Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

Resumo

Este vídeo mostra como morfolino ou mRNA podem ser injetadas em embriões de peixe-zebra na fase de uma célula para diminuir ou aumentar o nível de produtos de genes específicos durante o desenvolvimento subseqüente.

Resumo

Uma das vantagens de estudar zebrafish é a facilidade e velocidade de manipular os níveis de proteínas no embrião. Morpholinos, que são oligonucleotídeos sintéticos com complementaridade antisense para RNAs alvo, podem ser adicionados para o embrião para reduzir a expressão de um produto gene particular. Por outro lado, mRNA processados ​​podem ser adicionados para o embrião para aumentar os níveis de um produto gene. O veículo para a adição ou mRNA ou morfolino a um embrião é microinjeção. Microinjeção é eficiente e rápida, permitindo a injeção de centenas de embriões por hora. Este vídeo mostra todos os passos envolvidos na microinjeção. Resumidamente, os ovos são recolhidos imediatamente após terem sido definidos e alinhados contra uma lâmina de microscópio numa placa de Petri. Em seguida, uma agulha de ponta fina carregado com material de injecção é conectado a um microinjetor e uma fonte de ar, e os controles microinjetor são ajustados para produzir um volume de injeção desejável. Finalmente, a agulha é mergulhado em gema do embrião e do morfolino ou mRNA é expulso.

Protocolo

Parte 1: A produção de ovos e cobrança

1. A noite antes da injeção, os peixes criados em tanques de criação com divisórias no lugar. Para aumentar a produção total de ovos, peixes pode ser configurado em uma proporção de duas fêmeas para um macho, se desejar.
2. Na manhã seguinte, depois de as luzes da sala ligar, puxe os divisores de vários tanques e permitir a cerca de 20 minutos de tempo de acasalamento imperturbável.
3. Usando um filtro, recolher os ovos das gaiolas de criação e enxaguar com água de ovo. Despeje os ovos em uma placa de Petri com água do ovo e remova ovos não fertilizados e detritos com uma pipeta. Os peixes podem ser reagrupados em tanques maiores para produzir rodadas adicionais de ovos para injeção. Ajustar o tempo de coleta de ovos para permitir número máximo de ovos a ser produzida sem deixá-los passar o estágio unicelular.
4. Coloque uma lâmina de microscópio invertido na tampa de uma placa de Petri de 100mm. Use uma pipeta para alinhar os ovos contra a lateral da lâmina formando uma única coluna. Retirar a água em excesso do ovo a partir do slide pressionando uma Kimwipe contra o lado oposto os ovos. (Figura 1A)

Parte 2: Agulha puxando, carregamento e preparação

1. Com um puxador de micropipeta, puxe um copo OD 1,0 milímetros capilar em duas agulhas e armazenar em uma placa de Petri 150 milímetros colocando sobre rampas bolinha de borracha. Agulhas pode ser puxado com antecedência.
2. Agulha de protelar o com 3 mL de material de injecção utilizando uma pipeta microloader. Agitar o bolo em direção à ponta da agulha até que haja poucas ou nenhuma bolha restantes.
3. Ligue a fonte de ar e microinjetor. Inserir a agulha no microinjetor e garantir uma perfeita vedação dentro da caixa. Verifique se o micromanipulador está em uma posição adequada para permitir uma ampla gama de movimentos e de ajuste. Traga a ponta da agulha no plano de visão do microscópio de alta fora do palco, e concentrar-se na região mais fina da ponta. Use uma pinça afiada para beliscar fora a agulha em um ponto que deixa a agulha fina o suficiente para furar o córion e gema, mas ainda capaz de fornecer um tamanho consistente talão. Uma gota de óleo mineral em um micrômetro pode ser usado para calcular o volume de cada injeção. Quando injetado no petróleo, um cordão com um diâmetro de 0,1 mm contém 500 pL de material de injeção (figura 1B); volumes de injeção de 500 pL ou 1nL são normalmente utilizados. Pressione o pedal e monitorar o tamanho do grânulo ao aparar a agulha e ajustando a pressão de injeção, conforme necessário. Volumes de injeção ideal vai preencher cerca de 10% do volume de ovos. A qualidade da ponta da agulha é crucial para ambos, a facilidade da injeção ea qualidade e consistência dos resultados.

Parte 3: Injeção

1. Garantir os embriões não se desenvolveram após o estágio de quatro células. Idealmente, os embriões devem estar no estágio de uma célula.
2. Abaixe a agulha em direção à coluna de ovos, segurando o prato no lugar com a mão oposta.
3. Pierce superfície do córion e introduzir a gema de um só golpe suave enquanto assiste a qualquer esmagamento ou rompimento do saco vitelino. Injetar o material de injecção a gema (figura 1C). Evite injetar bolhas de ar ou esticar a gema ou como pode ser letal para o embrião. Trabalhando para baixo da linha, ajustar a pressão conforme necessário para manter um tamanho consistente talão e, usando uma ponteira, remover os ovos não fertilizados que parecem ou são destruídas durante o processo de injeção.
4. Depois de completar uma coluna de ovos, use um jato suave de água do ovo para mover os ovos injetado em uma placa de Petri limpa. Repita conforme necessário. Manter vários embriões uninjected como controle. No final do dia, remova embriões mortos e gravar o número de embriões injetados. Substitua a água dos ovos no prato periodicamente para reduzir a chance de infecção.

Parte 4: Os resultados representativos

Dependendo do que está sendo injetado, os embriões podem sobreviver a uma taxa inferior do que seus irmãos uninjected. Felizmente, é fácil para injetar um grande número deles, então isso raramente é um problema. É normal que morphants para expor o desenvolvimento ligeiramente atrasado.

