Modelagem Colite murino utilizando Dextran Sulfato de Sódio (DSS)

Resumo

Dextran sulfato de sódio (DSS), administrada na água de beber é um modelo de lesão inflamatória estabelecida murino de colite aguda. Este protocolo descreve o método para o tratamento DSS ea preparação dos tecidos.

Resumo

Colite pode ocorrer por infecções virais ou bacterianas, insulto isquêmico, ou doenças auto-imunes; Colite Ulcerativa e mais notadamente a variante do cólon da doença de Crohn - Colite de Crohn. Colite aguda podem apresentar dor abdominal e distensão, má absorção, diarréia, hematoquezia e muco nas fezes. Estamos começando a entender as complexas interações entre o meio ambiente, genética e disfunção da barreira epitelial em modelos de doença inflamatória intestinal e animal de colite têm sido essenciais para fazer avançar a nossa compreensão da doença. Um modelo popular envolve completando a água potável de camundongos com sulfato de baixo peso molecular de sódio Dextran (DSS), resultando em danos epiteliais e uma resposta robusta inflamatória no cólon de vários dias

Protocolo

Parte 1: Lesão Modelo de Colite

1. Peso inicial deve ser obtido para cada rato antes do início do tratamento DSS.
2. Fazer uma de 3% (w / v) Sulfato de Dextran solução de sal de sódio em água e filtrar com um filtro de 0,45 mM de acetato de celulose.
3. Substituir a água potável na gaiola do rato com a solução DSS 3% por quatro dias. Os ratos não devem ter acesso a qualquer outra fonte de água (ou seja, a exclusão dicas colocados em sistemas de rega automática).
4. No dia quatro, substitua a solução DSS com água por mais três dias, permitindo alguma recuperação do cólon epiteliais. Os ratos devem ser pesados ​​no dia quatro, a fim de quantificar conseqüências sistêmicas da colite. Perda de peso é comum com ferimentos graves.
5. No dia 7, pesar e sacrifício dos ratos. Ratos podem ser sacrificados por overdose inalatória de isoflurano, ou outros institucionalmente, IACUC métodos aprovados.

Parte 2: Necropsia e Colheita de Colon

1. Expor o lado ventral do rato e pernas seguro para garantir o acesso livre para o abdômen. Molhar o abdômen completamente com álcool 70%.
2. Segure a linha média do abdómen com uma pinça e estender para cima, assim tenting a pele. Use uma tesoura de ponta fina para o abdômen inciso expondo o conteúdo abdominal. Estender a incisão para a ponta do apêndice xifóide na linha média e depois estender ao longo do aspecto inferior das margens costal, bilateralmente.
3. Identificar o intestino delgado, ceco e cólon. Dissecar cuidadosamente / provocação do cólon a partir do mesentério circundante. Transecto do cólon profundamente na pelve, para libertar o cólon distal e reto. Transecto os dois pontos na margem colonocecal para libertar o cólon proximal. Cuidados devem ser tomados durante este processo para não danificar o colon como a limpeza do cólon será problemático se ocorrer perfuração.
4. Utilizando uma agulha 20G alimentação e seringa de 10 ml, entubar e lave o cólon com gelado PBS até que o eluido está completamente limpa de fezes.
5. Neste ponto, se a análise macroscópica com um microscópio de dissecação é desejado, os dois pontos podem ser fixados como "lingüiça". Se a análise histológica é apenas desejável do que prosseguir para a Parte 4 "Fazendo Rolls Suíça para a análise histológica de colite aguda".

Parte 3: Processamento como "Lingüiça" para análise macroscópica de todo o cólon

1. É importante manter a correta orientação do cólon, portanto, manter a extremidade distal do cólon mais próximo do operador. Corte dois pedaços de sutura não absorvível (SP116 1,5 seda trançada métricas), uma polegada de aproximadamente 1 em comprimento, os outros 2 polegadas.
2. Use a peça 2 polegada de sutura para amarrar a extremidade distal mais próximo à margem quanto possível, mantendo uma boa vedação.
3. Coloque uma agulha 20G alimentação contendo 5 ml de tampão fosfato 10% de formol na extremidade proximal do cólon. Vagamente empate a parte restante da sutura imediatamente proximal ao bulbo da agulha de alimentação. Segure firmemente os dois pontos no bulbo da agulha de alimentação e infundir formalina até o cólon é expandido. Apertar o nó na sutura que você retire a agulha de alimentação, deixando a infusão de cólon, expandiu como um "salsicha".
4. Encha um tubo de 15 ml com 10% de fosfato tamponada de formalina e coloque os dois pontos no tubo. Correção para 24 horas.
5. Deitar fora formalina e substituir com EtOH 70% para um 24 horas adicionais. (Colons podem ser armazenados em EtOH 70% indefinidamente à temperatura ambiente.)
6. Remova os dois pontos do tubo cônico e cortou as cordas em cada extremidade com um bisturi, tomando cuidado para não danificar o colon. Lembre-se que a extremidade distal tem o maior pedaço de corda. Corte longitudinal do distal para extremidade proximal do cólon para que forme uma longa folha. Neste ponto, o cólon pode ser visto sob um microscópio de dissecação.

