Isolamento de células de camundongo Peritoneal Cavity

Resumo

A cavidade peritoneal em mamíferos contém diferentes populações de células imunes crucial para a resposta imune inata. Um método eficiente de isolamento é necessário para análises bioquímicas e funcionais dessas células. Aqui nós fornecemos um método abrangente para o isolamento de células na cavidade peritoneal do rato.

Resumo

A cavidade peritoneal é uma cavidade ligada à membrana e cheias de líquido abdominal dos mamíferos, que contém o fígado, baço, a maior parte do trato gastro-intestinal e outras vísceras. Abriga uma série de células do sistema imunológico, incluindo macrófagos, células B e células T. A presença de um elevado número de macrófagos naïve na cavidade peritoneal torna um local preferido para a coleção de macrófagos teciduais naïve residente (1). A cavidade peritoneal também é importante para o estudo das células B por causa da presença de um único subconjunto de células da cavidade peritoneal residente B conhecidas como células B1, além de células B2 convencionais. Células B1 são subdivididas em B1a e B1b células, que podem ser distinguidas pela expressão de superfície de CD11b e CD5. Células B1 são uma importante fonte de IgM natural, proporcionando proteção precoce de uma variedade de patógenos (2-4). Estas células são auto-reativos na natureza (5), mas como eles são controlados para evitar a auto-imunidade ainda não é totalmente entendido. Pelo contrário, CD5

Protocolo

1. Antes de iniciar o processo, os seguintes itens precisam ser coletados e preparados:
   • Gelo
   • Seringa de 5 ml com agulha 27g
   • Seringa de 5 ml com agulha 25g
   • Bloco de isopor e pinos para a montagem do rato
   • Bandeja em que o bloco de montagem pode ser colocado
   • Tesouras e pinças
   • Tubos de coleta
   • Etanol 70%
   • PBS com 3% de soro fetal bovino (FCS) (Pré-refrigerado e mantido em gelo)
2. Euthanize o mouse, pulverizá-lo com etanol 70% e montá-la no bloco de isopor em sua parte traseira.
3. Usando uma tesoura e uma pinça cortar a pele externa do peritônio e puxe-o de volta para expor a pele interna que reveste a cavidade peritoneal.
4. Injectar 5 ml de PBS gelado (com FCS 3%) na cavidade peritoneal, utilizando uma agulha 27G. Empurre a agulha devagar no peritônio tomando cuidado para não perfurar nenhum órgão.
5. Após a injeção, massagear suavemente o peritônio para desalojar quaisquer células anexado na solução PBS.
6. Inserir uma agulha de 25 g de bisel, para cima, ligada a uma seringa de 5 ml no peritônio e recolher o líquido enquanto se move a ponta da agulha com cuidado para evitar o entupimento pelo tecido adiposo ou outros órgãos. Recolher o líquido tanto quanto possível, e depositar a suspensão de células coletadas em tubos mantidos em gelo depois de retirar a agulha da seringa.
   Opcional: Repita o passo 4-6
7. Faça uma incisão na pele interna do peritônio e, mantendo a pele com uma pinça use um plástico Pasteur pipeta para coletar o líquido restante da cavidade.
8. Se no passo 6 ou 7 de contaminação por sangue visível é detectada em seguida, a amostra contaminada deve ser descartada.
9. Gire a suspensão de células coletadas em 1500 RPM por 8 minutos, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meios de comunicação desejado ou PBS para contagem.

Protocolo alternativo para a obtenção tioglicolato provocou macrófagos:

Este método é usado para obter um maior rendimento dos macrófagos.

1. Injectar 5 ml de 3% (w / v) Brewer tioglicolato médio (7) na cavidade peritoneal de cada rato.
2. Aguarde 3-5 dias, e avance para o passo 1 acima para a recolha das células.

Comparação com a abordagem nonelicited, aproximadamente 10 vezes mais macrófagos podem ser coletados. A única preocupação é que os macrófagos obtidos por este procedimento diferem em algumas de suas propriedades fisiológicas.

Resultados representativos:

De um mouse não-manipulado, 5-10 milhões de células da cavidade peritoneal pode ser obtida com um protocolo de um bom isolamento. Entre todas as células vivas, 50-60% são células B, macrófagos ~ 30% e 5-10% são células T (Fig. 1).

Figura 1. Fenótipo de células isoladas da cavidade peritoneal. Após o isolamento de células cavidade peritoneal foram corados com anti-rato TCRβ-FITC, B220-PE-Texas vermelho, azul-Pacífico CD11b, CD23-PE-Cy7 e CD5-APC. Parcelas fluxo representante citometria mostram porcentagens de células B e T (a), macrófagos (b), B1 e B2 células (c) e células B1a e B1b (d).

Discussão

Isolamento de células da cavidade peritoneal é uma técnica importante para o estudo das diferentes células do sistema imunológico, principalmente macrófagos e subpopulações de células B específicas. Embora este seja um processo simples, existem alguns passos críticos envolvidos. Presença de contaminação de sangue na amostra coletada deve ser evitada para obter uma população de células pura peritoneal da cavidade. Eutanásia por deslocamento cervical deve ser feito com cuidado para evitar a contaminação de sangue na cavidade peritoneal. Alternativamente CO ₂ pode ser usado. Além disso, durante o procedimento adequado de cuidados devem ser tomados para evitar a perfuração da bexiga ou quaisquer outros órgãos na cavidade peritoneal. Recuperar a maior parte do fluido injetado é também importante para o rendimento das células.

Este procedimento é amplamente utilizado para estudar a biologia dos macrófagos desde números moderados de residentes, macrófagos unstimulated pode ser facilmente obtida a partir da cavidade peritoneal, em contraste com a laboriosa tarefa de diferenciar as células progenitoras mielóides em macrófagos maduros in vitro, usando fator estimulador de colônias de macrófagos (8 , 9). O rendimento de macrófagos da cavidade peritoneal pode ser melhorada usando o método de elicitação de tioglicolato, embora o uso tioglicolato pode alterar as propriedades fisiológicas dos macrófagos (7).

Células B são uma parte importante do nosso sistema imunológico jogar um papel crucial em ambos os imunidade inata e adaptativa. Em subpopulações de células diferentes B, células B1 compõem um único subconjunto de células B envolvidos na imunidade inata, auto-imunidade e regulação imune. Células B1 estão localizados principalmente na cavidade peritoneal e estão reabastecendo self. Eles são uma das principais produtoras de IgM natural que fornece a primeira linha de defesa contra uma série de vírus e bactérias (10-12). Células B1 também são uma importante fonte de IL-10 (6), que é uma importante citocina envolvida na regulação imune. Embora vários estudos tenham sido prosseguida com as células B1, ainda há espaço para uma avaliação mais aprofundada das suas funções contrastantes, especialmente o seu papel regulador. Peritoneal cavidade método de isolamento de células proporciona a oportunidade única de estudar as funções das células B1.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thioglycollate Medium, Brewer Modified	BD Biosciences	211716