3002;&#x7ED3;&#x5408;&#x6838;&#x9178;&#x9176;&#x8DB3;&#x8FF9;&#x7684;&#x5C0F;&#x89D2; x &#x5C04;&#x7EBF;&#x6563;&#x5C04;&#x7814;&#x7A76;&#x63ED;&#x793A;&#x4E24;&#x79CD;&#x6784;&#x8C61;&#x7684; 5 &#x57FA;&#x56E0;&#xFF0C;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5728;&#x81EA;&#x7531;&#x7684;&#x72B6;&#x6001;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x4E00;&#x4E2A;&#x540E;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230; trx&#x3002;DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x548C; DNA &#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x7684; DNA &#x7ED3;&#x5408;&#x88C2;&#x7F1D;&#x7684;&#x6BD4;&#x8F83;&#x5206;&#x6790;&#x663E;&#x793A;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x8868;&#x9762;&#x5305;&#x542B;&#x66F4;&#x591A;&#x6BD4;&#x5176;&#x4ED6; DNA &#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x758F;&#x6C34;&#x6027;&#x6B8B;&#x7559;&#x3002;&#x5728; DNA &#x4E0A;&#x9AD8;&#x6548;&#x6ED1; 5 &#x57FA;&#x56E0;/trx &#x5141;&#x8BB8;&#x758F;&#x6C34;&#x548C;&#x5E26;&#x7535;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7AD9;&#x70B9;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x5E73;&#x8861;&#x7684;&#x7EC4;&#x6210;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63D0;&#x51FA; trx &#x5F15;&#x8D77;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x53D8;&#x5316; 5 &#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x52A0;&#x5F3A; processivity&#xFF0C;&#x589E;&#x52A0;&#x7684; 5 &#x57FA;&#x56E0;&#x4E0E; DNA &#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x6A21;&#x5F0F;&#x3002;

&#x566C;&#x83CC;&#x4F53; T7 DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x548C;&#x5176; processivity &#x56E0;&#x5B50;&#xFF0C;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x786B;&#x6C27;&#x8FD8;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x3002;

Gene 5 of bacteriophage T7 encodes a DNA polymerase (gp5) responsible for the replication of the phage DNA. Gp5 polymerizes nucleotides with low processivity, dissociating after the incorporation of 1 to 50 nucleotides. Thioredoxin (trx) of Escherichia coli binds tightly (Kd = 5 nM) to a unique segment in the thumb subdomain of gp5 and increases processivity. We have probed the molecular basis for the increase in processivity. A single-molecule experiment reveals differences in rates of enzymatic activity and processivity between gp5 and gp5/trx. Small angle X-ray scattering studies combined with nuclease footprinting reveal two conformations of gp5, one in the free state and one upon binding to trx. Comparative analysis of the DNA binding clefts of DNA polymerases and DNA binding proteins show that the binding surface contains more hydrophobic residues than other DNA binding proteins. The balanced composition between hydrophobic and charged residues of the binding site allows for efficient sliding of gp5/trx on the DNA. We propose a model for trx-induced conformational changes in gp5 that enhance the processivity by increasing the interaction of gp5 with DNA.

Conformational dynamics of bacteriophage T7 DNA polymerase and its processivity factor, Escherichia coli thioredoxin.

5 Du g&egrave;ne du bact&eacute;riophage T7 encode une ADN polym&eacute;rase (gp5) responsable de la r&eacute;plication de l&#39;ADN du phage. GP5 polym&eacute;rise nucl&eacute;otides avec faible processivit&eacute;, dissociant apr&egrave;s l&#39;incorporation de nucl&eacute;otides de 1 &agrave; 50. Thioredoxin (trx) d&#39;Escherichia coli se lie &eacute;troitement (Kd = 5 nM) &agrave; un segment unique dans le sous-domaine de pouce de la processivit&eacute; gp5 et augmentations. Nous avons sond&eacute; les bases mol&eacute;culaires de l&#39;augmentation de la processivit&eacute;. Une mol&eacute;cule unique exp&eacute;rience r&eacute;v&egrave;le des diff&eacute;rences dans les taux d&#39;activit&eacute; enzymatique et processivit&eacute; gp5 et gp5/trx. &Eacute;tudes de diffusion des rayons x petit angle combin&eacute;s avec l&#39;empreinte de la nucl&eacute;ase r&eacute;v&egrave;lent deux conformations de gp5, un &agrave; l&#39;&Eacute;tat libre et l&#39;autre lors de la liaison de trx. Analyse comparative des fentes de liaison ADN polym&eacute;rases d&#39;ADN et les prot&eacute;ines liant l&#39;ADN montrent que la surface de liaison contienne les r&eacute;sidus hydrophobes plus que les autres prot&eacute;ines de liaison de l&#39;ADN. La composition &eacute;quilibr&eacute;e entre les r&eacute;sidus hydrophobes et charg&eacute;s du site de fixation permet de glissement efficace de gp5/trx sur l&#39;ADN. Nous proposons un mod&egrave;le pour induite par le trx changements conformationnels dans gp5 qui am&eacute;liorent la processivit&eacute; en augmentant l&#39;interaction du gp5 avec l&#39;ADN.

Dynamique conformationnelle du bact&eacute;riophage T7 DNA polym&eacute;rase et son facteur processivit&eacute;, Escherichia coli thioredoxin.

Gen 5 von Bakteriophage T7 codiert eine DNA-Polymerase (gp5) verantwortlich f&uuml;r die Replikation von der Phagen-DNA. Gp5 polymerisiert Nukleotide mit niedrigen Processivity, man nach der Aufnahme von 1 bis 50 Nukleotide distanziert. Thioredoxin (Trx) von Escherichia coli bindet fest (Kd = 5 nM) mit einem einzigartigen Segment in der Daumen-Subdomain von gp5 und Erh&ouml;hungen Processivity. Wir haben die molekulare Ursache f&uuml;r die Zunahme der Processivity sondiert. Eine Einzelmolek&uuml;l-Experiment zeigt Unterschiede in der Enzymaktivit&auml;t und Processivity gp5 und gp5/Trx. Kleine Gekr&ouml;pfte R&ouml;ntgen Streuung Studien kombiniert mit Nuklease Fu&szlig;abdruck zeigen zwei Konformationen von gp5, in den Freistaat und auf Bindung an Trx. Vergleichende Analyse der DNA-Bindung-Risse der DNA-Polymerasen und DNA-bindende Proteine zeigen, dass die Bindung-Oberfl&auml;che mehr hydrophoben R&uuml;ckst&auml;nden als andere DNA-bindende Proteine enth&auml;lt. Die ausgewogene Zusammensetzung zwischen hydrophoben und aufgeladenen R&uuml;ckst&auml;nde die Bindungsstelle erm&ouml;glicht effiziente Gleiten der gp5/Trx auf der DNA. Wir schlagen ein Modell f&uuml;r Trx-induzierte Konformationsver&auml;nderungen in gp5, die die Processivity verbessern durch Erh&ouml;hung der Wechselwirkung von gp5 mit DNA.

Konformations&auml;nderungen Dynamik der Bakteriophage T7-DNA-Polymerase und seine Processivity Faktor, Escherichia coli Thioredoxin.

5 Gene del batteriofago T7 codifica per una DNA polimerasi (gp5) responsabile per la replicazione del DNA del fago. Gp5 polimerizza nucleotidi con bassa processivity, dissociando dopo l&#39;incorporazione di 1 a 50 nucleotidi. Tioredossina (trx) di Escherichia coli si lega saldamente (Kd = 5 nM) ad un unico segmento nel sottodominio pollice di processivity gp5 e aumenti. Noi abbiamo sondato le basi molecolari per l&#39;aumento di processivity. Un esperimento di singola molecola rivela differenze nei tassi di attivit&agrave; enzimatica e processivity gp5 e gp5/trx. Piccolo angolo x-ray scattering studi combinati con dell&#39;impronta della nucleasi rivelano due conformazioni gp5, uno allo stato libero e uno sull&#39;associazione di trx. Analisi comparativa delle fessure DNA binding della polimerasi del DNA e proteine leganti il DNA mostrano che la superficie di associazione contiene pi&ugrave; idrofobici residui di altre proteine leganti il DNA. La composizione equilibrata tra residui idrofobi e caricati del sito Associazione permette di scorrimento efficiente di gp5/trx sul DNA. Vi proponiamo un modello per i cambiamenti conformazionali trx-indotta in gp5 che migliorano il processivity aumentando l&#39;interazione di gp5 con DNA.

Conformazionale dinamica del batteriofago T7 DNA polimerasi ed il relativo fattore di processivity, Escherichia coli tioredossina.

