Uma das características únicas do tRNA é a presença de bases modificadas. Em alguns tRNAs, as bases modificadas representam quase 20% do total das bases da molécula. Juntas, estas bases invulgares protegem o tRNA da degradação enzimática por RNases.

Cada uma destas modificações químicas é realizada por uma enzima específica, pós-transcrição. Todas estas enzimas têm especificidades únicas para bases e locais. A metilação, a modificação química mais comum, é realizada por pelo menos nove enzimas diferentes, com três enzimas dedicadas à metilação da Guanina em diferentes posições.

A natureza e a posição destas bases modificadas são específicas das espécies. Assim, existem várias bases que são exclusivas de eucariotas ou procariotas. Por exemplo, a tiolação da Adenina só é observada em procariotas, enquanto que a metilação da citosina é restrita a eucariotas. No geral, os tRNAs eucarióticos são modificados em maior medida do que os dos procariotas.

Embora a natureza das modificações possa variar, algumas regiões do tRNA são sempre fortemente modificadas. Cada uma das três regiões de stem-loop ou “braços'' do tRNA, tem bases modificadas que servem para finalidades únicas. O braço de TΨC, cujo nome vem da presença dos nucleótidos Timina, Pseudouridina e Citosina, é reconhecido pelo ribossoma durante a tradução. O braço DHU ou D que contém a pirimidina modificada dihidrouracilo, serve como um local de reconhecimento para a enzima aminoacil-tRNA sintetase, que catalisa a adição covalente de um aminoácido ao tRNA. O loop anticodão tem muitas vezes uma base de Quenina, que é uma Guanina modificada. Esta base cria um par de Wobble com a sequência de codão no mRNA, ou seja, forma um par de bases que não segue as regras de pares de bases de Watson-Crick. Normalmente, um tRNA liga-se ao mRNA mais “frouxamente” na terceira posição do codão. Isto permite vários tipos de emparelhamento de bases não Watson–Crick ou bases Wobble na terceira posição do codão. Observou-se que a presença de Quenina na primeira posição do anticodão, que emparelha com a terceira posição do codão, melhora a precisão de tradução do tRNA.