Homarus Americanus Stomatogastric Dissecção do Sistema Nervoso

Resumo

Descrevemos a dissecção fina do sistema nervoso stomatogastric do estômago da lagosta americana ( Homarus americanus).

Resumo

Com o objetivo de entender como os sistemas nervosos produzem atividade e respondem ao ambiente, os neurocientistas vez para modelar sistemas que exibem a atividade de interesse e são acessíveis e passíveis de métodos experimentais. O sistema nervoso stomatogastric (STNS) da lagosta americana (

Protocolo

Antes de começar este protocolo o estômago da lagosta deve ser retirado do animal e preparado como descrito no artigo companheiro Jove (Bierman & Tobin, 2009). A maioria das etapas descritas abaixo devem ser realizados sob um microscópio de dissecação.

Parte I-Isolar os gânglios comissural

1. Orientar o prato de modo que a extremidade anterior (pelo lábio) está longe de você e da extremidade posterior (pelo piloro) é para você.
   
   
2. Garantir que o estômago é preso para que ele fique o mais plano possível no prato.
   1. Pin para o esôfago em cada lado do lábio.
   2. Se necessário, reorganize os outros pinos colocados durante a dissecção macroscópica.
3. Remova a hipoderme.
   1. Agarre a hipoderme perto do gm2/gm3 músculos, retire-os músculos e puxe na direção anterior.
   2. Separar os hipoderme da gordura subjacente cortando as ligações. Maior utilização de cuidados ao redor da artéria central, que inclui uma parte fundamental do sistema nervoso stomatogastric. Deixe a hipoderme intacta dentro de cerca de um raio de 0,5 cm do gânglio stomatogastric, que fica entre os músculos GM1b.
   3. Cortadas hipoderme separados.
4. Separar o cérebro do tecido subjacente.
   1. Identificar os dois grandes nervos comissural esse projeto bilateral da parte anterior do cérebro para os gânglios comissurais na porção anterior do estômago.
   2. Deixando estes nervos intactos, levante cuidadosamente o cérebro com uma pinça e corte para separar o cérebro do resto do tecido. Tenha cuidado como você fazer isso, como o nervo stomatogastric fica embaixo do cérebro e deve ser mantida intacta.
5. Separar os gânglios comissural de ao redor do tecido.
   1. Siga um dos nervos comissural a um dos gânglios comissural.
   2. Identificar o íon e filho - estes nervos devem permanecer intactos. O gânglio comissural terá muitos nervos que saem. Cortar a maioria deles (exceto o íon e filho), mas deixe um nervo ligado extras para manter o gânglio comissural no lugar quando você terminar a dissecção.
   3. Repita com o gânglio outros comissural.
6. Limpe o íon e filho de lateral para medial. Deixe o nervo labial intacta para ancorar o sistema nervoso para o estômago. O gânglio de esôfago fica eram os s ion se cruzam. Você pode limpar abaixo dela, agarrando o nervo ventricular inferior e puxando para cima a cortar por baixo.

Parte II-Isolar o gânglio Stomatogastric (STG) e os nervos restantes.

7. Separar os STG de ao redor do tecido.
   1. O STG fica dentro de uma artéria que corre entre os músculos GM1b e para baixo para os músculos gm2a, b. Olhe para a extremidade cortada da artéria perto os músculos gm2a, b.
   2. Puxe a extremidade cortada da artéria para cima e anteriormente, para expor a DVN. Continue puxando para cima até chegar ao nível da hipoderme restantes. Uma vez separadas, a artéria pode ser cortado para o nível em que toca a hipoderme restantes.
   3. Cortar o retalho do músculo que estava situada na tribuna da lagosta.
   4. Levante a hipoderme acima da artéria, observando que a artéria faz um túnel dentro da gordura acima do STG. Coloque uma lâmina de sua tesoura dentro da artéria e cortar o músculo acima dela. Verifique se você pode ver o DVN como você cortar para ter certeza de que você está com segurança acima da STG. Continue o corte anterior, seguindo a artéria. Como você corte acima do STG, você será capaz de ver o stn emanando anteriormente da STG e para baixo mergulho para dentro do músculo. Continue o corte anteriormente ao separar totalmente o músculo acima do STG.
   5. Limpar qualquer tecido longe da STN.
8. Separar os s AGN do tecido circundante. (Mesmo se você não planeja gravar a partir da AGN, você vai precisar de uma porção do nervo intacto para fixar para baixo o gânglio para gravações intracelular.)
   1. Para ver melhor o s AGN, remover o restante hipoderme e uma fina camada do músculo subjacente.
   2. Imediatamente posterior à STG, identificar um túnel escuro na gordura e músculos de cada lado da DVN.
   3. Vara uma lâmina de tesoura dentro do túnel e cortar o tecido acima do nervo. Continue cortando lateralmente, seguindo o nervo, para isolá-lo. (Dois milímetros é suficiente para a pinagem do gânglio, mas expor pelo menos 5 mm da AGN, se você pretende gravar a partir dele.)
   4. Destacar a AGN do músculo que inerva cortando as ligações.
   5. Repita no outro lado para isolar a AGN outros.
   6. Uma vez que ambos s AGN foram dissecados, cortar todos os músculos e tecido conectivo do STG para o estômago.
9. Isolar o s. mvn Eles são um par bilateral de pequenos nervos que se ramificam do lvn e atravessando lateralmente embaixo da gordura.
   1. Usar tesoura ou duas pinças para cortar a gordura de um lado da DVN, perto de onde se ramifica em duas lvn s. Aqui estão longe do s mvn e não risco cortá-las.
   2. Levante a camada de gordura, e identificar os debaixo mvn pequeno. Esses nervos executar medial para lateral posterior apenas ao nível dos músculos GM1b.
   3. Remover a camada de gordura acima do mvn, deixando o nervo intacto para agora assim que não vai se tornar tangled. Você vai cortar a sua extremidade lateral de fora do estômago no final da dissecção.
   4. Repita o processo do outro lado para isolar o mvn outros.
10. Isolar o s lvn e nervos posterior.
    1. Partida onde o ramo lvn s lateralmente fora da DVN, siga um lvn cortando a gordura acima dela. Dependendo da preparação, por vezes, toda a camada de gordura acima do nervo pode ser puxado para fora.
    2. Continue revelando a lvn até o ponto onde os ramos psn off.
11. Isolar o pyn.
    1. Localize o pyn, é um nervo que viajam posteriormente sobre o piloro.
    2. Remover a fina membrana que cobre a região.
    3. Isolar o pyn cortando uma pequena secção do piloro, anexado ao pyn.
    4. Levante cuidadosamente a secção do piloro e cortar o tecido de cada lado do pyn até chegar ao ramo que atribui ao PDN.
12. Isolar o pdn.
    1. Localize o pdn, é um nervo viajando posteriormente para o músculo dilatador pilórica.
    2. Corte uma pequena parte do músculo dilatador pilórica, anexado ao PDN.
    3. Levante cuidadosamente a secção do músculo pilórico dilatador, cortar o tecido de cada lado do pdn até chegar ao ramo que atribui à pyn.
13. Isolar o lvn ventral, que liga o pyn e pdn ao lvn.
    1. No ponto de ramificação triangular onde o pyn e pdn conectar à lvn ventral, isolar qualquer pequena parte do nervo que se ramifica a lvn ventral, como o vpln. Este será usado como um identificador para puxar o lvn ventral.
    2. Levante a alça e cortar o tecido de cada lado do lvn ventral, trabalhando na direção anterior até chegar ao ponto onde os ramos psn off.
14. Repita os passos 10-13 para isolar os nervos lvn e posterior do outro lado.
    
    
15. Retire o sistema nervoso stomatogastric do estômago.
    1. Para remover completamente a lvn do estômago, puxe a psn e cortar todos os tecidos e nervos ligados ao lvn lvn e ventral, exceto para o pdn e pyn. Repita o processo do outro lado.
    2. Corte a extremidade lateral de cada mvn. Levante a extremidade lateral e corte quaisquer anexos estranhos entre o nervo eo tecido subjacente estômago.
    3. Na extremidade anterior, cortar quaisquer anexos estranhos para os gânglios comissural, e cortar o nervo vestibular em cada lado.
    4. Visualmente a varredura do sistema nervoso stomatogastric sistema para identificar e depois cortar quaisquer anexos adicionais ao tecido do estômago.
    5. Agarre-se a extremidade anterior de ambos os nervos comissural, acima dos gânglios comissural, e descasque o sistema nervoso stomatogastric fora do estômago e movê-lo para o lado do prato. Ao fazer isso, cortar quaisquer anexos restantes para libertar o sistema nervoso.
16. Preparar o prato Sylgard pequeno.
    1. Passe um pouco de tecido do estômago completamente na superfície do Sylgard no prato pequeno. Isto irá diminuir a hidrofobicidade do Sylgard, de modo que a solução salina irá distribuir uniformemente em todo o prato.
    2. Enxaguar e encher o prato Sylgard com soro fisiológico gelado.
17. Transferir o sistema nervoso para o prato preparado por Sylgard agarrando as extremidades anterior de ambos os nervos comissural, levantando o sistema nervoso fora do grande prato, e estabelece-lo no pequeno prato.
    
    
18. Pin do STNS no prato pequeno, utilizando uma combinação de pinos Minuten e pinos mais finos corte de fio de tungstênio.
    1. Garantir que a preparação é o lado dorsal, verificando que o nervo ventricular inferior está apontando longe do Sylgard.
    2. Remover o cérebro e os nervos pin comissural.
    3. Puxe o sistema nervoso apertado e plana, puxando cada um dos s psn posteriormente e lateralmente, e fixando-os para baixo.
    4. Retire o músculo dilatador pilórica do s pdn, e fixar o s. pdn
    5. Remova osegmento pilórica do s pyn, e fixar o s. pyn
    6. Identificar qualquer nervos remanescentes isolados, como os nervos labial, o s mvn e AGN s.
19. Desheath o STG.
    1. Garantir a STG fica encostado ao Sylgard e mantida tensa por lateral AGN s, a stn anterior e posterior DVN.
    2. Providenciar a iluminação para permitir a visualização dos axônios dentro da DVN.
    3. Usando um pequeno alfinete ou agulha de tungstênio fino, faça um pequeno furo raso na bainha ao redor da DVN, apenas posterior à STG.
    4. Puxe a agulha através da DVN, dorsal para os axônios, para criar uma lágrima horizontal na bainha do nervo.
    5. Agarre a retalho de bainha do nervo posterior à STG anteriormente e puxe para remover a bainha do lado dorsal do STG.

Abreviaturas:
STNS	Sistema nervoso Stomatogastric
STG	Gânglio Stomatogastric
CoG	Gânglio comissural
stn	nervo stomatogastric
mvn	ventricular nervo medial
íon	esofágico inferior do nervo
filho	nervo esofágico superiores
AGN	nervo gástrica anterior
DVN	nervo dorsal ventricular
lvn	nervo ventricular laterais
psn	nervo posterior do estômago
vpln	nervo posterior ventral lateral
pyn	nervo pilórica
pdn	nervo dilatador pilórica

Discussão

A anatomia do estômago lagosta e STNS tem sido bem descrita anteriormente ^5,6, e as variações deste procedimento dissecção têm sido utilizados em numerosos estudos. Recomendamos familiarizar-se com a anatomia do estômago ^5-7 e STNS ^5,8 antes dissecções início. Essa familiaridade vai diminuir o risco de danos acidentais aos nervos e tecidos.

Para manter a saúde da preparação, é fundamental para manter a preparação em uma temperatura baixa. Isso é facilmente alcançado através da troca de solução salina a cada 30 minutos com 4 ˚ C salina mantidos em uma geladeira. Quando imersos em solução salina fria, a preparação STNS isolada é viável para muitas horas. Gravações em gammarus relacionadas Homarus demonstraram atividade rítmica estável a partir do STG todo cinco dias in vitro ^9; robustez semelhante foi visto em H. americanus (pers. obs.).

Entrada modulatórios para o STG dos gânglios comissural é necessário para preservar os padrões motores em curso. Portanto, para manter uma atividade normal rítmica estes gânglios e do íon, filho, e os nervos stn deve ser mantida intacta. A dissecção descrevemos preserva vários nervos motores (que contém os axônios do neurônio motor): a s AGN (contendo moinho gástrico (GM) axônios), o mvn s (contendo Lateral gástrica (LG) e Inferior Cardíaca (IC) axônios), a s pyn (contendo Pilórica neurônio (PY) axônios), a s pdn (contendo Dilatador Pilórica (PD) axônios), e os s lvn (contendo Pilórica Lateral (LP), Gastric Medial (MG), os axônios de GLP, bem como os da GM, PD e PY). Dissecando adicionais (ou diferentes) os nervos, outras os axônios do neurônio motor pode ser registrado. Cada tipo individual de axônio do neurônio motor pode ser registrado individualmente por dissecação e gravação do nervo que inervam o músculo para que este tipo de projectos neurônio.

Esta preparação pode ser usado para uma variedade de estudos focados em função do sistema nervoso. A atividade dos neurônios pode ser registada utilizando intracelular, gravações eletrodo afiada de somata ou axônios, ou por registro de impulsos elétricos dos nervos extracelularmente. Muitos canais iônicos dos neurônios STG ter sido parcialmente clonado e mRNA pode ser medido a partir somata manualmente puxado ^10,11.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter)	Tool	California Fine Wire Company		Cut into 1-2mm pieces to use as fine pins.
Forceps #5	Tool	Fine Science Tools	91150-20
Minuten Pins	Tool	Fine Science Tools	26002-10
Moria Spring Scissors (7mm blades)	Tool	Fine Science Tools	15370-52	These are the top of the line. There are more economical spring scissors available from the same company.
Petri Dish (100x15mm)	Tool	Fisher Scientific	08-757-12	Fill 2-4mm with Sylgard 182.
Sylgard 182	Other	Dow Corning	182
Pin Holder	Tool	Fine Science Tools	26018-17	Optional. Desheathing can be done with scissors and fine forceps alone.
Super fine forceps #5SF	Tool	Fine Science Tools	11252-00
Tungsten Needles	Tool	Fine Science Tools	10130-05	Optional. Desheathing can be done with scissors or with pins cut from fine tungsten wire.
Dissection microscope