&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50; 5 &#x306E;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8; T7 &#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8; DNA &#x306E;&#x8907;&#x88FD;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8CAC;&#x4EFB;&#x3042;&#x308B; DNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; (gp5 &#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;) &#x3092;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;Gp5 &#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB; 1 &#x306B; 50 &#x306E;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x6CD5;&#x4EBA;&#x5316;&#x5F8C;&#x306E;&#x89E3;&#x96E2;&#x4F4E;&#x30B9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x30AF;&#x3068;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x91CD;&#x5408;&#x3055;&#x305B;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C1;&#x30AA;&#x30EC;&#x30C9;&#x30AD;&#x30B7;&#x30F3; (trx) &#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x5BC6; (Kd = 5 nM) &#x3092; gp5 &#x3068;&#x5897;&#x52A0;&#x30B9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x30AF;&#x306E;&#x89AA;&#x6307;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3067;&#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x306A;&#x30BB;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x3002;&#x30B9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x30AF;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x57FA;&#x76E4;&#x3092;&#x7CBE;&#x67FB;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x5B9F;&#x9A13; gp5 &#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;&#x3068; gp5 &#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;/trx &#x9175;&#x7D20;&#x6D3B;&#x6027;&#x3068;&#x30B9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x30AF;&#x7387;&#x306E;&#x9055;&#x3044;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x30D5;&#x30C3;&#x30C8; &#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30C8;&#x3067;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x308B;&#x5C0F;&#x89D2; x &#x7DDA;&#x6563;&#x4E71;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x7814;&#x7A76;&#x7121;&#x6599;&#x72B6;&#x614B;&#x3068;&#x7D50;&#x5408;&#x306B; trx &#x306E; gp5 &#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;&#x306E; 2 &#x3064;&#x306E;&#x7ACB;&#x4F53;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;DNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068; DNA &#x7D50;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E; DNA &#x7D50;&#x5408;&#x88C2;&#x3051;&#x76EE;&#x306E;&#x6BD4;&#x8F03;&#x5206;&#x6790;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x7D50;&#x5408;&#x8868;&#x9762;&#x306B;&#x306F;&#x4ED6; DNA &#x7D50;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3088;&#x308A;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x306E;&#x758E;&#x6C34;&#x6027;&#x6B8B;&#x57FA;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x758E;&#x6C34;&#x6027;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x8377;&#x96FB;&#x6B8B;&#x57FA;&#x7D50;&#x5408;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x30D0;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;&#x3068;&#x308C;&#x305F;&#x7D44;&#x6210;&#x52B9;&#x7387;&#x7684; gp5 &#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;/trx &#x306E; DNA &#x4E0A;&#x306E;&#x6ED1;&#x308A;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;Gp5 DNA &#x3068;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x5897;&#x3084;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x30B9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x30AF;&#x3092;&#x9AD8;&#x3081;&#x308B; trx &#x8A98;&#x8D77;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DB;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x5909;&#x5316; gp5 &#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;&#x5185;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3059;&#x308B;.

&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8; T7 &#x306E; DNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x30B9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x30AF;&#x7387;&#x3001;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x30C1;&#x30AA;&#x30EC;&#x30C9;&#x30AD;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DB;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x3002;

T7 &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790; 5 DNA &#xD6A8;&#xC18C; (gp5) &#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C; DNA&#xC758; &#xBCF5;&#xC81C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCC45;&#xC784;&#xC744; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Gp5 1 ~ 50 &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC;&#xC758; &#xC124;&#xB9BD; &#xC774;&#xD6C4; dissociating &#xB0AE;&#xC740; processivity&#xC640; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; polymerizes. &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;&#xC758; Thioredoxin (trx) &#xB2E8;&#xB2E8;&#xD788; &#xACB0;&#xC18D; (Kd = 5 nM) gp5 &#xBC0F; &#xC99D;&#xAC00; processivity &#xC5C4;&#xC9C0; &#xD558;&#xC704; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACE0;&#xC720;&#xD55C; &#xC138;&#xADF8;&#xBA3C;&#xD2B8;&#xB97C;. &#xC6B0;&#xB9AC; processivity &#xC99D;&#xAC00; &#xB300; &#xD55C; &#xBD84;&#xC790; &#xB2E8;&#xC704;&#xB85C; &#xC870;&#xC0AC; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC2E4;&#xD5D8; gp5&#xC640; gp5/trx &#xAC04;&#xC758; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD65C;&#xB3D9; &#xBC0F; processivity&#xC758; &#xC18D;&#xB3C4; &#xCC28;&#xC774; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4;. &#xC791;&#xC740; &#xAC01; x &#xC120; &#xC0B0;&#xB780; &#xC5F0;&#xAD6C; nuclease &#xD504;&#xB9B0;&#xD305;&#xACFC; &#xD568;&#xAED8; &#xACF5;&#xAC1C;&#xC758; gp5, &#xC790;&#xC720;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC5D0;&#xC11C; trx &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xB450; conformations. DNA &#xD3F4; &#xBC0F; DNA &#xC758;&#xBB34;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; DNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; clefts&#xC758; &#xBE44;&#xAD50; &#xBD84;&#xC11D; &#xD45C;&#xC2DC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD45C;&#xBA74; &#xB2E4;&#xB978; DNA &#xC758;&#xBB34;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB354; &#xB9CE;&#xC740; &#xC18C;&#xC218; &#xC131; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568;. &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC758; &#xC18C;&#xC218; &#xC131; &#xBC0F; &#xCDA9;&#xC804; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xADE0;&#xD615;&#xB41C; &#xAD6C;&#xC131; DNA&#xC5D0; gp5/trx&#xC758; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xC2AC;&#xB77C;&#xC774;&#xB529; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; DNA&#xC640; gp5&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xC99D;&#xAC00; &#xC2DC;&#xCF1C; &#xACE0; processivity &#xD5A5;&#xC0C1; gp5 trx &#xC720;&#xB3C4; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBCC0;&#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBAA8;&#xB378;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0; T7 DNA &#xC911; &#xD569; processivity &#xC694;&#xC778;, &#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; thioredoxin&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC5ED;&#xD559;.

Gen 5 del bacteri&oacute;fago T7 codifica una ADN polimerasa (gp5) responsable de la r&eacute;plica de la DNA del fago. GP5 polimeriza nucle&oacute;tidos con baja procesividad, disociando despu&eacute;s de la incorporaci&oacute;n de nucle&oacute;tidos de 1 a 50. Tiorredoxina (trx) de Escherichia coli se une fuertemente (Kd = 5 nM) a un &uacute;nico segmento en el subdominio de pulgar de procesividad gp5 y aumentos. Nos hemos sondeado la base molecular para el aumento en la procesividad. Un experimento de una sola mol&eacute;cula revela diferencias en las tasas de actividad enzim&aacute;tica y procesividad gp5 y gp5/trx. Estudios de dispersi&oacute;n de rayos x de peque&ntilde;o &aacute;ngulo combinados con huella de Nucleasa revelan dos conformaciones de gp5, uno en el estado libre y uno en Uni&oacute;n a trx. An&aacute;lisis comparativo de las hendiduras de uni&oacute;n de ADN polimerasas de la DNA y prote&iacute;nas de uni&oacute;n de ADN muestran que la superficie de Uni&oacute;n contiene residuos hidrof&oacute;bicos m&aacute;s que otras prote&iacute;nas de uni&oacute;n de ADN. La composici&oacute;n equilibrada entre residuos hidrof&oacute;bicos y cargadas del sitio de Uni&oacute;n permite deslizamiento eficiente de gp5/trx en el ADN. Se propone un modelo para trx-inducido cambios conformacionales en gp5 que mejoran la procesividad incrementando la interacci&oacute;n de gp5 con ADN.

Din&aacute;mica conformacional del bacteri&oacute;fago T7 ADN polimerasa y su procesividad factor, Escherichia coli tiorredoxina.

&#x57FA;&#x672C;&#x8FD0;&#x4F5C;&#x5927;&#x578B;&#x3001; multiprotein &#x914D;&#x5408;&#x7269;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x673A;&#x5236;&#x5B8C;&#x5168;&#x7406;&#x89E3;&#x9700;&#x8981;&#x80FD;&#x591F;&#x540C;&#x65F6;&#x53EF;&#x89C6;&#x5316;&#x5206;&#x5B50;&#x4F53;&#x7CFB;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x5B9E;&#x65F6;&#x7684;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F00;&#x53D1;&#x4E86;&#x65B0;&#x578B;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x76F8;&#x7ED3;&#x5408;&#x7684;&#x5355;&#x4E2A; DNA &#x5206;&#x5B50;&#x6765;&#x8861;&#x91CF;&#x4E0E;&#x53EF;&#x89C6;&#x5316;&#x5728;&#x590D;&#x5236;&#x53C9;&#x7684;&#x9057;&#x4F20;&#x7269;&#x8D28;&#x6807;&#x8BB0; DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x7684;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684; DNA &#x590D;&#x5236;&#x673A;&#x68B0;&#x62C9;&#x4F38;&#x6D41;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x5C06;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x5316;&#x5B66;&#x8BA1;&#x91CF;&#x5B66;&#x4E0E; DNA &#x5408;&#x6210;&#x7684; T7 &#x566C;&#x83CC;&#x4F53; replisomes &#x5173;&#x8054;&#x8D77;&#x6765;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x90FD;&#x80FD;&#x591F;&#x5B9A;&#x91CF;&#x63CF;&#x8FF0;&#x7684;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x4EA4;&#x6D41;&#x673A;&#x5236;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x5373;&#x4F7F;&#x5728;&#x76F8;&#x5BF9;&#x6E29;&#x548C;&#x7684;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x6D53;&#x5EA6; &#xFF08;&sim;2 nM&#xFF09;&#xFF0C;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x62DB;&#x52DF;&#x79EF;&#x6781;&#x5408;&#x6210;&#x7684; replisome&#xFF0C;&#x5927;&#x5927;&#x589E;&#x52A0;&#x4E86;&#x5F53;&#x5730;&#x7684;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x6D53;&#x5EA6;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x591A;&#x4F59;&#x7684;&#x5F02;&#x6027;&#x7B80;&#x5217;&#x4FDD;&#x6301;&#x88AB;&#x52A8;&#x5730;&#x5173;&#x8054;&#x901A;&#x8FC7;&#x9759;&#x7535;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x4E0E; T7 &#x89E3;&#x65CB;&#x9176; &sim;50 s replisome&#xFF0C;&#x76F4;&#x5230;&#x5408;&#x6210;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x4ECE;&#x5F15;&#x7269;-&#x6A21;&#x677F;&#x968F;&#x673A;&#x548C;&#x77AC;&#x6001;&#x89E3;&#x79BB;&#x5141;&#x8BB8;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x4EA4;&#x6362;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x53D1;&#x751F;&#x3002;

