Iniciar a tradução é complexo porque envolve múltiplas moléculas. O tRNA iniciador, subunidades ribossómicas, e factores de iniciação eucariótica (eIFs) são todos necessários para se juntarem ao codão de iniciação do mRNA. Este processo consiste em vários passos que são mediados por diferentes eIFs.

Primeiro, o tRNA iniciador deve ser selecionado a partir do stock de tRNAs de alongamento pelo factor de iniciação eucariótico 2 (eIF2). O tRNA iniciador (Met-tRNAi) tem elementos de sequência conservados, incluindo bases modificadas em posições específicas. Isto torna o Met-tRNAi diferente de outros

tRNAs que transportam Metionina.

Em seguida, o complexo ternário eIF2/GTP/Met-tRNAi e outros eIFs ligam-se à subunidade ribossomal pequena para formar um complexo de pré-iniciação 43S. Antes de o complexo de pré-iniciação se ligar ao mRNA, para garantir que um mRNA corretamente processado é traduzido, a célula usa o reconhecimento inicial de 5’-cap do mRNA pela subunidade eIF4E do eIF4F.

A maioria dos mRNAs eucarióticos são monocistrónicos, ou seja, codificam apenas uma única proteína. Assim que o complexo de pré-iniciação estiver ligado ao mRNA, o complexo avança para procurar o primeiro tripleto AUG, que está normalmente 50–100 nucleótidos a jusante da 5′-cap terminal.

Durante esta avaliação, os nucleótidos adjacentes ao codão inicial afectam a eficiência do reconhecimento de codões. Se o local de reconhecimento for substancialmente diferente da sequência de reconhecimento consenso (5ʹ-ACCAUGG-3ʹ), o complexo de pré-iniciação pode saltar o primeiro tripleto AUG no mRNA e continuar à procura até ao AUG seguinte. Este fenómeno é conhecido como “leaky scanning.” Vários vírus, como o papilomavírus humano, usam o leaky scanning como o mecanismo predominante durante a tradução. Outras células também o utilizam frequentemente para produzir múltiplas proteínas a partir da mesma molécula de mRNA.

Ribossomas bacterianos podem juntar-se diretamente em um codão de iniciação que se encontra vários nucleótidos a jusante da sequência de Shine-Dalgarno. Assim, uma única molécula de mRNA bacteriano pode codificar para várias proteínas diferentes, o que torna os mRNAs bacterianos policistrónicos.