Um protocolo para a Produção de KLRG1 tetrâmero

Resumo

Este protocolo descreve a produção de KLRG1 tetrâmero, que é uma ferramenta poderosa para a análise de KLRG1 ligantes.

Resumo

Assassino celular G1 receptor lectina-like (KLRG1) é um tipo de receptor da glicoproteína transmembrana II inibitória pertencentes à superfamília tipo C lectina-like. KLRG1 existe tanto como um monômero e como um homodímero dissulfeto ligadas. Este receptor bem conservada é encontrada na maioria das células maduras e recentemente activado NK, bem como em um subconjunto de células T efetoras / memória.

Usando KLRG1 tetrâmero, bem como outros métodos, E, N, e R-caderinas foram identificados como KLRG1 ligantes. Estes Ca ^{2 +} dependentes de célula-célula de moléculas de adesão compreende um domínio extracelular contendo cinco repetições caderina responsável por interações célula-célula, um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático que está ligada ao citoesqueleto de actina.

Geração do tetrâmero KLRG1 foi essencial para a identificação do KLRG1 ligantes. KLRG1 tetrâmero é também uma ferramenta única para elucidar a caderina papéis e jogar KLRG1 na regulação da resposta imune e integridade do tecido.

Protocolo

Preparação de Corpos de Inclusão

1. Inocular 4 x 500 ml frascos de TB, cada uma contendo 50 mg / ml de cloranfenicol carbenicilina e com uma cultura de bactérias durante a noite expressando a construir KLRG1 plasmídeo. Quando o OD atinge 0,6 Å a 600 nm, induzir com a adição de 0,4 M IPTG e incubar a cultura para um adicional de 4 horas agitação a 37 ° C.
2. Ressuspender as células colhidas em pH = 8,0 ressuspensão (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) de sacarose, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Nota: pellets podem ser congeladas nesta fase.
3. Piscina não mais que 60 ml de resuspensions bacteriana em um copo de polipropileno. Se necessário, ajustar para 60 ml com tampão TE pH 8,0 e agitar a mistura com metade da velocidade.
4. A mistura mexendo add-drop sábio: lisozima (final = 1 mg / ml), MgCl2 (final = 5 mM), 2 mg DNAse I em glicerol a 50% continham 75 mM NaCl, Triton X100 (final = 1%), a TDT ( final = 10 mM).
5. Sonicate a solução em gelo por 1,5 min e centrifugar a lisados ​​em 5.000 RPM por 10 min a 4 ° C.
   1. Decantar o sobrenadante.
   2. Adicionar 15 ml de lavagem pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
   3. No gelo, sonicate solução para 1,5 min até que a pelota é completamente ressuspenso.
   4. Centrifugar as amostras a 5.000 RPM por 10 min a 4 ° C.
   5. Repita a lavagem 5 vezes.
6. Repita 5b com tampão de lavagem sem Triton X-100 centrífugas, e ressuspender em 4 ml de tampão TE.
7. Pegue o peso úmido inclusão lama corpos e armazenar em tampão TE para uma concentração de 30 a 100 mg / ml.

Redobrando de KLRG1

1. Fazer 1 L de refolding pH = 8,0 (0,4 M-arginina HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA livre de comprimidos inibidores da protease, 5 GSH mM e 0,5 mM GSSG) frio e a 4 ° C, agitando.
2. Preparar os corpos de inclusão para injeção a mistura dobrar: É ideal para fazer 5 10 injeções cada um com 0,25 mM de concentração 0,5, para que a concentração final da proteína será 2 3 mM.
   1. Derreta o volume de 50 mg de polpa corpos de inclusão em 7 M GnHCl com 10 mM β-mercaptoetanol.
   2. Mantenha a inclusão corpos / mistura GnHCl a 37 ° C por 30 - 40 min e vórtice cada 5 minutos para garantir a fusão completa (chorume ficará claro quando completamente derretido).
   3. Centrifugar a velocidade máxima por 30 minutos em microcentrífuga a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 15 ml. Não transferir qualquer um dos pelota pequena enegrecida.
3. Ajustar o volume com tampão de injeção (3 M GnHCl, 10 NaAcetate mM, pH 4.2,10 mM EDTA).
4. Injectar 1 ml de corpos de inclusão diluído a cada hora. Ao injetar, mexa em alta velocidade, adicionar 1 ml de diluída gota a gota, corpos de inclusão com 2 segundos entre cada gota. Quando a injeção é feita, agitar a baixa velocidade.
5. Continue mexendo noite para o dia em baixa velocidade, a 4 ° C.

Concentração de reações redobrando

1. Seguindo o protocolo Millipore s, concentrar a L 1 de pré-filtrada reação (0,22 mM filtrada) refolding usando um Amicon Stirred Celular e YM10 membrana de ultrafiltração NMWL 10K (Millipore) para ~ 10 ml.
2. Concentre-se a ≤ 2 ml usando um Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).

Purificação da KLRG1 tetrâmero

1. Configurar o AKTAFPLC a 4 ° C de acordo com manuais GE Healthcare.
2. Purificar a forma de monômero de KLRG1 por cromatografia de exclusão utilizando um tamanho Sephacryl S-200 de alta resolução 16/60 coluna (GE Healthcare) em 20 mM HEPES e 150 mM NaCl. (Veja Figura 1).
3. Concentrado para 1 ml usando Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
4. Use enzima Bira acordo com o protocolo de avidez s para biotinylate do monômero KLRG1.
5. A biotina livre é eliminado por cromatografia por exclusão de tamanho como em 2.
6. KLRG1 molécula é tetramerized misturando KLRG1 monômero com 4 vezes molar excesso PE estreptavidina conjugada (BD Biosciences).

Resultados representante

Figura 1. Representante resultados positivos da cromatografia de exclusão AKTA FPLC tamanho do refolded KLRG1. O gráfico mostra a separação do monômero (83,52 ml), dímero (56,36 ml), e multimer forma (36,26 ml) da KLRG1 redobrada. O pico em 94,25 ml representa a troca de buffer.

Discussão

Neste protocolo, é mostrado como purificar, biotinylate e KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetrâmero pode ser usado para rotular KLRG1 ligantes por citometria de fluxo. Embora as condições refolding terá de ser testado empiricamente para cada proteína, outras lectinas tipo C pode ser tetramerized usando um protocolo similar. Uso de proteínas tetramerized como sondas, ligantes para receptores órfão tipo C lectina poderia ser identificado.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BirA Enzyme and Buffer	Biotinylation Kit	Avidity	BIRA500
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free	Reagent	Roche Group	11 836 170 001	or equivalent
Amicon Stirred Cell	Equipment	EMD Millipore	Model #8400	or equivalent
YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane	Filtration Supply	EMD Millipore	13642
15 ml YM10 concentrator	Filtration Supply	EMD Millipore	4411
AKTAFPLC	Equipment	GE Healthcare	18-1900-26
Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column	Equipment	GE Healthcare	17-1166-01
Strepavidin PE	Reagent	BD Biosciences	554061	or equivalent