&#x566C;&#x83CC;&#x4F53; T7 replisome &#x7EC4;&#x6210;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x540C;&#x65F6;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x6D4B;&#x91CF;&#x63ED;&#x793A;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x4EA4;&#x6D41;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#x3002;

A complete understanding of the molecular mechanisms underlying the functioning of large, multiprotein complexes requires experimental tools capable of simultaneously visualizing molecular architecture and enzymatic activity in real time. We developed a novel single-molecule assay that combines the flow-stretching of individual DNA molecules to measure the activity of the DNA-replication machinery with the visualization of fluorescently labeled DNA polymerases at the replication fork. By correlating polymerase stoichiometry with DNA synthesis of T7 bacteriophage replisomes, we are able to quantitatively describe the mechanism of polymerase exchange. We find that even at relatively modest polymerase concentration (âˆ¼2Â nM), soluble polymerases are recruited to an actively synthesizing replisome, dramatically increasing local polymerase concentration. These excess polymerases remain passively associated with the replisome through electrostatic interactions with the T7 helicase for âˆ¼50Â s until a stochastic and transient dissociation of the synthesizing polymerase from the primer-template allows for a polymerase exchange event to occur.

Simultaneous single-molecule measurements of phage T7 replisome composition and function reveal the mechanism of polymerase exchange.

Une compr&#xE9;hension compl&#xE8;te des m&#xE9;canismes mol&#xE9;culaires qui sous-tendent le fonctionnement des grands complexes multiprot&#xE9;iques, n&#xE9;cessite des outils exp&#xE9;rimentaux capables de visualiser simultan&#xE9;ment l&#x26;#39;architecture mol&#xE9;culaire et l&#x26;#39;activit&#xE9; enzymatique en temps r&#xE9;el. On a d&#xE9;velopp&#xE9; un nouveau dosage unique mol&#xE9;cule qui combine le flux d&#x26;#39;&#xE9;tirage de mol&#xE9;cules d&#x26;#39;ADN diff&#xE9;rentes pour mesurer l&#x26;#39;activit&#xE9; de la machine r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN avec la visualisation des polym&#xE9;rases ADN marqu&#xE9;s par fluorescence &#xE0; la fourche de r&#xE9;plication. En corr&#xE9;lant stoechiom&#xE9;trie polym&#xE9;rase synth&#xE8;se de l&#x26;#39;ADN du bact&#xE9;riophage T7 replisomes, nous sommes en mesure de d&#xE9;crire quantitativement le m&#xE9;canisme d&#x26;#39;&#xE9;change polym&#xE9;rase. Nous constatons que m&#xEA;me &#xE0; une concentration polym&#xE9;rase relativement modeste (~ 2 nM), polym&#xE9;rases solubles sont recrut&#xE9;s &#xE0; un r&#xE9;plisome activement synth&#xE9;tiser, de fa&#xE7;on spectaculaire augmentation de la concentration locale polym&#xE9;rase. Ces polym&#xE9;rases exc&#xE9;dentaires restent passivement associ&#xE9; &#xE0; la r&#xE9;plisome par des interactions &#xE9;lectrostatiques avec l&#x26;#39;h&#xE9;licase T7 pour ~ 50 s jusqu&#x26;#39;&#xE0; une dissociation stochastique et transitoire de la polym&#xE9;rase synth&#xE8;se de l&#x26;#39;amorce-matrice permet pour un &#xE9;v&#xE9;nement d&#x26;#39;&#xE9;change polym&#xE9;rase de se produire.

Mesures simultan&#xE9;es d&#x26;#39;une seule mol&#xE9;cule du phage T7 Composition r&#xE9;plisome et fonction R&#xE9;v&#xE9;ler le m&#xE9;canisme de l&#x26;#39;&#xE9;change polym&#xE9;rase

Ein vollst&auml;ndiges Verst&auml;ndnis der molekularen Mechanismen des Funktionierens der gro&szlig;en, multiprotein komplexe erfordert experimentelle Werkzeuge k&ouml;nnen gleichzeitig molekulare Architektur und enzymatische Aktivit&auml;t in Echtzeit zu visualisieren. Wir entwickelten eine neuartige Einzelmolek&uuml;l-Assay, das verbindet die Fluss-Dehnung einzelner DNA-Molek&uuml;le, die Aktivit&auml;t der DNA-Replikation-Maschine mit der Visualisierung der Leuchtstoff beschrifteten DNA-Polymerasen an der Wiederholunggabel zu messen. Durch Korrelation Polymerase St&ouml;chiometrie mit DNA-Synthese von T7 Bakteriophage Replisomes, sind wir in der Lage, den Mechanismus f&uuml;r den Informationsaustausch der Polymerase quantitativ zu beschreiben. Wir finden, dass auch bei relativ bescheidenen Polymerase Konzentration (&sim;2 nM), l&ouml;sliche Polymerasen zu einem aktiv Synthese Replisom rekrutiert werden lokale Polymerase Konzentration drastisch zu erh&ouml;hen. Diese &uuml;bersch&uuml;ssigen Polymerasen bleiben Replisom durch elektrostatische Wechselwirkungen mit den T7-Helicase &sim;50 s passiv verbunden, bis eine stochastische und vor&uuml;bergehende Dissoziation der Synthese-Polymerase von der Z&uuml;ndkapsel-Vorlage f&uuml;r ein Polymerase-Exchange-Ereignis auftreten kann.

Gleichzeitige Einzelmolek&uuml;l-Messungen von Phagen T7 Replisom Zusammensetzung und Funktion offenbaren den Mechanismus f&uuml;r den Informationsaustausch der Polymerase.

Una completa comprensione dei meccanismi molecolari alla base del funzionamento di complessi multiproteici, grande richiede strumenti sperimentali in grado di visualizzare contemporaneamente architettura molecolare e attivit&agrave; enzimatica in tempo reale. Abbiamo sviluppato un romanzo saggio di singola molecola che combina il flusso-stretching di singole molecole di DNA per misurare l&#39;attivit&agrave; del macchinario di replicazione del DNA con la visualizzazione della polimerasi del DNA fluorescente contrassegnate presso la forcella di replicazione. Correlando la stechiometria della polimerasi con la sintesi del DNA del replisomes del batteriofago T7, siamo in grado di descrivere quantitativamente il meccanismo di scambio della polimerasi. Troviamo che anche a concentrazione relativamente modesto della polimerasi (&sim;2 nM), solubile polimerasi sono reclutate per un replisome attivamente a sintetizzazione, aumentando drasticamente la concentrazione locale della polimerasi. Queste polimerasi in eccesso rimangono passivamente associate replisome tramite interazioni elettrostatiche con l&#39;elicasi T7 per &sim;50 s fino a una dissociazione stocastica e transitoria della polimerasi sintetizzazione dal primer-modello permette per un evento di scambio della polimerasi a verificarsi.

Simultanee misurazione singola molecola del fago T7 replisome composizione e funzione di rivelare il meccanismo di scambio della polimerasi.

