O splicing alternativo de RNA é o splicing regulado de exões e intrões para produzir mRNAs maduros diferentes a partir de um único pré-mRNA. Ao contrário do splicing constitutivo onde um único gene produz um único tipo de mRNA, o splicing alternativo permite que um organismo produza múltiplas proteínas a partir de um único gene e desempenha um papel importante na diversidade proteica.

Existem cinco tipos de splicing alternativo de RNA que variam de acordo com as formas como os segmentos de pré-mRNA são removidos ou mantidos no mRNA maduro. O primeiro tipo é o salto de exões onde alguns exões, juntamente com todos os intrões, são seletivamente removidos. Este é o tipo o mais proeminente de splicing alternativo observado nos seres humanos. O segundo tipo, retenção de intrões, ocorre quando um intrão específico é mantido no mRNA maduro enquanto que os outros são removidos. Este tipo de splicing é mais comum nas plantas do que em seres humanos. No terceiro e quarto tipos de splicing alternativo, locais de splicing 5' ou 3’ alternativos são selecionados em exões específicos, respectivamente. Esta alteração em locais de splicing 5' e 3' encurta ou alonga o exão, resultando em diferentes tipos de mRNAs maduros. Este tipo de splicing alternativo ocorre tanto em humanos como em plantas. O último e mais raro tipo de splicing alternativo de RNA são os exões mutuamente exclusivos onde de dois exões, somente um é mantido enquanto que o outro é removido.

O splicing alternativo é regulado por diferentes elementos de ação cis e factores de ação trans. Elementos de ação cis são sequências de DNA que estão presentes perto de genes estruturais, enquanto que factores de ação trans são outras moléculas que se ligam ao DNA. No splicing alternativo de RNA, os elementos de ação cis consistem principalmente em potenciadores e silenciadores de splicing específicos de exões e intrões. Os factores de ação trans, como as proteínas SR (factores de splicing ricos em serina/arginina), podem ligar-se aos potenciadores de splicing de exões ou intrões para ajudar a maquinaria de splicing a reconhecer locais de splicing fracos. Por outro lado, proteínas como ribo­­nucleoproteínas nucleares heterogéneas ligam-se aos silenciadores de splicing de exões ou intrões para evitar o splicing, mascarando os locais de splicing do spliceossoma.

O splicing alternativo de RNA é comum em eucariotas mais elevados. Quase 95% dos genes humanos passam por splicing alternativo; portanto, defeitos na maquinaria podem prejudicar significativamente a função de órgãos e resultar em cancro e outras doenças, incluindo perturbações neurológicas e cardíacas. Em humanos, mutações que afectam diretamente o splicing de pré-mRNA são responsáveis por mais de 15% das doenças genéticas, como a progeria Hutchinson-Gilford e a beta-talassemia.