Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 3

Resumo

Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 3 descreve o processo de rotulagem fluorescente do RNA amplificado a partir do host e as amostras virais por acoplamento alílico amino de corantes. Parte 3 de 3.

Resumo

A família

Protocolo

Parte 1: ARNA rotulagem: acoplamento alílico amino dos corantes

1. Adicionar 1μg das amostras em tubos de microcentrífuga ARNA 1,5 ml.
2. Vácuo seco as amostras em fogo baixo ou nenhum até que estejam completamente secos. Cap cada tubo assim que estiver seca - não overdry!
3. Adicionar tampão de acoplamento 9μl a cada tubo e ressuspender o ARNA suavemente vórtex por 1 minuto. Centrifugar brevemente para coletar a amostra no fundo do tubo, e depois deixar a amostra sentar no gelo.
4. Adicionar 22μl DMSO qualidade alta a cada tubo de Cy3 ou Cy5 corante. Um tubo de tinta é suficiente para duas amostras. O corante é Cy3 para a rotulagem suas amostras de referência, e os corantes Cy5 é para a rotulagem de amostras de teste.
5. Vortex os corantes para misturar bem. Manter os corantes no escuro até que esteja pronto para uso. Não preparar tintura antes de 1 hora antes de usar. Verifique se não há água fica na mistura de corante / DMSO em qualquer ponto.
6. Adicionar 11μl do corante DMSO / Cy preparados para cada amostra. Misture bem em vórtice suavemente.
7. Incubar durante 30-45 minutos em temperatura ambiente. Cobrir as amostras com papel alumínio ou mantê-los em uma gaveta para minimizar a exposição à luz.
8. Após a incubação, adicionar 4.5μl hydroxlyamine a cada amostra para saciar a reação. Misture bem em vórtice suavemente.
9. Incubar por mais 15 minutos em temperatura ambiente. Cobrir as amostras com papel alumínio ou mantê-los em uma gaveta para minimizar a exposição à luz.

Parte 2: rotuladas ARNA clean-up

1. Vortex as contas RNA ligação rapidamente para obter uma mistura mesmo antes do uso.
2. Preparar a mistura ARNA Binding à temperatura ambiente. (Tabela 1)
3. Misture bem em vórtice.
4. Aliquote o tampão de eluição ARNA em um tubo de 1,5 ml e incubar a 50-60 ° C durante pelo menos 10 minutos.
5. Adicionar 70μl da mistura ARNA vinculativo para cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes.
6. Transferência das amostras da placa de PCR para uma placa de 96 poços de fundo redondo.
7. Adicionar 50μl de isopropanol 100% a cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes.
8. Agitar suavemente a placa em agitador orbital por pelo menos 2 minutos para misturar as amostras.
9. Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. Deixar a placa no stand até que a mistura torna-se transparente e os cordões de ligação a peletizada.
10. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante. O sobrenadante deve ser um brilhante rosa ou um azul brilhante neste momento devido à moléculas de corante não incorporado.
11. Retire a placa do suporte magnético.
12. Adicionar 100μl de solução de lavagem ARNA a cada poço e agitar a placa por 1 minuto no agitador orbital a uma velocidade moderada. Contas não pode se dispersar totalmente nesta etapa.
13. Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas.
14. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante.
15. Retire a placa do suporte magnético.
16. Repita a lavagem de cada vez ² º com 100μl de solução de lavagem ARNA.
17. Após a lavagem ² º, seca as contas agitando a placa por 1 minuto no agitador orbital à velocidade máxima. Não overdry as amostras!
18. Eluir a ARNA dos grânulos adicionando 20μl tampão de eluição ARNA pré-aquecido para cada amostra.
19. Agitar vigorosamente a placa no agitador orbital por 3 minutos, em seguida, verifique se a esferas magnéticas estão totalmente dispersos. Se não, continue a tremer.
20. Uma vez que a esferas magnéticas têm totalmente disperso, mova a placa a um suporte magnético para capturar as esferas magnéticas. O sobrenadante contém a limpo, amostras ARNA rotulados, e deve ser uma pálida cor de rosa ou um azul pálido.
21. Transferir cuidadosamente o ARNA eluída a uma placa de PCR nova (ou tubos de PCR).
22. (Passo opcional) Verificar a concentração de RNA e da quantidade de corante nas amostras medindo 1.5μl em um espectrofotômetro NanoDrop usando o módulo Microarray.
23. Imediatamente hibridizar o ARNA rotulados em uma plataforma de microarray de sua escolha ou, alternativamente, você pode armazenar o ARNA rotulados a -80 ° C até que esteja pronto para a hibridização.

Tabela 1 Mix ARNA Binding

Reagente	Montante para uma reação
Beads RNA Binding *	10μl
Bead * Solução ressuspensão	4μl
Isopropanol 100% **	6μl
ARNA Concentrado de tampão de ligação	50μl

* Mix as contas de ligação com a RNAtalão solução ressuspensão primeiro
** Adicione o isopropanol e misturar bem antes de adicionar o ARNA concentrado de tampão de ligação.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Passos crítica

Ao realizar o acoplamento amino alil, é fundamental para voltar a suspender o corante em DMSO em breve (menos de 1 hora) antes de acoplamento e garantir que não haja água fica na mistura de corante / DMSO, como ele vai reagir com o grupo ativo no corante. Não overdry o RNA (podem ser secas até 1-2uL ao invés de completamente seca), e ressuspender bem no buffer de acoplamento. Durante a reação de acoplamento, manter a reação no escuro, com flicking ocasionais e spin do...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack	Reagent	GE Healthcare	RPN5661	Contains both Cy3 and Cy5 dyes
NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer	Other	NanoDrop	ND-1000	Or equivalent spectrophotometer