&#x5927;&#x898F;&#x6A21;&#x306A;&#x3001;&#x591A;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x6839;&#x5E95;&#x306B;&#x3042;&#x308B;&#x5206;&#x5B50;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x306E;&#x5B8C;&#x5168;&#x306A;&#x7406;&#x89E3;&#x304C;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x3067;&#x5206;&#x5B50;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x9175;&#x7D20;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x53EF;&#x8996;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306E;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x5B9F;&#x9A13;&#x7684;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x8907;&#x88FD;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30AF;&#x3067;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x3057;&#x305F;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x53EF;&#x8996;&#x5316;&#x3068;DNA-&#x8907;&#x88FD;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x500B;&#x3005;&#x306E;DNA&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x6D41;&#x308C;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30C3;&#x30C1;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3001;&#x65B0;&#x898F;&#x5358;&#x5206;&#x5B50;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; T7&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;replisomes&#x306E;DNA&#x5408;&#x6210;&#x3068;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x5316;&#x5B66;&#x91CF;&#x8AD6;&#x3092;&#x76F8;&#x4E92;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x4EA4;&#x63DB;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x63A7;&#x3048;&#x3081;&#x306A;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x6FC3;&#x5EA6;&#xFF08;&#x301C;2 nm&#xFF09;&#x3067;&#x3001;&#x6C34;&#x6EB6;&#x6027;&#x306E;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x5287;&#x7684;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x3001;&#x7A4D;&#x6975;&#x7684;&#x306B;&#x5408;&#x6210;replisome&#x306B;&#x52D5;&#x54E1;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x904E;&#x5270;&#x306A;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#xB7;&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x5408;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x78BA;&#x7387;&#x8AD6;&#x7684;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x4E00;&#x6642;&#x7684;&#x306A;&#x89E3;&#x96E2;&#x307E;&#x3067;&#x53D7;&#x52D5;&#x7684;&#x306B;&#x301C;50 s&#x306E;T7&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;&#x306E;&#x9759;&#x96FB;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;replisome&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x307E;&#x307E;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x4EA4;&#x63DB;&#x30A4;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C8;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;T7 Replisome&#x69CB;&#x6210;&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x540C;&#x6642;&#x5358;&#x5206;&#x5B50;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x306F;&#x3001;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x4EA4;&#x63DB;&#x306E;&#x6A5F;&#x69CB;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;

&#xAE30;&#xBCF8; &#xB300;&#xD615;, multiprotein &#xB2E8;&#xC9C0;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xBD84;&#xC790; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC758; &#xC644;&#xBCBD; &#xD55C; &#xC774;&#xD574; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xAC00; &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xBD84;&#xC790; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04;&#xC73C;&#xB85C; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xBCF5;&#xC81C; &#xD3EC;&#xD06C;&#xC5D0; &#xB193;&#xC5EC;&#xC788;&#xB294;&#xC9C0; &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xC774; &#xC788;&#xB294; DNA &#xD3F4;&#xC758; &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654;&#xC640; DNA &#xBCF5;&#xC81C; &#xAE30;&#xACC4; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xCE21;&#xC815; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xAC1C;&#xBCC4; DNA &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xD750;&#xB984; &#xC2A4;&#xD2B8;&#xB808;&#xCE6D; &#xACB0;&#xD569; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xAC1C;&#xBC1C;. T7 &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0; replisomes&#xC758; DNA &#xD569;&#xC131; &#xD6A8;&#xC18C; stoichiometry&#xB97C; &#xC0C1;&#xD638; &#xC5F0;&#xACB0;, &#xC591;&#xC801; &#xD6A8;&#xC18C; exchange &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xC124;&#xBA85;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC2EC;&#xC9C0;&#xC5B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xACB8;&#xC190; &#xD55C; &#xD6A8;&#xC18C; &#xB18D;&#xB3C4; (&sim;2 nM), &#xC218;&#xC6A9; &#xC131; &#xD3F4; &#xC801;&#xADF9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC885;&#xD569; replisome&#xB97C; &#xBAA8;&#xC9D1; &#xD558; &#xACE0; &#xADF9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB85C;&#xCEEC; &#xD6A8;&#xC18C; &#xB18D;&#xB3C4; &#xC99D;&#xAC00; &#xCC3E;&#xC73C;&#xC2ED;&#xC2DC;&#xC624;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xCD08;&#xACFC; &#xD3F4;&#xAE4C;&#xC9C0; replisome &sim;50 s t 7&#xC740; helicase&#xC640; &#xC815;&#xC804;&#xAE30; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC218; &#xB3D9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC5F0;&#xAD00; &#xB1CC;&#xAD00; &#xD15C;&#xD50C;&#xB9BF;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC885;&#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xCD94;&#xACC4; &#xBC0F; &#xACFC;&#xB3C4; &#xBD84;&#xB9AC; &#xD6A8;&#xC18C; &#xAD50;&#xD658; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8;&#xAC00; &#xBC1C;&#xC0DD;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C; T7 replisome &#xAD6C;&#xC131; &#xBC0F; &#xAE30;&#xB2A5; &#xB3D9;&#xC2DC; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xCE21;&#xC815; &#xD6A8;&#xC18C; exchange &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xACF5;&#xAC1C;.

Una comprensi&#xF3;n completa de los mecanismos moleculares que subyacen al funcionamiento de los grandes complejos multiproteicos, requiere de herramientas experimentales capaces de visualizar al mismo tiempo la arquitectura molecular y la actividad enzim&#xE1;tica en tiempo real. Hemos desarrollado un nuevo ensayo de una sola mol&#xE9;cula que combina el flujo de estiramiento de las mol&#xE9;culas de ADN individuales para medir la actividad de la maquinaria de replicaci&#xF3;n del ADN-con la visualizaci&#xF3;n de las polimerasas de ADN marcadas fluorescentemente en el tenedor de replicaci&#xF3;n. Al correlacionar estequiometr&#xED;a polimerasa con la s&#xED;ntesis de ADN de T7 replisomes bacteri&#xF3;fagos, que son capaces de describir cuantitativamente el mecanismo de cambio de la polimerasa. Nos parece que incluso en concentraciones relativamente modesto de la polimerasa (~ 2 nm), polimerasas solubles son reclutados para una replisoma activa la s&#xED;ntesis, aumentando dram&#xE1;ticamente la concentraci&#xF3;n de la polimerasa local. Estas polimerasas exceso permanecer pasivamente asociado con el replisoma a trav&#xE9;s de interacciones electrost&#xE1;ticas con la helicasa T7 para ~ 50 s hasta una disociaci&#xF3;n estoc&#xE1;stico y transitorios de la polimerasa sintetizar a partir del iniciador-plantilla permite un evento de intercambio polimerasa que se produzca.

Las medidas simult&#xE1;neas de una sola mol&#xE9;cula de Fago T7 replisoma Composici&#xF3;n y funci&#xF3;n de revelar el mecanismo de intercambio de la polimerasa

DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x50AC;&#x5316; 3&#39;-5&#39;-pyrophosphorolysis &#x7684; DNA &#x5F15;&#x7269;&#x9000;&#x706B;&#x5230; DNA &#x6A21;&#x677F;&#x4E0B;&#x7126; (PP(i))&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x9006;&#x8F6C;&#x7684;&#x805A;&#x5408;&#x53CD;&#x5E94;&#xFF0C;&#x5728; DNA &#x4E2D;&#x7684; deoxynucleotides &#x8F6C;&#x6362;&#x4E3A; deoxynucleoside 5&#39;-triphosphates&#x3002;&#x57FA;&#x4E8E;&#x7535;&#x8377;&#x3001; &#x5927;&#x5C0F;&#x548C;&#x8FDE;&#x63A5;&#x7684; PP(i) &#x4E24;&#x4E2A;&#x78F7;&#x539F;&#x5B50;&#x6C27;&#x7684;&#x51E0;&#x4F55;&#x5F62;&#x72B6;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x4E4B;&#x80FD;&#x8FDB;&#x884C;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x4E8E; pyrophosphorolysis &#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x53CD;&#x5E94;&#x5BA1;&#x67E5;&#x4E86;&#x5404;&#x79CD;&#x5404;&#x6837;&#x7684;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4F7F;&#x7528; pyrovanadate (VV) &#x7684;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53; T7 DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x50AC;&#x5316;&#x9530;&#x4ECB;&#x5BFC; pyrophosphorolysis &#x7C7B;&#x4F3C;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C06;&#x6307;&#x5B9A;&#x6B64;&#x53CD;&#x5E94; pyrovanadolysis&#x3002;X &#x5C04;&#x7EBF;&#x5438;&#x6536;&#x8C31;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86;&#x9530;&#x9492;&#x8DDD;&#x79BB;&#x7684;&#x805A;&#x5408;&#x9176; VV &#x590D;&#x6742;&#x6BD4;&#x590D;&#x6742;&#x7684; polymerase-PP(i) &#x7684;&#x9530; P &#x8DDD;&#x79BB;&#x8F83;&#x77ED;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x7ED3;&#x6784;&#x5B89;&#x6392;&#x5728;&#x6D3B;&#x52A8;&#x7F51;&#x7AD9;&#x5360;&#x9176;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x7684;&#x9530; VV.&#x6211;&#x4EEC;&#x5EFA;&#x8BAE; Mn(2+)&#xFF0C;&#x5927;&#x4E8E; Mg(2+)&#xFF0C;&#x9002;&#x5408;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x6D3B;&#x52A8;&#x7F51;&#x7AD9;&#x6765;&#x8C03;&#x89E3; VV &#x6210;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x7684;&#x6D3B;&#x6027;&#x90E8;&#x4F4D;&#x7ED3;&#x5408;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x53EF;&#x80FD;&#x662F;&#x9492;&#x53EF;&#x4EE5;&#x66FF;&#x4EE3;&#x751F;&#x7269;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x78F7;&#x542B;&#x91CF;&#x7684;&#x7B2C;&#x4E00;&#x4E2A;&#x6587;&#x4EF6;&#x3002;

Pyrovanadolysis&#x3001; pyrovanadate&#x3001; Mn2 + &#x548C;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53; T7 DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x4ECB;&#x5BFC; pyrophosphorolysis &#x6837;&#x53CD;&#x5E94;&#x3002;

DNA polymerases catalyze the 3'-5'-pyrophosphorolysis of a DNA primer annealed to a DNA template in the presence of pyrophosphate (PP(i)). In this reversal of the polymerization reaction, deoxynucleotides in DNA are converted to deoxynucleoside 5'-triphosphates. Based on the charge, size, and geometry of the oxygen connecting the two phosphorus atoms of PP(i), a variety of compounds was examined for their ability to carry out a reaction similar to pyrophosphorolysis. We describe a manganese-mediated pyrophosphorolysis-like activity using pyrovanadate (VV) catalyzed by the DNA polymerase of bacteriophage T7. We designate this reaction pyrovanadolysis. X-ray absorption spectroscopy reveals a shorter Mn-V distance of the polymerase-VV complex than the Mn-P distance of the polymerase-PP(i) complex. This structural arrangement at the active site accounts for the enzymatic activation by Mn-VV. We propose that the Mn(2+), larger than Mg(2+), fits the polymerase active site to mediate binding of VV into the active site of the polymerase. Our results may be the first documentation that vanadium can substitute for phosphorus in biological processes.

Pyrovanadolysis, a pyrophosphorolysis-like reaction mediated by pyrovanadate, Mn2+, and DNA polymerase of bacteriophage T7.

ADN polym&#xE9;rases catalyser la 3&#x26;#39;-5&#x26;#39;-pyrophosphorolyse d&#x26;#39;une amorce d&#x26;#39;ADN hybrid&#xE9; &#xE0; une matrice d&#x26;#39;ADN en pr&#xE9;sence de pyrophosphate (PP (i)). Dans ce renversement de la r&#xE9;action de polym&#xE9;risation, d&#xE9;soxynucl&#xE9;otides dans l&#x26;#39;ADN sont convertis en d&#xE9;soxynucl&#xE9;oside 5&#x26;#39;-triphosphates. Sur la base de la charge, la taille et la g&#xE9;om&#xE9;trie de l&#x26;#39;oxyg&#xE8;ne qui relie les deux atomes de phosphore PP (i), une vari&#xE9;t&#xE9; de compos&#xE9;s a &#xE9;t&#xE9; examin&#xE9;e pour leur capacit&#xE9; &#xE0; effectuer une r&#xE9;action semblable &#xE0; pyrophosphorolyse. Nous d&#xE9;crivons une mangan&#xE8;se m&#xE9;diation pyrophosphorolyse une activit&#xE9; semblable &#xE0; l&#x26;#39;aide pyrovanadate (VV) catalys&#xE9;e par l&#x26;#39;ADN polym&#xE9;rase du bact&#xE9;riophage T7. Nous d&#xE9;signons cette pyrovanadolysis r&#xE9;action. Spectroscopie d&#x26;#39;absorption des rayons X montre une plus courte distance de Mn-V du complexe polym&#xE9;rase-VV &#xE0; la distance de Mn-P de la polym&#xE9;rase-PP (i) complexe. Cet arrangement structurel des comptes au site actif pour l&#x26;#39;activation enzymatique par le Mn-VV. Nous proposons que le Mn (2 +), plus grand que Mg (2 +), s&#x26;#39;inscrit sur le site polym&#xE9;rase active &#xE0; la m&#xE9;diation obligatoire de VV dans le site actif de la polym&#xE9;rase. Nos r&#xE9;sultats peuvent &#xEA;tre la premi&#xE8;re documentation que le vanadium peut se substituer &#xE0; du phosphore dans les processus biologiques.

Pyrovanadolysis, une r&#xE9;action semblable &#xE0; pyrophosphorolyse M&#xE9;diation par pyrovanadate, Mn2 + polym&#xE9;rase, et l&#x26;#39;ADN du bact&#xE9;riophage T7

DNA-Polymerasen katalysieren die 3&#39;-5&#39;-Pyrophosphorolysis einer DNA-Z&uuml;ndkapsel gegl&uuml;ht zu einer DNA-Vorlage in der Gegenwart Diphosphate (PP(i)). Diese Umkehrung der die Polymerisation sind Deoxynucleotides in DNA auf Deoxynucleoside 5&#39;-Triphosphate umgebaut. Auf der Grundlage der Ladung, Gr&ouml;&szlig;e und Geometrie des Sauerstoffes verbinden die zwei Phosphor-Atome des PP(i), wurde eine Vielzahl von Verbindungen f&uuml;r ihre F&auml;higkeit zur Durchf&uuml;hrung einer Reaktion &auml;hnlich dem Pyrophosphorolysis untersucht. Wir beschreiben eine Mangan-vermittelte Pyrophosphorolysis Aktivit&auml;ten mit Pyrovanadate (VV) katalysiert durch die DNA-Polymerase der Bakteriophage T7. Wir bezeichnen diese Reaktion Pyrovanadolysis. X-ray Absorption Spectroscopy offenbart eine k&uuml;rzere Mn-V-Entfernung von der Polymerase-VV-Komplex als der Mn-P-Abstand von der komplexen polymerase-PP(i). Diese strukturelle Anordnung am Standort aktiv entfallen die enzymatische Aktivierung von Mn-VV Wir schlagen vor, dass die Mn(2+) gr&ouml;&szlig;er als Mg(2+), der Polymerase aktiven Site Binden der VV in der aktiven Site der Polymerase vermitteln passt. Unsere Ergebnisse m&ouml;glicherweise die erste Dokumentation, die Vanadium Phosphor in biologischen Prozessen ersetzen k&ouml;nnen.

Pyrovanadolysis, eine Pyrophosphorolysis-&auml;hnliche Reaktion von Pyrovanadate, Mn2 + und DNA-Polymerase der Bakteriophage T7 vermittelt.

DNA polimerasi catalizzano il 3&#39; -5 &#39;-pyrophosphorolysis di un primer di DNA ricotto a un modello di DNA in presenza di pirofosfato (PP(i)). In questa inversione della reazione di polimerizzazione, deoxynucleotides nel DNA vengono convertiti in deossinucleoside 5&#39;-trifosfati. Basato sulla carica, la dimensione e la geometria dell&#39;ossigeno collegando i due atomi di fosforo, di PP(i), una variet&agrave; di composti &egrave; stata esaminata per la loro capacit&agrave; di effettuare una reazione simile a pyrophosphorolysis. Descriviamo una manganese-mediata pyrophosphorolysis-come attivit&agrave; utilizzando pyrovanadate (VV), catalizzata dalla polimerasi del DNA del batteriofago T7. Indichiamo questa reazione pyrovanadolysis. Spettroscopia di assorbimento di raggi x rivela una distanza pi&ugrave; corta di Mn-V del complesso della polimerasi-VV rispetto la distanza Mn-P la polymerase-PP(i) complesso. Questa disposizione strutturale presso il sito attivo i conti per l&#39;attivazione enzimatica di Mn-VV. Proponiamo che il Mn(2+), pi&ugrave; grande di Mg(2+), si inserisce il sito attivo della polimerasi di mediare associazione di VV nel sito attivo della polimerasi. I nostri risultati possono essere la prima documentazione che vanadio pu&ograve; sostituire per il fosforo nei processi biologici.

Pyrovanadolysis, una pyrophosphorolysis-come reazione mediata da pyrovanadate, Mn2 + e polimerasi del DNA del batteriofago T7.

DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x30D4;&#x30ED;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;DNA&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#xFF08;PP&#xFF08;I&#xFF09;&#xFF09;&#x306B;&#x30A2;&#x30CB;&#x30FC;&#x30EB;&#x3057;&#x305F;DNA&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E;3&#x26;#39;-5&#x26;#39;-pyrophosphorolysis&#x3092;&#x89E6;&#x5A92;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x91CD;&#x5408;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306E;&#x3053;&#x306E;&#x9006;&#x8EE2;&#x306B;&#x306F;&#x3001;DNA&#x306E;&#x30C7;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;5&#x26;#39;-&#x4E09;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x3092;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30B7;&#x30C9;&#x306B;&#x5909;&#x63DB;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x96FB;&#x8377;&#x3001;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;PP&#xFF08;i&#xFF09;&#x306E;2&#x3064;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x539F;&#x5B50;&#x3092;&#x63A5;&#x7D9A;&#x3059;&#x308B;&#x9178;&#x7D20;&#x306E;&#x30B8;&#x30AA;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x7A2E;&#x3005;&#x306E;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x306F;&#x3001;pyrophosphorolysis&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306E;&#x53CD;&#x5FDC;&#x3092;&#x9042;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;T7&#x306E;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x89E6;&#x5A92;pyrovanadate&#xFF08;VV&#xFF09;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30DE;&#x30F3;&#x30AC;&#x30F3;&#x5A92;&#x4ECB;pyrophosphorolysis&#x69D8;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3053;&#x306E;&#x53CD;&#x5FDC;pyrovanadolysis&#x3092;&#x6307;&#x5B9A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; X&#x7DDA;&#x5438;&#x53CE;&#x5206;&#x5149;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;-PP&#xFF08;I&#xFF09;&#x932F;&#x4F53;&#x306E;Mn-P&#x8DDD;&#x96E2;&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;-VV&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x77ED;&#x3044;&#x306E;Mn-V&#x306E;&#x8DDD;&#x96E2;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x306E;Mn-VV&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x9175;&#x7D20;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306E;&#x30A2;&#x30AB;&#x30A6;&#x30F3;&#x30C8;&#x3067;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x914D;&#x7F6E;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;Mg&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x5927;&#x304D;&#x3044;&#x306E;Mn&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x3001;&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306B;VV&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306B;&#x9069;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x30D0;&#x30CA;&#x30B8;&#x30A6;&#x30E0;&#x306F;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x7684;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x4EE3;&#x308F;&#x308A;&#x306B;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x8CC7;&#x6599;&#x304B;&#x3082;&#x3057;&#x308C;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;

Pyrovanadolysis&#x3001;Pyrophosphorolysis&#x3088;&#x3046;&#x306A;Pyrovanadate&#x3001;Mn2 +&#x306E;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x53CD;&#x5FDC;&#x3068;&#x3001;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;T7&#x306E;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;

DNA &#xD3F4;&#xC740; 3&#39;-5&#39;-pyrophosphorolysis &#xC778;&#xC0B0; (PP(i)) &#xC874;&#xC7AC; DNA &#xD15C;&#xD50C;&#xB81B;&#xC744; &#xB2E8;&#xB828; DNA &#xB1CC;&#xAD00;&#xC758; &#xCD09;&#xB9E4;. &#xC911; &#xD569; &#xBC18;&#xC751;&#xC758;&#xC774; &#xBC18;&#xC804;&#xC5D0; DNA&#xC5D0; deoxynucleotides deoxynucleoside 5&#39;-triphosphates &#xBCC0;&#xD658; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCDA9;&#xC804;, &#xD06C;&#xAE30;, &#xBC0F; pp(i)&#xC758; &#xB450; &#xC778; &#xC6D0;&#xC790;&#xB97C; &#xC5F0;&#xACB0; &#xD558;&#xB294; &#xC0B0;&#xC18C;&#xC758; &#xAE30;&#xD558;&#xD559;&#xC744; &#xBC14;&#xD0D5;&#xC73C;&#xB85C;, &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xD654;&#xD569;&#xBB3C; pyrophosphorolysis&#xC640; &#xBE44;&#xC2B7;&#xD55C; &#xBC18;&#xC751;&#xC744; &#xC218;&#xD589; &#xD558;&#xB294; &#xB2A5;&#xB825;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC870;&#xC0AC; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; pyrovanadate (VV) T7 &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0;&#xC758; DNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCD09;&#xB9E4;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB9DD;&#xAC04; &#xC911;&#xC7AC; pyrophosphorolysis &#xAC19;&#xC740; &#xB3D9;&#xC791;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294;&#xC774; &#xBC18;&#xC751; pyrovanadolysis&#xB97C; &#xC9C0;&#xC815;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. X-&#xC120; &#xD761;&#xC218; &#xBD84;&#xAD11;&#xD559; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; Polymerase-pp(i)&#xC758; &#xBBF8;&#xB124;&#xC18C;&#xD0C0; P &#xAC70;&#xB9AC; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD6A8;&#xC18C; VV &#xB2E8;&#xC9C0; &#xC9E7;&#xC740; &#xBBF8;&#xB124;&#xC18C;&#xD0C0; V &#xAC70;&#xB9AC;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4;. &#xC561;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBC30;&#xC5F4;&#xC774; &#xCC28;&#xC9C0; &#xD558; &#xACE0; &#xBBF8;&#xB124;&#xC18C;&#xD0C0; VV.&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; Mn(2+), Mg(2+), &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD070; &#xB9DE;&#xB294; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD65C;&#xC131; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB294; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xD65C;&#xC131; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0; VV&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC911;&#xC7AC;&#xB97C; &#xC81C;&#xC548; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xBC14;&#xB098;&#xB4D0; &#xC778; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xACFC;&#xC815;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB300;&#xCCB4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xCCAB; &#xBC88;&#xC9F8; &#xBB38;&#xC11C;&#xB97C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Pyrovanadolysis, pyrovanadate, Mn2 +&#xC640; &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0; t 7&#xC758; DNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC911;&#xC7AC; pyrophosphorolysis &#xAC19;&#xC740; &#xBC18;&#xC751;.

ADN polimerasas catalizan la 3&#x26;#39;-5&#x26;#39;-pyrophosphorolysis de un cebador de ADN recocido a una plantilla de ADN en presencia de pirofosfato (PP (i)). En esta inversi&#xF3;n de la reacci&#xF3;n de polimerizaci&#xF3;n, desoxinucle&#xF3;tidos en el ADN se convierten en desoxinucle&#xF3;sidos 5&#x26;#39;-trifosfatos. En base a la carga, el tama&#xF1;o y geometr&#xED;a del ox&#xED;geno que conecta los dos &#xE1;tomos de f&#xF3;sforo de PP (i), una variedad de compuestos se examinaron para determinar su capacidad para llevar a cabo una reacci&#xF3;n similar a pyrophosphorolysis. Se describe un manganeso mediada pyrophosphorolysis actividad similar utilizando pyrovanadate (VV) catalizada por la polimerasa del ADN del bacteri&#xF3;fago T7. Denominamos a esta pyrovanadolysis reacci&#xF3;n. Espectroscop&#xED;a de rayos X revela una absorci&#xF3;n m&#xE1;s corta de Mn-V distancia del complejo polimerasa-VV que la distancia Mn-P de la polimerasa-PP (i) complejos. Esta disposici&#xF3;n estructural en las cuentas de sitios activos para la activaci&#xF3;n enzim&#xE1;tica por Mn-VV. Se propone que el Mn (2 +), mayor que Mg (2 +), se adapta el sitio activo de la polimerasa para mediar en la uni&#xF3;n de VV en el sitio activo de la polimerasa. Nuestros resultados pueden ser la primera documentaci&#xF3;n que el vanadio puede sustituir f&#xF3;sforo en los procesos biol&#xF3;gicos.

Pyrovanadolysis, una reacci&#xF3;n similar a Pyrophosphorolysis mediada por Pyrovanadate, Mn2 + de la polimerasa y el ADN del bacteri&#xF3;fago T7

&#x566C;&#x83CC;&#x4F53; 4 &#x57FA;&#x56E0;&#x7F16;&#x7801;&#x7684; DNA &#x89E3;&#x65CB;&#x9176; T7 &#x88C5;&#x914D;&#x4E0A;&#x5355;&#x94FE; DNA &#x4F5C;&#x4E3A;&#x516D;&#x805A;&#x4F53;&#x7684;&#x516D;&#x4E2A;&#x76F8;&#x540C;&#x7684;&#x4E9A;&#x57FA;&#x4E0E; DNA &#x7A7F;&#x8FC7;&#x4E86;&#x5706;&#x73AF;&#x7684;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x3002;&#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x60C5;&#x4FA3; dTTP &#x5230;&#x5355;&#x5411;&#x6613;&#x4F4D;&#x5BF9;&#x5355;&#x94FE; DNA &#x7684;&#x6C34;&#x89E3;&#x548C;&#x53CC;&#x9762; DNA &#x7684;&#x5E73;&#x4ED3;&#x3002;Phe(523)&#xFF0C;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x5728; &beta; &#x53D1;&#x5939;&#x4E9A;&#x57FA;&#x63A5;&#x53E3;&#xFF0C;&#x5728;&#x5FAA;&#x73AF;&#x4E2D;&#x5728; dTTP &#x89E3;&#x8026;&#x5408;&#x5230; DNA &#x653E;&#x6599;&#x662F;&#x5173;&#x952E;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;Phe(523) &#x66FF;&#x6362;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;&#x6216;&#x7F2C;&#x6C28;&#x9178;&#x5E9F;&#x9664;&#x8C03;&#x89E3;&#x53CC;&#x9762; DNA &#x4E0A;&#x7684;&#x94A2;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x4F4D;&#x79FB;&#x5408;&#x6210;&#x5C55;&#x5F00; DNA &#x6216;&#x5141;&#x8BB8; T7 &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x3002;&#x4F53;&#x5185;&#x4E92;&#x8865;&#x7814;&#x7A76;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5E26;&#x6709;&#x957F;&#x4FA7;&#x94FE;&#x5728;&#x6B64;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x7684;&#x758F;&#x6C34;&#x6027;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x7684;&#x5FC5;&#x8981;&#x6761;&#x4EF6;&#x3002;T7 &#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x7684;&#x6676;&#x4F53;&#x7ED3;&#x6784;&#xFF0C;&#x5F53;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5728;&#x4E00;&#x4E2A;&#x4E9A;&#x57FA;&#x63A5;&#x53E3;&#xFF0C;Phe(523) &#x57CB;&#x5728;&#x754C;&#x9762;&#x4E2D;&#x3002;&#x4E0D;&#x8FC7;&#xFF0C;&#x5728;&#x672A;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x72B6;&#x6001;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x5B83;&#x662F;&#x66F4;&#x66B4;&#x9732;&#x5728;&#x5916;&#x8868;&#x9762;&#x4E0A;&#x7684;&#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x7ED3;&#x6784;&#x6027;&#x5DEE;&#x522B;&#x8868;&#x660E;&#x8F74;&#x627F; Phe(523) &beta; &#x53D1;&#x5939;&#x8BA4;&#x4E3A;&#x53EF;&#x80FD;&#x4F1A;&#x7ECF;&#x5386;&#x5728;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x6C34;&#x89E3;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5047;&#x5B9A;&#xFF0C;&#x5728; dTTP &#x6C34;&#x89E3;&#xFF0C;Phe(523) &#x4ECE;&#x5185;&#x79FB;&#x52A8;&#x7684;&#x4E9A;&#x57FA;&#x63A5;&#x53E3;&#x5230;&#x90A3;&#x91CC;&#x63A5;&#x89E6;&#x6D41;&#x79BB;&#x5931;&#x6240;&#x8005;&#x8865;&#x5145;&#x94A2;&#x7EDE;&#x7EBF;&#xFF0C;&#x4FBF;&#x4E8E;&#x5C55;&#x5F00;&#x66F4;&#x66B4;&#x9732;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3002;