Para ilustrar os resultados da microinjeção, utilizamos esse protocolo para manipular os níveis da proteína Coração de Vidro (Heg). Heg é uma proteína transmembrana necessário para o desenvolvimento normal do coração. Na sua ausência, os embriões se desenvolvem corações com extensões entrada gigante e câmaras ^1. Injetamos dois morpholinos anteriormente não descritas contra HEG, heg_e3i3_egfr1 e heg_e4i4_egfr2, em uma concentração de 500 mM. Menos 2 dias após a fertilização, os controles irmão uninjected aparecem normal, como esperado (Figura 2A e B). Embriões injetados com heg_e3i3_egfr1 têm edema cerebral (figura 2C). Embora os corações da maioria destes morphants ter alterado a morfologia, suas câmaras são normalmente de tamanho (figura 2D). Embriões injetadoscom heg_e4i4_egfr2 apresentam defeitos cardíacos variável. Alguns parecem normais, enquanto outros têm folhetos grande influxo e átrios moderadamente aumentado (Figura 2E e F). O mutante HEG, conforme relatado anteriormente ^1, tem uma via de entrada extremamente alargada e do átrio (Figura 2G e H).

Também injetou embriões tipo selvagem com 400 mRNA ng / mL transcrito de full-length HEG cDNA. Enquanto os controles uninjected desenvolver normalmente (figura 3A e B), embriões injetados com HEG mRNA exibem um espectro de fenótipos que vão desde a aparência do tipo selvagem para ciclopia grave, encurtamento do eixo do corpo principal, necrose da cabeça e do corpo, e defeitos da linha média (figura 3C e D).

Figura 1. Embriões a ser injetado estão alinhados contra uma lâmina de microscópio numa placa de Petri (A). Volume de injeção é determinada pela injeção em óleo mineral colocado em um micrômetro. Um volume de injeção de 500 pL, que é comumente usado, tem um diâmetro de 0,1 mm (B). Imediatamente após a injeção, o morfolino ou mRNA é visível como uma mancha pontuam na gema (C).

Figura 2. Em 2 dias após a fertilização, os embriões não têm defeitos uninjected bruto (A) ou fenótipo coração (B). Embriões injetados com a heg_e3i3_egfr1 morfolino têm edema cerebral (C, seta), mas as câmaras cardíacas de tamanho normal (D). Alguns embriões injetados com a heg_e4i4_egfr2 morfolino têm extensões entrada alargada e átrios (E, F). HEG mutantes têm extensões entrada severamente alargada e átrios (G, H). (A), (C), (E) e (G) são 4x imagens DIC; (B), (D), (F) e (H) são 20x imagens DIC. um átrio = it = via de entrada.

Figura 3. Às 24 horas após a fertilização, os embriões uninjected ter um corpo longo e reto, sem necrose ou defeitos da linha média (A) e dois olhos bem definidos com um tubo neural entre eles (B). Alguns embriões injetados com mRNA HEG, em contrapartida, exibem um eixo do corpo encurtado, necrose, somitos deformado (C), e ciclopia (D). (A) e (C) são 4x imagens DIC; (B) e (D) são 20x imagens DIC.

Discussão

Um dos pontos fortes do sistema de modelo peixe-zebra é a facilidade com que produtos de genes específicos podem ser adicionados ou eliminados do embrião por microinjeção. Para ubiquitously superexpressam uma proteína particular, a codificação de mRNA é injetado na gema na fase 1-célula. Durante o desenvolvimento posterior do embrião, o RNA é distribuído por todo o organismo e traduzido. Por outro lado, para eliminar uma determinada proteína, morpholinos são usados. Morpholinos são oligonucleotídeos sintéticos projetados com a complementaridade de RNAs antisense específico. Como mRNAs, morpholinos são injetados na gema na fase 1-célula. Dentro do embrião que se ligam RNAs seu alvo, prevenindo tradução.

A principal modificação que precisa ser feita para cada morfolino ou mRNA é a concentração de material injetado. Uma concentração demasiado elevada de qualquer morfolino ou mRNA pode causar toxicidade não-específica, enquanto cada morfolino deve ser testado empiricamente para determinar a concentração ideal, normalmente morfolino concentrações entre 200 e 500 mM mM derrubar a atividade do gene de forma eficaz, sem causar defeitos não-específica. O tamanho exato da abertura da agulha não é crucial. Dentro de uma gama de tamanhos de agulha, pressão de injeção e tempo de injeção pode ser ajustado para produzir um bolo de o volume correto.

Morpholinos têm muitas aplicações, incluindo a dissecção funcional de domínios dentro de uma proteína. Quando se destinar a meta específica exon-intron cruzamentos, morpholinos impedirá splicing ocorra lá. Nós examinamos os efeitos de duas morpholinos que se ligam exon-intron junções na pré-mRNA de HEG. O heg_e3i3_egfr1 morfolino liga a junção entre exon 3 e intron 3, impedindo a maquinaria de splicing do exon 3 incorporando em transcrições maduro. O heg_e4i4_egfr2 morfolino semelhante remove exon 4. Ambos os exons 3 e 4 codificam domínios contendo EGF-like repete. Alguns embriões injetados com heg_e4i4_egfr2 moderadamente fenocópia o mutante; novos experimentos serão necessários para entender o papel do exon 4 Heg no desenvolvimento do coração. Surpreendentemente, os embriões injetados com heg_e3i3_egfr1 têm edema cerebral, uma característica não observada em mutantes HEG. Isto pode ser devido à capacidade de morpholinos para ligar transcrições materna que não seria afetada em mutantes zigóticos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI 100
Micromanipulator	Tool	Narishige International	MN 153
Needle Puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P 97
Glass Capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100 F6
Microloader Pipettes	Tool	Eppendorf	5242956.003
Needle Holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH310