Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ</em

Resumo

Uma técnica que combina na coloração tetrâmero situ e hibridização in situ (ISTH) permite o mapeamento, visualização e análise da proximidade espacial de vírus específicos células CD8 + T ao seu infectados por vírus metas e determinação das relações quantitativas entre estes efetores imunes e metas aos resultados infecção.

Resumo

Os números e os locais de vírus específicos células T CD8 + em relação ao número e da localização de seus alvos célula infectada é pensado para ser crítico na determinação dos resultados que vão desde a autorização para infecções crônicas persistentes. Descrevemos aqui um método para avaliar as relações espaciais e quantitativas entre imunes efetoras (E)-vírus específicos células T CD8 + e metas infectados (T) que combina in situ tetrâmero coloração (IST) para detectar o vírus específicos células T CD8 + e in situ hibridação (ISH) para detectar-RNA viral + células nos tecidos, onde a batalha entre as defesas imunes e infecção ocorre. A combinação de coloração IST e ISH, abreviado ISTH, permite a visualização e mapeamento da localização das células efetoras imunes e metas, e determinação fácil de E: relações T. Esses parâmetros, por sua vez pode então ser usada para determinar as relações entre proximidade espacial, eo tempo e magnitude da resposta imune que predizem resultados em infecção precoce.

Protocolo

Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na Li et al. Ciência 323, 1726-1729 (2009) .

Combinados em coloração tetrâmero situ e in situ hybridization (ISTH) procedimentos

Procedimentos ISTH pode ser dividido em 4 etapas: 1) coloração IST de antígeno específico células T CD8 + nos tecidos; 2) ISH para detectar infectados por vírus de RNA + células, 3) imagens microscópicas confocal do IST-células coradas e viral-RNA + células; 4) análise de imagem, incluindo a construção de montagens de imagens e mapeamento de tetrâmero + + e RNA do vírus das células.

1. IST coloração do antígeno específico células T CD8 + em seções do tecido.

1. Cortar tecidos frescos em 200 um de espessura usando um vibratome ou bisturi.
2. Banho frio vibratome com PBS esterilizado e chill-H para 0-2 ° C. Defina o ângulo de lâmina para um vibratome bastante íngreme 27 °. Sempre que possível, manter tecidos refrigerados em gelo, a fim de minimizar a degradação. Tecido fresco é também mais fácil de usar uma seção vibratome quando está frio.
3. Cortar o tecido com tesoura ou bisturi cirúrgico em pequenos aproximadamente 0,5 cm de largura por 0,25 cm de altura peças. Coloque pedaços de tecido em um barco pesar ou pequeno prato e cubra com ~ 40 ° C derreteu PBS 4% tamponado baixo derreta agarose. Certifique-se o tecido está em contato com o fundo do prato. Empurrar pedaços de tecido para baixo se eles flutuam. Solidificar em gelo. Isso normalmente leva 3-5 minutos.
4. Brasão bloco de tecido com cola Loctite vibratome. Cortar em torno de agarose tecido com um bisturi, e em seguida, usando uma pinça, transferir cuidadosamente o tecido frágil agarose incorporados a um bloco vibratome revestida em cola. Não mova o pedaço de tecido, uma vez que está situado no bloco de tecido. Deixe secar cerca de 10 minutos no gelo.
5. Monte bloco de tecido na vibratome e cortar o tecido em 200um de espessura usando uma velocidade lenta mortos para a frente e amplitude relativamente elevada. Configurações de velocidade e amplitude variam com cada vibratome. Se um vibratome não está disponível, ou tecido não é passível de vibratome corte, corte de tecidos em tiras finas utilizando um bisturi.
6. Transferência de seções com um pincel em uma câmara de tecido situado no poço de uma placa de cultura de 24 poços de tecido contendo 1 ml de PBS refrigerado-H. Colocar até quatro seções de tecido em cada câmara de tecido. Rótulo a tampa da placa de cultura de tecidos com informações da amostra experimental e tampa segura a placa com um elástico.
7. Alternativamente, para tecidos que não cortam bem com vibratome, como intestino, pode cortar tiras finas como possível com lâmina de bisturi ou navalha. Coloque apenas uma seção por bem para cortar seções bisturi.
8. Proceder à coloração imediatamente após terminar de tecidos de corte. Manter seções refrigeradas para minimizar a degradação em todos os momentos, até fixo. Não deixe secar seções. Manter seções refrigeradas estéril PBS-H.
9. Incubar secções de tecido durante a noite com 0,5 mg / ml FITC tetrâmeros conjugados. Pode incluir ou não do rato-coelho anticorpos dirigidos a epitopos extracelular neste incubação, por exemplo, anticorpos anti-CD8, diluído 1:200 em solução de bloqueio. Use 1 ml de solução por bem para esta e todas as incubações subseqüentes, e realizar esta e todas as incubações subseqüentes a 4 ° C, com placas em uma plataforma de balanço. Mantenha câmaras do tecido contendo diferentes amostras experimentais separados por pelo menos um vazio bem para evitar a contaminação cruzada de soluções em etapas subseqüentes.
10. Após a incubação primária, lavagem de seções com refrigerados PBS-H duas vezes (2X) por 20 minutos cada. Fazer isso, transferindo as câmaras de tecido para uma placa de cultura diferente de 24 poços contendo tecidos refrigerados PBS-H. Tenha cuidado para não escorrer o conteúdo de uma amostra experimental em outro, quando se deslocam câmaras do tecido. Para todas as incubações subseqüentes e lavagens de forma semelhante a transferência das câmaras de tecido para um prato limpo contendo a solução adequada. Monitorar seções em câmaras de tecido durante o procedimento para se certificar de que as seções não ficar preso para os lados das câmaras de tecido.
11. Seções fixar com PBS fresco buffered paraformaldeído 4% por 2 horas em temperatura ambiente. Lavar com água fria PBS-H 2X 5 min cada.
12. Incube com coelho anti-FITC anticorpos, por exemplo, Biodesign1: 10.000, em solução de bloqueio de 1-3 dias. Para co-rotulagem, pode incluir não-coelho anticorpos dirigidos a epitopos intracelular neste incubação também. Para esta opção, se necessário expor os epítopos e permeiam e bloquear as células antes da segunda incubação.
13. Se os anticorpos dirigidos a epitopos usando intracelular que requerem recuperação antigênica de fixação em formol, expor epítopos fervendo 3 vezes em 0,01 M de uréia, 10 segundos de cada vez, em um forno de microondas. Aguarde 2 minutos entre cada aquecimento. Tenha muito cuidado como solução a ferver pode forçar as seções dos poços. Se isso acontecer, use um pincelpara empurrar seções das laterais da câmara de tecido ou da tampa da placa de volta para o fundo da câmara de tecido apropriado. Se os anticorpos não requerem recuperação antigênica omitir este passo.
14. Se estiver usando anticorpos dirigidos a epitopos intracelular, antes da segunda incubação, permeabolize e bloquear as células em secções de tecido com PBS-H com 0,3% de triton X-100, e 2% de soro normal de cabra por uma hora. Em seguida, realizar incubações de anticorpos restantes em PBS-H com 0,3% de triton X-100 e soro de cabra 2% normal.
15. Após a incubação segundo, lave seções em PBS-H por 20 minutos a várias horas. Repita duas vezes para um total de três lavagens. Realizar uma incubação final com as devidas anticorpos fluorescente etiquetado. Por exemplo, cabra anti-coelho Cy3 e de cabra anti-mouse-Alexa 488 diluído 1:1000 cada em solução de bloqueio. Incubar por 1-3 dias. Mantenha seções protegidas da luz por envolvimento das placas em folha de alumínio durante a incubação e, posteriormente, como fluoróforos luz apaga.
16. Lave os cortes em PBS-H por 20 minutos a várias horas. Repita duas vezes para um total de três lavagens.
17. Para IST combinado com ISH pós-fix seções pós-fix em paraformaldeído 4% por 1 hora para tetrâmeros seguro e anticorpos no local, em seguida, lavar seções com PBS-H de novo e de montagem.
18. Use um pincel para transferência de seções para uma lâmina de microscópio. Seção de revestimento, cada um com glicerol / gelatina contendo 4mg/ml gallate n-propil ou outros meios de montagem contendo um conservante fluoróforo e cobrir com uma lamela. Slides armazenar em recipiente de lâminas de luz protegida em -20 °. Enxágüe placas de cultura de tecidos e remover rótulos de tampas com álcool. Pode reutilizar placas.
19. Analisar cortes de tecidos corados com um microscópio confocal. Em seguida, pode proceder à ISH.

2. Detectar infectados por vírus de RNA + células por hibridização in situ.

Isso no protocolo de hibridização in situ foi modificado de nossos protocolos publicados anteriormente ^4,5 da seguinte forma:

1. Re-cut 5-8 micra de espessura-sectionss de espessura em cortes corados situ tetrâmero.
   1. 200 mícrons de espessura-seções são aquecidas a 70 ° C por 5 min para separar a seção do slide.
   2. A seção é então incorporado em outubro em gelo seco.
   3. 8-micron seções são cortadas com um criostato das seções de espessura e adere a lâminas silanizadas.
   4. Lâminas podem ser armazenadas a -80 ° C em uma caixa selada para posterior hibridização in situ.
2. Hibridização in situ
   1. Reidratar cortes de tecido por imersão slides por 3 minutos cada em etanol 90% e DEPC água tratada.
   2. Permeabilizar cortes de tecido por aquecimento em tampão citrato 10mM (pH 6,0) a 98 ° C em banho-maria por 15 min.
   3. Secções de tecido fresco à temperatura ambiente por 20-30 min.
   4. Lavar duas vezes em água tratada DEPC-por 3 min.
   5. Acetilam secção de tecido por imersão slides em 0,25% de anidrido acético em 0,1 M TEA (trietanolamina, pH8.0) por 10 min.
   6. Transferência de slides em 0,1 M TEA (pH8.0) por 5 min.
   7. Hibridizar seções a ³⁵ S-rotulados de vírus específicos (como o HIV-1, SIV) sonda antisense ou senso (controle negativo para o HIV-1, SIV), ou ³⁵ S-rotulados riboprobes LCMV (sentido reunidos e antisense).
   8. Lave duas vezes com seções 2xSSC por 5 min após a hibridização durante a noite a 42 ° C.
   9. Lave os cortes em STE (0,5 M de NaCl, 1mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7,5) por 5 min.
   10. Digest seções com RNases A e T1 na STE a 37 ° C por 30 min
   11. Lave os cortes em 2x SSC mais formamida 50% por 5 min.
   12. Lave os cortes em 1x SSC 10 min.
   13. Lave os cortes em 0,5 x SSC 15 min.
   14. Desidratar seções 70, 80 e 100% de etanol contendo 0,3 M de acetato de amónio, cada 5 min.
   15. Seções revestimento com emulsão nuclear faixa
   16. Seca em um quarto escuro por 1 hora.
   17. Expor seções a 4 ° C para 11 dias (SIV) e 3 dias (LCMV).
   18. Desenvolver seções em D19 (Kodak, Cat # 146 4593) por 3 min, lavagem em dH2O 30 segundos, corrigir em Rapid Fixer (Kodak, Cat # 146 4106) por 4 min, lavar em dH2O 5 min x 3 vezes.
   19. Desidratar em 70%, 80% e etanol absoluto, 5 min cada.
   20. Slides de montagem no fluorescentes médio Permount compatíveis.

3. Aquisição de imagens de microscopia confocal.

1. Capturar imagens com uma ISTH Bio-Rad MRC 1000 Microscópio Confocal, ou qualquer outro microscópio confocal com Epi2-Blue dispositivo de reflexão.
2. Use Epi1-605 para o tetrâmero vermelho fluorocromo, Epi2 DF32-522 para o verde CD8 fluorocromo, ea reflexão Epi2-Blue para grãos de prata (sinal ISH na radioautographs desenvolvidos) a 20x (para SIV) ou 60x (para LCMV)
3. Seqüencialmente coletar Z-serial imagens em um micro-intervalos nos três canais de cada campo.
4. Adquirir imagens de cada seção da esquerda para aimagem da direita e de cima para baixo, o nome ea cada um segundo a sua linha e coluna em um arquivo Excel.
5. Captura de cada imagem com uma sobreposição de ~ 20% com suas imagens vizinhos para evitar falhas na imagem reconstruída montagem.

4. Análise de imagem: a reconstrução da imagem montagem, cálculo de célula centróide e análise espacial.

1. Projeto Z-série de imagens em uma única imagem para cada canal com o Assistente de Confocal (Versão 4.02)..
2. Mesclar automaticamente a imagem projetada de três canais em uma imagem RGB, usando um procedimento de Ação Photoshop 7.0.
3. Gerar uma imagem de montagem por costura imagens unidas em camadas no Photoshop 7.0.
4. Associar grãos de prata individual e tetrâmero mancha com células, e atribuir a X, Y coordenadas dos centros (centróides) da RNA SIV + + e células tetrâmero, usando Metamorph (versão 7.1.3.) Ou Photoshop (disponível a partir do autor)
5. Exportar dados em arquivos Excel centróide como números numéricos para cada célula. E: T índices são determinados a partir dos arquivos do Excel a partir do número total de tetrâmero + + e RNA viral células na seção.

Relações espaciais entre vermelha tetrâmero e SIV + azul + RNA células são capturados, copiando e colando suas respectivas parcelas a partir dos arquivos do Excel em um documento do Photoshop. Depois de diminuir a opacidade de uma camada para alinhar e escala as grades para que elas coincidam, cor-selecionar e copiar e colar em uma nova camada a posição dos azuis RNA + células, e em seguida descartar a camada usada para alinhar as grades, as posições do tetrâmero + + e RNA viral células será revelado na imagem achatada.

5. Notas adicionais

Se o corte do tecido infecciosas:

Trabalhar em um laboratório BSL2.5. Tome precauções especiais com lâminas de barbear. Coloque a navalha na lâmina vibratome montar com uma pinça. Se você não pode colocar a lâmina com uma pinça, coloque-o no tecido antes de adicionar ao banho, e não substituir a lâmina. Ao cortar terminar, retire a lâmina com uma pinça. Spray de lâmina com EtOH 70% ou DMQ antes da remoção. Como sempre, dispor de lâminas em um recipiente. Mudar de luvas exterior ou enxágüe em desinfetante após cada contato com o tecido ou PBS contaminado no tanque. Quando terminar, se trabalhar com material infeccioso, adicione desinfetante DMQ a PBS no tanque e deixe descansar alguns minutos antes de remover. Dispor de PBS descontaminados pelo ralo. Em seguida, lavar o tanque com água para remover o sal e desinfetante. Local de trabalho limpo e utensílios com DMQ. Lave utensílios com água.

Fazer tetrâmeros da monômeros biotinilado MHC:

Obtenção de MHC classe I biotinilado moléculas como HLA-A * 0201 / B ₂ m / moléculas de peptídeo produzido com qualquer mordaça (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV), ou irrelevantes MART peptídeo (ELAGIGILTV) peptídeos da Beckman Coulter. Biotinilado HLA-A * 0301 / B ₂ m / moléculas de peptídeo produzido com qualquer mordaça (KIRLRPGGK) ou Nef (QVPLRPMTYK) na instalação tetrâmero NIAID. Tetrâmeros são gerados pela adição de seis alíquotas de FITC ExtraAvidin (Sigma) para biotinilado Mamu A. * 01 / B ₂ m / peptídeo monômeros ao longo de 8 horas para um rácio final molar de 4,5:1 A lógica por trás de adicionar o Extravidin lentamente é que durante os pontos de tempo no início há uma superabundância de monômero que assegura que todos os Extravidin acrescentou recebe todos os quatro sites de biotina ligado. Mais tarde, na reação, este processo é menos eficiente porque há menos monômero de esquerda e mais uma chance de que ExtrAvidin não terá todos os 4 sites vinculados. Se adicionados todos os ExtrAvidin menos uma vez a reação seria menos eficiente e mais moléculas Extravidin teria apenas 2 ou 3 monômeros em anexo.

Discussão

Já que o vírus RNA é usado como um marcador para as células infectadas por vírus neste relatório, todos os reagentes antes de hibridação deve ser RNAase livre. O procedimento de hibridização in situ aqui descrito foi modificado para preservar o sinal fluorescente na coloração de tetrâmero situ. Como o sinal radioautographic de infectados por vírus de células detectadas por hibridização in situ é a uma profundidade de cerca de um celular de diâmetro, as seções de espessura utilizada na coloração tetrâmero situ têm de ser recut em 5-8 mícrons de espessura.

Esta nova técnica de combinar em tetrâmeros situ e hibridização in situ (ISTH) aqui descrito permite a visualização simultânea, mapeamento e análise da relação espacial de vírus específicos células T CD8 + e-vírus infectou as células-alvo. Este método pode ser aplicado para avaliar CD8 + vacina de células T com base e em patógeno-vírus não outros e interações hospedeiro. O método de análise de imagem descrito aqui também pode ser usado para estudar as relações espaciais de qualquer populações de duas células interagindo in situ, por exemplo, que recentemente usou o procedimento de mapeamento centróide no estudo do HIV-1 de transmissão sexual no modelo de primata não humano de imunodeficiência símia infecção por vírus de macacos rhesus ⁶

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