&#x8026;&#x5408; dTTP &#x4E0E; DNA &#x5C55;&#x5F00;&#x7684; T7 &#x566C;&#x83CC;&#x4F53; DNA &#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x7684;&#x6C34;&#x89E3;&#x3002;

The DNA helicase encoded by gene 4 of bacteriophage T7 assembles on single-stranded DNA as a hexamer of six identical subunits with the DNA passing through the center of the toroid. The helicase couples the hydrolysis of dTTP to unidirectional translocation on single-stranded DNA and the unwinding of duplex DNA. Phe(523), positioned in a Î²-hairpin loop at the subunit interface, plays a key role in coupling the hydrolysis of dTTP to DNA unwinding. Replacement of Phe(523) with alanine or valine abolishes the ability of the helicase to unwind DNA or allow T7 polymerase to mediate strand-displacement synthesis on duplex DNA. In vivo complementation studies reveal a requirement for a hydrophobic residue with long side chains at this position. In a crystal structure of T7 helicase, when a nucleotide is bound at a subunit interface, Phe(523) is buried within the interface. However, in the unbound state, it is more exposed on the outer surface of the helicase. This structural difference suggests that the Î²-hairpin bearing the Phe(523) may undergo a conformational change during nucleotide hydrolysis. We postulate that upon hydrolysis of dTTP, Phe(523) moves from within the subunit interface to a more exposed position where it contacts the displaced complementary strand and facilitates unwinding.

Coupling dTTP hydrolysis with DNA unwinding by the DNA helicase of bacteriophage T7.

L&#x26;#39;h&#xE9;licase d&#x26;#39;ADN cod&#xE9;e par le g&#xE8;ne 4 de bact&#xE9;riophage T7 assemble sur un ADN simple brin en tant que hexam&#xE8;re de six sous-unit&#xE9;s identiques avec l&#x26;#39;ADN passant par le centre du tore. Les couples h&#xE9;licase l&#x26;#39;hydrolyse de dTTP &#xE0; la translocation unidirectionnelle sur un ADN simple brin et le d&#xE9;roulement de l&#x26;#39;ADN double brin. Phe (523), positionn&#xE9; dans une boucle en &#xE9;pingle &#xE0; cheveux &#x3B2;-sous-unit&#xE9; &#xE0; l&#x26;#39;interface, joue un r&#xF4;le cl&#xE9; dans le couplage de l&#x26;#39;hydrolyse de dTTP &#xE0; l&#x26;#39;ADN d&#xE9;roulement. Substitut de Phe (523) par l&#x26;#39;alanine ou la valine abolit la capacit&#xE9; de l&#x26;#39;h&#xE9;licase d&#x26;#39;ADN pour d&#xE9;compresser ou permettre la polym&#xE9;rase T7 de m&#xE9;diation d&#xE9;placement de brin d&#x26;#39;ADN de synth&#xE8;se sur duplex. In vivo des &#xE9;tudes de compl&#xE9;mentation r&#xE9;v&#xE8;lent l&#x26;#39;exigence d&#x26;#39;un r&#xE9;sidu hydrophobe avec des cha&#xEE;nes lat&#xE9;rales longues &#xE0; cette position. Dans une structure de cristal de T7 h&#xE9;licase, lorsqu&#x26;#39;un nucl&#xE9;otidique est li&#xE9;e &#xE0; une sous-unit&#xE9; d&#x26;#39;interface, Phe (523) est enterr&#xE9;e dans l&#x26;#39;interface. Cependant, &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;tat li&#xE9;, il est plus expos&#xE9;e sur la surface ext&#xE9;rieure de l&#x26;#39;h&#xE9;licase. Cette diff&#xE9;rence structurelle sugg&#xE8;re que la &#x3B2;-&#xE9;pingle portant le Phe (523) peut subir un changement conformationnel lors de l&#x26;#39;hydrolyse de nucl&#xE9;otides. On postulat que lors de l&#x26;#39;hydrolyse de dTTP, Phe (523) se d&#xE9;place de l&#x26;#39;int&#xE9;rieur du sous-unit&#xE9; d&#x26;#39;interface &#xE0; une position plus expos&#xE9;e o&#xF9; elle contacte le brin d&#xE9;plac&#xE9; compl&#xE9;mentaires et facilite d&#xE9;vidage.

Couplage hydrolyse DTTP avec l&#x26;#39;ADN de D&#xE9;nouement par le h&#xE9;licase ADN du bact&#xE9;riophage T7

Die DNA-Helicase Gen 4 der Bakteriophage codiert assembliert T7 auf einzeln-angeschwemmte DNA als ein Hexamer sechs identischen Untereinheiten mit der DNA, die durch den Mittelpunkt der Ringkern &uuml;bergeben. Die Helicase Paare die Hydrolyse von dTTP, unidirektionale Translokation auf einzeln-angeschwemmte DNA und das Abrollen von duplex DNA. Phe(523), positioniert in einer &beta;-Haarnadel-Schleife an der Schnittstelle Untereinheit spielt eine Schl&uuml;sselrolle bei der Kopplung der Hydrolysis von dTTP an DNA zu entladen. Ersetzung des Phe(523) durch Alanin oder Valin wird abgeschafft, die F&auml;higkeit der Helicase DNA zu entspannen oder lassen Sie T7-Polymerase, Strang-Weg-Synthese auf duplex DNA zu vermitteln. Erg&auml;nzung der in-vivo-Studien zeigen eine Anforderung f&uuml;r eine hydrophobe R&uuml;ckstand mit langen Seitenketten an dieser Position. Wenn ein Nukleotid an eine Untereinheit-Schnittstelle gebunden ist, ist Phe(523) in einer Kristallstruktur von T7 Helicase innerhalb der Schnittstelle begraben. Im ungebundenen Zustand ist sie jedoch mehr an der Au&szlig;enfl&auml;che der Helicase ausgesetzt. Diese strukturellen Unterschied legt nahe, dass die Lager der Phe(523) &beta;-Haarnadel Konformations&auml;nderungen Abwechslung w&auml;hrend der Nukleotid-Hydrolyse unterziehen kann. Wir postulieren, dass bei der Hydrolyse von dTTP, verschiebt Phe(523) von innerhalb der Untereinheit-Schnittstelle an eine mehr exponierten Position wo es Kontakte den Vertriebenen komplement&auml;ren Strang und Entladen erleichtert.

Kupplung dTTP Hydrolyse mit DNA durch die DNA-Helicase der Bakteriophage T7 entladen.

La DNA elicasi codificata dal gene 4 del batteriofago T7 monta su single-stranded DNA come un hexamer di sei subunit&agrave; identiche con il DNA passando attraverso il centro del toroide. L&#39;elicasi coppie l&#39;idrolisi di dTTP per traslocazione unidirezionale su single-stranded DNA e il ricalcolo del DNA duplex. PHE(523), posizionata in un ciclo di &beta;-hairpin all&#39;interfaccia subunit&agrave;, gioca un ruolo chiave nell&#39;accoppiamento l&#39;idrolisi di dTTP ricalcolo del DNA. Sostituzione di Phe(523) con alanina o valina abolisce la capacit&agrave; di helicase rilassarsi DNA o consentire la T7 polimerasi di mediare la sintesi del filamento-spostamento sul DNA duplex. Complementazione in vivo studi rivela un requisito per un residuo idrofobico con catene laterali lungo in questa posizione. In una struttura di cristallo del T7 elicasi, quando un nucleotide viene associato a un&#39;interfaccia di subunit&agrave;, Phe(523) &egrave; sepolto all&#39;interno dell&#39;interfaccia. Tuttavia, nello stato non associato, &egrave; pi&ugrave; esposta sulla superficie esterna dell&#39;elicasi. Questa differenza strutturale suggerisce che il &beta;-hairpin recanti il Phe(523) pu&ograve; subire un cambiamento conformazionale durante l&#39;idrolisi del nucleotide. Siamo postulare che dopo idrolisi di dTTP, Phe(523) sposta da all&#39;interno dell&#39;interfaccia di subunit&agrave; a una posizione pi&ugrave; esposta dove Contatta il filamento complementare sfollato e facilita la rimozione.

Accoppiamento di dTTP idrolisi con DNA svolgimento dal helicase del DNA del batteriofago T7.