Parte 4: Making Rolls Suíça para a análise histológica de colite aguda

1. É importante manter a correta orientação do cólon, portanto, manter a extremidade distal do cólon mais próximo do operador.
2. Meça o comprimento do cólon. Esta métrica é um indicador da gravidade da lesão. Colite aumenta edema e encurta o comprimento do cólon em geral.
3. Usando uma tesoura de ponta fina, inciso longitudinalmente de distal para proximal final do cólon. Use uma pinça bem cotado para agarrar a borda da incisão e aberto lateralmente trabalhando o seu caminho distalmente-> proximalmente, assim, mostrando o cólon como uma folha plana.
4. Rolando o cólon exige um par de fórceps e uma técnica de duas mãos. Segure a borda da margem distal com uma pinça. Proceder à seqüencialmente rolo do cólon através da rotação e liberando a pinça de prosseguir para a margem proximal. Gerando assim uma espiral com uma terceira dimensão ou "Swiss roll".Para manter a forma rolada, segure o rolo com firmeza com uma pinça e transectos com uma agulha 27G1 / 2. Segura a agulha, dobrando a agulha que sai do rolo.
5. Coloque o rolo em uma fita de tecido devidamente rotulados e coloque em um frasco de 10% de fosfato tamponada de formol em temperatura ambiente por 24 horas para garantir a fixação do tecido.
6. Deitar fora formalina e substituir com EtOH 70% para um 24 horas adicionais. (Colons podem ser armazenados em EtOH 70% indefinidamente à temperatura ambiente.)
7. Uma vez que a amostra foi corrigido, ele pode ser incluído em parafina, seccionado e montado em lâminas para análise histológica.

Parte 5: Resultados Representante

O modelo DSS para a colite aguda permite ao pesquisador obter, corrigir e analisar dois pontos que a colite aguda modelos. Quando o rolo suíço é cortado e montado, ele deve formar uma fatia representativa de todo o cólon, se rolou corretamente (Figura 1). O rolo montado podem ser marcadas com H & E, a fim de determinar a extensão dos danos para o cólon, desde o final (para dentro) distal até o final (fora) proximal (Figura 2). Imunohistoquímica também pode ser realizada no rolo suíço para identificar e quantificar infiltrados inflamatórios. Se o método de lingüiça foi realizado corretamente, os dois pontos fixos será dilatada e toda a superfície da mucosa pode ser facilmente manipulado e visto sob o microscópio de dissecação (Figura 3).

Figura 1. Corretamente executados "Swiss roll". (A) Os dois pontos são rolados do distal para proximal final, seccionado com uma agulha e garantidos por dobrar a ponta da agulha. Em seguida, é colocada em um cassete de tecido para fixação. (B) H & E manchada seção 5 mM de um rocambole feito a partir do cólon de um rato tratados com DSS (d = cólon distal p = cólon proximal).

Figura 2. Colons DSS tratados mostrar sinais de colite aguda. Inflamação e danos cripta são aparentes no cólon DSS-tratados em comparação com um controle de água tratada.

Figura 3. Um exemplo de uma "salsicha". A salsicha infundido com formalina e completamente expandidas. Um leve ângulo estará presente secundária à curvatura natural do cólon. A salsicha aberta deve estar nivelado.

Discussão

Este protocolo pode ser modificado para modelo de lesão aguda, lesão de reparação, ou crônica processos de lesão do cólon.

Modificação lesão aguda:

DSS ad lib tratamento para 4-6 dias, seguido pelo sacrifício imediato

Lesão-Modificação:

Lesões com 4-6 dias de tratamento DSS seguido por período de recuperação de 3-4 dias e sacrifício (como descrito no protocolo acima).

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran Sulfate Sodium Salt	USB Corp., Affymetrix	9011-18-1	mol wt 40,000-50,000
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher Scientific	SF100-4
Isoflurane, USP	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	NDC 57319-474-06
TISSUE PATH Macrosette Cassettes	Fisher Scientific	15182706
BD 10 ml Syringe	BD Biosciences	309604
Ethyl Alcohol	Pharmco-AAPER	E190	Dilute to 70% with distilled water
20G Straight Feeding Needle	VWR international	20068-612
27G1/2 PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305109
Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip	VWR international	82027-588
Waugh Forceps	VWR international	82027-428
Non-absorbable Suture	LOOK Surgical	SP116
Whatman Blotting Paper	VWR international	28298-020	Cut as needed
Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter	Cole-Parmer	EW-06731-2
Carbon fiber composites digital caliper	Fisher Scientific	15-007-958