&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;T7&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;4&#x3067;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;DNA&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x3001;&#x30C8;&#x30ED;&#x30A4;&#x30C9;&#x306E;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x3092;&#x901A;&#x308B;DNA&#x306E;6&#x3064;&#x306E;&#x540C;&#x4E00;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;6&#x91CF;&#x4F53;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;DNA&#x306B;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x30AB;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EB;&#x304C;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;DNA&#x306E;&#x5358;&#x65B9;&#x5411;&#x8EE2;&#x5EA7;&#x306B;dTTP&#x306E;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x3068;&#x4E8C;&#x672C;&#x9396;DNA&#x306E;&#x5DFB;&#x304D;&#x623B;&#x3057;&#x3002;&#x30B5;&#x30D6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A7;&#x30A4;&#x30B9;&#x3067;&#x306E;&#x3B2;-&#x30D8;&#x30A2;&#x30D4;&#x30F3;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x5185;&#x306B;&#x914D;&#x7F6E;&#x73FE;&#x8C61;&#xFF08;523&#xFF09;&#x306F;&#x3001;DNA&#x304C;&#x5DFB;&#x304D;&#x623B;&#x3057;&#x306B;dTTP&#x306E;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x3092;&#x30AB;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x304A;&#x3044;&#x3066;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30A2;&#x30E9;&#x30CB;&#x30F3;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30D0;&#x30EA;&#x30F3;&#x3068;Phe&#x306E;&#x4EA4;&#x63DB;&#xFF08;523&#xFF09;&#x306F;&#x3001;DNA&#x3092;&#x30A2;&#x30F3;&#x30EF;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x307E;&#x305F;&#x306F;T7&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x304C;&#x4E8C;&#x672C;&#x9396;DNA&#x4E0A;&#x306E;&#x9396;&#x7F6E;&#x63DB;&#x5408;&#x6210;&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x5EC3;&#x6B62;&#x3002; in vivo&#x3067;&#x306E;&#x76F8;&#x88DC;&#x6027;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3067;&#x9577;&#x3044;&#x5074;&#x9396;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x758E;&#x6C34;&#x6027;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8981;&#x4EF6;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x30B5;&#x30D6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A7;&#x30A4;&#x30B9;&#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;T7&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020;&#x3067;&#x306F;&#x3001;Phe&#x306E;&#xFF08;523&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A7;&#x30A4;&#x30B9;&#x5185;&#x306B;&#x57CB;&#x846C;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x72B6;&#x614B;&#x3067;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x3088;&#x308A;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x5916;&#x8868;&#x9762;&#x306B;&#x9732;&#x51FA;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x9055;&#x3044;&#x306F;&#x3001;Phe&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x3B2;-&#x30D8;&#x30A2;&#x30D4;&#x30F3;&#xFF08;523&#xFF09;&#x306E;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x6642;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;dTTP&#x306E;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;Phe&#x306F;&#xFF08;523&#xFF09;&#x306B;&#x63A5;&#x89E6;&#x907F;&#x96E3;&#x76F8;&#x88DC;&#x9396;&#x3088;&#x308A;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x9732;&#x51FA;&#x3057;&#x305F;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x306B;&#x30B5;&#x30D6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A7;&#x30A4;&#x30B9;&#x5185;&#x304B;&#x3089;&#x79FB;&#x52D5;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x5DFB;&#x304D;&#x623B;&#x3057;&#x304C;&#x5BB9;&#x6613;&#x3068;&#x4EEE;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x3002;

&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;T7&#x306E;DNA&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x3067;&#x30A2;&#x30F3;&#x30EF;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;DNA&#x3068;dTTP&#x306E;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x306E;&#x30AB;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;

4 &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBD80;&#xD638;&#xD654; DNA helicase T7 &#xC5EC; &#xC6D0;&#xD658;&#xD615;&#xC758; &#xC13C;&#xD130;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xC804;&#xB2EC; &#xD558;&#xB294; DNA&#xC640; 6 &#xB3D9;&#xC77C;&#xD55C; subunits&#xC758; hexamer&#xB85C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; DNA&#xC5D0; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Helicase dTTP &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; DNA&#xC5D0; &#xB2E8;&#xBC29;&#xD5A5; &#xC804; &#xD558;&#xC758; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574;&#xC640; &#xC774;&#xC911; DNA &#xD574;&#xC81C; &#xCEE4;&#xD50C;. &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xC774;&#xC2A4;&#xC5D0;&#xC11C; &beta;-&#xBA38;&#xB9AC; &#xD540; &#xB8E8;&#xD504;&#xC5D0; &#xC704;&#xCE58; Phe(523) dTTP &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; DNA &#xD574;&#xC81C;&#xC5D0; &#xCEE4;&#xD50C;&#xB9C1;&#xC5D0; &#xD575;&#xC2EC;&#xC801;&#xC778; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xD558;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4;. &#xC54C;&#xB77C;&#xB2CC; &#xB610;&#xB294; valine phe(523)&#xC758; &#xB300;&#xCCB4; &#xC911;&#xC7AC;&#xC5D0; &#xC774;&#xC911; DNA &#xAC00;&#xB2E5; &#xBCC0;&#xC704; &#xD569;&#xC131; DNA&#xB97C; &#xD574;&#xC81C; &#xD558;&#xAC70;&#xB098; &#xD5C8;&#xC6A9; T7 &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; helicase&#xC758; &#xB2A5;&#xB825;&#xC744; &#xB9D0;&#xC0B4;. Vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCF4;&#xC644;&#xC131; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACF5;&#xAC1C;&#xC758;&#xC774; &#xC704;&#xCE58;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAE34; &#xCE21;&#xBA74; &#xCCB4;&#xC778;&#xC73C;&#xB85C; &#xC18C;&#xC218; &#xC131; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC694;&#xAD6C; &#xC0AC;&#xD56D;. T7 helicase&#xC758; &#xACB0;&#xC815; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0;&#xB294; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xC774;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; Phe(523) &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xC774;&#xC2A4; &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB9E4;&#xC7A5; &#xC774;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xAC83; &#xBCF4;&#xB2E4;&#xB294; helicase&#xC758; &#xC678;&#xBD80; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xB178;&#xCD9C; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xCC28;&#xC774; Phe(523) &#xBCA0;&#xC5B4;&#xB9C1; &beta;-&#xBA38;&#xB9AC; &#xD540; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xC911; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xBC1B;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xB098;&#xC654;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; Dttp&#xC758; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574;&#xB97C; &#xB530;&#xB77C; &#xD558;&#xB294; &#xACF5;&#xC900;, phe(523)&#xC5D0;&#xC11C; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xC774;&#xC2A4; &#xB0B4; &#xC704;&#xCE58;&#xB85C; &#xC774;&#xB3D9; &#xB354; &#xB178;&#xCD9C; &#xC5B4;&#xB514; &#xB09C;&#xBBFC;&#xB41C; &#xBCF4;&#xC644; &#xAC00;&#xB2E5;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xD558; &#xACE0; &#xD574;&#xC81C;&#xB97C; &#xC6A9;&#xC774; &#xD558; &#xAC8C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

DTTP &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xCEE4;&#xD50C;&#xB9C1; DNA T7 &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0;&#xC758; DNA helicase&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD574;&#xC81C;.

El DNA helicasa codificada por el gen 4 del bacteri&#xF3;fago T7 ensambla en una sola cadena de ADN como un hex&#xE1;mero de seis subunidades id&#xE9;nticas con el ADN que pasan por el centro del toroide. Las parejas helicasa la hidr&#xF3;lisis de dTTP a la translocaci&#xF3;n unidireccional en una sola cadena de ADN y la anulaci&#xF3;n de ADN d&#xFA;plex. Phe (523), colocado en un bucle de &#x3B2;-horquilla en la interfase subunidad, juega un papel clave en el acoplamiento de la hidr&#xF3;lisis de dTTP para la anulaci&#xF3;n de ADN. La sustituci&#xF3;n de Phe (523) con alanina o valina suprime la capacidad de la helicasa para relajarse ADN o permitir polimerasa T7 para mediar en el cap&#xED;tulo de desplazamiento s&#xED;ntesis en el ADN d&#xFA;plex. In vivo estudios de complementaci&#xF3;n revelan un requisito para un residuo hidrof&#xF3;bico con cadenas laterales largas en esta posici&#xF3;n. En una estructura cristalina de T7 helicasa, cuando un nucle&#xF3;tido est&#xE1; enlazado a un interfaz de subunidad, Phe (523) est&#xE1; enterrado dentro de la interfaz. Sin embargo, en el estado no unido, que est&#xE1; m&#xE1;s expuesta en la superficie exterior de la helicasa. Esta diferencia estructural sugiere que la &#x3B2;-horquilla teniendo la Phe (523) puede someterse a un cambio conformacional en la hidr&#xF3;lisis de nucle&#xF3;tidos. Postulamos que en la hidr&#xF3;lisis de dTTP, Phe (523) se mueve desde la interfaz de la subunidad a una posici&#xF3;n m&#xE1;s expuesta donde sus contactos la hebra complementaria desplazada y facilita desenrollado.

Arkadiusz W. Kulczyk

Harvard Medical School

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion