Fertilização de Oócitos Xenopus Utilizando o método de transferência do host

Resumo

Procedimento para fertilizar Oócitos Xenopus Pelo método de transferência de host.

Resumo

Estudar a contribuição de moléculas herdada da mãe para o desenvolvimento inicial dos vertebrados é frequentemente prejudicada pelo tempo e despesa necessária para gerar animais mutantes efeito materno. Além disso, muitas das técnicas para superexpressão ou inibir a função do gene em organismos como Xenopus e zebrafish não suficientemente alvo crítico materna vias de sinalização, tais como sinalização Wnt. Em Xenopus, manipulando a função do gene em oócitos cultivados e, posteriormente, fecundá-los pode amenizar esses problemas até certo ponto. Ovócitos são manualmente defolliculated de tecido de ovário doador, injetado ou tratados de cultura como desejado, e então estimulados com progesterona para induzir a maturação. Em seguida, os oócitos são introduzidos na cavidade do corpo de um sapo anfitrião ovulando feminino, quando então eles serão translocados através do oviduto do hospedeiro e adquirir modificações e casacos de geléia necessário para a fertilização. Os embriões resultantes podem então ser aumentado para o estágio desejado e analisadas para os efeitos de quaisquer perturbações experimental. Este método de transferência de anfitrião tem sido altamente eficaz em descobrir mecanismos básicos do desenvolvimento inicial e permite uma ampla gama de possibilidades experimentais não disponíveis em qualquer outro organismo vertebrado modelo.

Protocolo

1. Remoção cirúrgica do tecido do ovário

1. Prepare um novo lote de meio de cultura de oócitos (OCM; Materials), entre 400-800 mL, dependendo do tamanho do experimento. Ajustar o pH a 7,6-7,8, até que o vermelho de fenol tem uma cor vermelho escuro (seis ou mais pequenas gotas de 5N NaOH). Derramar uma pequena quantidade para verificar o pH em um tubo separado desde o eletrodo de pH pode contaminar os meios de comunicação. OCM deve ser armazenado a 18 ° C e utilizada dentro de uma semana.
2. Selecione 3-5 fêmeas e um lugar em ~ 2L solução anestésica buffered (Materiais). Tentamos evitar o uso de rãs que foram alimentadas no dia ou antes da cirurgia. Enquanto o sapo é sucumbir ao anestésico, desinfetar a área cirúrgica com EtOH 70% e preparar os instrumentos cirúrgicos.
3. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos por 20 segundos de imersão em um esterilizador quente talão a 250 ° C. Os seguintes instrumentos devem estar na mão: lidar com bisturi (# 3) e lâmina (# 10 ou 11), vários pares de fórceps Dumont, íris Bonn tesouras (curvo ou reto), Halsey ou Olsen-Hegar porta-agulha micro, e suturas. Coloque instrumentos esterilizados em uma placa de Petri estéril ou no interior da embalagem de sutura para manter estéril. Segure a agulha no suporte da agulha na orientação desejada antes de começar. Nós preferimos titulares Olsen-Hegar agulha desde a alça contém lâminas da tesoura, que pode ser usado para cortar suturas sem instrumentos de comutação.
4. Após 10 minutos, verificar se um plano cirúrgico de anestesia foi alcançado. Rãs anestesiados vai parar de se mover e não responder a uma pitada dedo do pé ou sendo entregues. Anestesia deve durar 15 minutos, que é tempo mais que suficiente para realizar as operações. Don traje cirúrgico adequado. Isso pode incluir luvas limpas (não-látex), jalecos de laboratório, e máscaras cirúrgicas, dependendo da preferência pessoal e diretrizes de atendimento institucional animal.
5. Nota sobre a técnica asséptica: secreções da pele da rã contém peptídeos antimicrobianos, que geralmente reduzir a incidência de contaminação durante a cirurgia, apesar de uma técnica asséptica deve ser seguido, tanto quanto possível. Campos cirúrgicos podem ser usados, mas não pode ser exigido por IACUCs institucional e não pode fornecer muito benefício. Geralmente "técnica de ponta" utilizado, onde as mãos se tocam as pontas estéril do material de sutura instrumentos, ou local da incisão. Instrumentos podem ser reesterilizado (no esterilizador bead) após a incisão da pele, e uma área estéril deve ser mantido na bancada para a colocação de instrumentos (como uma placa de Petri ou pacote de sutura). Requisitos institucionais podem diferir significativamente, então por favor, seguir as orientações suas instituições "e receber instruções apropriadas antes de cirurgias desempenho.
6. Remova o sapo de anestésico local e em decúbito dorsal em uma cirurgia úmido wipe. Nota. A pele podem ser limpos por lavagem de iodo povidine diluído (1:20) ou clorexidina (0,75%). No entanto, evite comercial esfrega cirúrgico, sabonetes e 70% de álcool isopropílico, que podem danificar a delicada pele de anfíbios.
7. Usando uma tesoura pequena bisturi ou íris, fazer uma (1-1,5 cm) pequena incisão na pele na parte inferior do abdômen, lateral à linha média. Incisões posteriores sobre o sapo mesma deve ser realizada em lados alternados, bem espaçadas umas das outras. Incisões podem ser feitas em paralelo ou perpendicular à linha média.
8. Fazer incisões na pele e músculo abdominal em duas etapas. Depois de cortar a pele, levante a camada muscular e ao redor fascia de cor branca com uma pinça e fazer a incisão no músculo levantadas. Use uma tesoura e corte reto para baixo, tentar fazer um corte rápido para expor a cavidade do corpo deixando bordas da ferida limpa. Se apenas a fascia é cortado, ele será recolhido e vai fazer sutura mais difícil. Levantar o músculo irá ajudar a evitar inadvertidamente ferir qualquer dos órgãos internos. Além disso, tentar evitar o corte através de qualquer corações linfáticos ou vasos sangüíneos visíveis dentro das camadas musculares. Estender o comprimento com a tesoura da incisão, para que o ovário pode ser facilmente puxado através.
9. Ovário devem ser claramente visíveis uma vez que a incisão é feita. Para adquirir o ovário, segure com uma pinça e exteriorizar o tecido do ovário. A quantidade desejada de tecido é removido e cortado fora no nível da parede do corpo. Não encha o tecido de volta para dentro da cavidade celomática, como isso poderia ser uma fonte de infecção ou outras complicações.
10. Imediatamente observar um pequeno pedaço de ovário sob um microscópio de dissecação e um oócitos defolliculate alguns para testar sua qualidade. Eles devem ser firmes e de tamanho uniforme e coloração. Se eles são aceitáveis, retire a quantidade desejada de tecido de ovário e sutura da incisão. Suficiente para encher uma placa de Petri 90 milímetros é geralmente suficiente para a maioria dos experimentos. Se os ovócitos são de qualidade questionável, sutura o sapo e repita com uma mulher diferente.
11. Fechar a incisão com sutura da fascia muscular e camada de primeira. Insira o n eedle alguns milímetros lateralmente à incisão, certificando-se de passagem através da camada de fáscia também. Suturas apenas através do músculo pode rasgar o tecido e se soltar. Use uma pinça para ajudar a inserir a agulha de baixo para cima no lado oposto da incisão. Liberação e re-entender a agulha de fora do corpo e puxe o fio através de até vários centímetros, mais ou menos da cauda permanece, tomando cuidado para não puxá-lo todo o caminho.
12. Fechar a ferida com um padrão simples interrompido de sutura. Usamos um empate instrumento básico para fazer nós quadrados cirurgião (nós reef). Ciclo final longo da sutura em torno do suporte da agulha, segure a cauda e puxe-o através do loop para você e aperte. Laço e puxe através de novo, desta vez puxe o suporte da agulha para longe de você. Um lance terceiro pode ser usado para aumentar a segurança (na mesma direção que o primeiro). Guarnição da sutura, deixando cauda curta e fazer outra sutura no músculo alguns milímetros de distância. Dois pontos são suficientes para pequenas suturas, três para os maiores. Repita o procedimento para a camada de pele. Demonstrações em vídeo de técnica de sutura básicas estão disponíveis no YouTube - procurar por "tie instrumento", há muito poucos para escolher, embora a técnica básica é a mesma.
13. Enxaguar a fêmea com água deionizada e colocá-la em um balde cheio de recuperação cool (18 ° C) de água. Enquanto no laboratório, os sapos são mantidos em água de torneira tratada com Amquel para remover cloraminas. A cada poucos minutos, levante cuidadosamente o sapo da água e olhar para engolir ou olhos esbugalhados movimentos, indicativo de recuperação da anestesia.
14. Nota: A cirurgia de sobrevivência não é estritamente necessário para a obtenção de tecido do ovário, embora as fêmeas continuarão a produzir ovócitos depois de um bom número de operações. Realizar a cirurgia de sobrevivência também vai reduzir o número de animais utilizados. Certifique-se de seguir as diretrizes da unidade de cuidados dos animais nos métodos de sobrevivência vertebrados cirurgia, cuidados pós-operatório e monitoramento e para o número de cirurgias permitido em um indivíduo.

2. Cultura e Oócitos Defolliculating

1. Logo após a cirurgia terminar, subdividir o ovário em pedaços pequenos (~ ² cm 2) e armazenar em OCM fresca, usando 5-6 peças por 90 prato mm. Lóbulos individuais de ovário são cortados, achatada e corte em pedaços quadrados. Estes são lavados no OCM limpo e colocado em pratos de cultura. Achatamento e dividindo-se o ovário irá prolongar a sua vida na cultura e fazer defolliculation mais fácil.
2. Mover um lobo a um pequeno prato de OCM e manualmente defolliculate 300-500 oócitos. Ovócitos transferência usando um estéril, pipeta-fogo polido. Nós descobrimos que o uso da variedade de algodão-ligado é essencial para minimizar a contaminação das culturas. Armazenar os ovócitos a 18 ° C em 8 mL OCM (em pratos médio (Falcon 1007)) em grupos de 100-150. Com a prática, você deve ser capaz de defolliculate ovócitos o suficiente em 1-2 horas. Oócitos Collagenased não são adequados para transferência de host, uma vez que não são ser fertilizado.
3. Defolliculating método. Nós defolliculate usando relojoeiros 'fórceps (Dumont # 4s ou 5s #, Ferramentas Ciência Fine), seguindo os métodos básicos descritos no Smith et al., (1991). Usando um par de fórceps (em sua mão dominante), segure a theca camada de tecido conjuntivo em torno de um totalmente crescido oócito VI palco perto de onde o folículo está ligado ao ovário (o talo). Com o outro par de fórceps, segure o ovário adjacente ao primeiro par. Levemente rasgar a camada folículo, puxando todo o ovócito. Suavemente provocar o ovócito fora do tecido. Oócitos com sucesso defolliculated são floppier de oócitos simplesmente puxado para fora sem remover a camada de folículo e será desprovida de vasos sanguíneos visíveis.
4. Nota: É essencial para manter a pressão muito leve na ponta da pinça, apenas o suficiente para as pontas para atender. Agarrando com muita força é um comum entre os iniciantes e resultará no oócito a ser afastada com o folículo intacto. Manter um bom par de fórceps exclusivamente para defolliculating. As pontas devem atender de forma precisa e deve ser um pouco mais direto do que uma pinça para a tomada de explantes de embriões Xenopus (Figura 1).
5. Rotineiramente teste madura sobre 20 com progesterona e abortar o experimento se a taxa de maturação é pobre (<50% após 6-7 horas à temperatura ambiente).
6. Neste ponto, os oócitos podem ser manipuladas e cultivadas como desejado, como microinjeção de oligo, morfolino ou mRNA. Procedimentos de injeção variam de acordo com laboratório, por isso não vamos descrever aqueles aqui. Oócitos podem ser mantidos até uma semana na OCM, mas geralmente a saúde declina por isso é melhor usá-los para transferência no prazo de 96 horas de isolamento.
7. Tenha em mente que apenas cinco a seis grupos (incluindo um controle) pode ser transferido para uma única fêmea, devido a limitações de corantes vitais, de modo plano seus experimentos em conformidade.

"Maturação> 3. Oócitos e Estimulação de Mulheres Anfitrião Prospective

1. Se realizar um resgate de esgotamento oligo, injetar o seu mRNA (geralmente 5-30 pg de RNA) ~ 24-48 horas após a oligo. Os oligos terá degradadas por esta altura e não deve afetar o RNA injetado.
2. Na noite antes de realizar a transferência, adicionar 16 mL de solução de progesterona de trabalho (1mM em EtOH) para ovócitos em 8 mL OCM em pratos médio (concentração de progesterona final é ~ 2 mM). Incubar 10-12 horas a 18 ° C para permitir a maturação de oócitos.
3. Injetar 3-5 fêmeas com 1000 unidades por sapo de hCG para induzir a postura de ovos. Nossos experimentos parecem funcionar melhor se maturação de oócitos e injeção de hCG são feitas na mesma época, cerca de 12 horas antes da implantação no hospedeiro (eg, 22:00 AM -10). Deixe fêmeas em RT ou 18 ° C durante a noite.

4. Preparação e coloração Dye Vital de Oócitos

1. Na manhã da transferência, permitir ~ 45-60 'para configurar e executar o procedimento. Neste ponto, oócitos maduros podem ser congelados para posterior análise da eficácia do knockdown mRNA ou a expressão da proteína. Além disso, verifique se os ovócitos não foram infectadas e que não havia uma boa taxa de maturação (> 50%). Oócitos infectados não vai fertilizar. Descongelar corantes vitais (Materiais) e giram em velocidade máxima por 5 min.
2. Cores diferentes grupos experimentais, adicionando 80 mL do corante vital apropriado (s) para os pratos de oócitos e incubar com balanço de 15 '. Durante este tempo, selecione uma fêmea hospedeira e começam a anestesia. Escolha um sapo que está lentamente a postura dos ovos normalmente ou que produz ovos abundante com espremendo leve. Ovos do hospedeiro deve ser de boa qualidade. Evite as fêmeas que estão colocando fios de ovos ou ovos esmagadas.
3. Transferir os ovos coloridos para um prato grande de OCM fresco, redemoinho brevemente para lavar e retirá-las antes da transferência.
4. Prepare uma pipeta Pasteur estéril com furo apenas larga o suficiente para acomodar um oócito (~ 1,5 mm) para uso em transplante de oócitos. Pontuação da pipeta com um lápis de diamante e quebrar limpa. Fogo polonês até que as bordas são lisas, tomando cuidado para não derreter a abertura fechada.

5. Realizar o transplante de oócitos

1. Transplante de oócitos usa os mesmos procedimentos cirúrgicos, como descrito na Parte I, embora em vez de remover ovário, óvulos manipulados são introduzidos na cavidade do corpo com uma pipeta. Idealmente, o processo de transferência deve ser realizada o mais rapidamente possível eo tamanho da incisão deve ser mantido o menor possível.
2. Anesthesize a fêmea hospedeira e elaboração de instrumentos cirúrgicos, como descrito na Parte I. Fazer e incisão, tal como descrito na Parte I. A incisão pode ser menor, mas precisa ser grande o suficiente para caber o furo da pipeta de transferência (Figura 2A).
3. Transplantar os oócitos, segure e elevar um retalho de fáscia muscular e com uma pinça e introduzir os oócitos experimental utilizando a pipeta Pasteur preparou acima. Redemoinho o prato de oócitos para coletá-los para o centro e sugar o máximo possível. Permitir que os ovócitos para resolver na extremidade da pipeta para evitar o excesso de líquido a ser introduzido e insira a ponta da pipeta na incisão e, lentamente, os oócitos permitir a gotejar para dentro da cavidade do corpo (Figura 2B). Repita até que todos os oócitos foram transferidos. Não solte a camada muscular a qualquer momento, até que começaram a sutura, ou os oócitos vai derramar da incisão.
4. Uma vez que os oócitos foram transferidos, segure ambos os lados da incisão com uma pinça e reuni-los, permitindo que os ovócitos para se adaptar à cavidade do corpo. Começar a sutura como descrito, tendo o cuidado de manter a tensão ascendente sobre o músculo e fáscia até o primeiro nó é amarrado (Figura 2C). Isto irá manter os oócitos de ser expulso e vai permitir que as bordas da incisão para curar uniformemente. Adicionar outro de sutura na camada muscular / fascia e sutura da pele.
5. Enxaguar a fêmea com água deionizada e colocá-la em um balde cheio de recuperação de resfriados (18 ° C) água Amquel-tratada. Monitorar sua recuperação da anestesia como acima. Ela deveria começar a botar ovos normalmente após a operação.
6. Obtenção de testículos de um sapo macho usando os procedimentos normais. Armazenar os testículos na OCM ou L15 até que seja necessário. Nós preferimos testículo fresco quando fertilização experimentos de transferência.

6. Fertilização de recuperação de oócitos e in vitro

1. Cílios peritoneal irá conduzir os ovos transferidos (e normal ovos coelomic do host) para as aberturas dos ovidutos na anterior da cavidade do corpo. Ovos coloridos podem ser recuperados início 2-3 horas após a transferência apertando normal. Os ovos podem ser obtidas a cada meia hora ou até a fêmea pára de postura.
2. Fertilize em uma spesuspensão rm (em ~ 4 mL 1x MMR) por 4 minutos. Flood e enxaguar bastante com 0,1 x MMR. Os ovos devem ativar normalmente e vai começar a decompor ~ 1,5-2 horas após a fertilização. Ovos transferidos, muitas vezes, unir um pouco mais tarde do que ovos do hospedeiro.
3. Retire as peles geléia com cisteína como embriões normais e classificar em pratos separados. Isto pode ser feito em qualquer fase, dependendo das necessidades do experimento. É normalmente mais fácil identificar as várias cores ao redor do palco de 4 células e mais difícil durante o final de estágios blástula. Cultura os ovos com uma densidade baixa (<50 por prato médio) em 0,1 x MMR limpo. A partir deste ponto, os embriões podem ser tratados e manipulados normalmente.
4. Devolver os sapos à facilidade de animais e acompanhar de complicações ao longo dos próximos dias.
5. Método de fertilização suplente; postura em tampão de sal de alta
   1. Após o sapo se recuperou da anestesia, colocá-la em ~ 1L de alta-sal MMR (1.2x). Permitir que a fêmea põe ovos no buffer por cerca de 4-6 horas. Squeeze ovos restantes para fora, drenagem MMR 1.2x e classificar ovos coloridos em prato limpo, remova todo o líquido possível.
   2. Lavar exaustivamente com MMR 0.3x e fertilizar no volume mínimo de suspensão MMR / esperma 0.3x até que os ovos activate (10 minutos). Cobrir com 0,1 x MMR e da cultura como acima. Esta opção é útil se os ovos são necessárias muitas no mesmo estágio ou se expressão manual de ovos danifica os ovócitos.

Discussão

A transferência bem sucedida irá resultar na fertilização e clivagem normal de> 50% dos oócitos (Figura 3). Geralmente entre 30-60% dos oócitos transferidos sobreviverá após os estágios nêurula. Nós normalmente transferência 75-150 oócitos por grupo experimental, que vai produzir embriões suficientes para vários tipos de análise (in situ, RT-PCR), bem como visualizar o fenótipo. Implantação de ovócitos substancialmente mais não parece aumentar significativamente o rendimento. Além disso, pelo me...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% L-15 Leibovitz de médio (contendo L-Glutamina)	(Invitrogen 11415-064)
0,4 mg / ml de albumina bovina sérica (BSA; V fração)	(Sigma A-9418-50g)
1x penicilina-estreptomicina	(Sigma P-0781)
Ajuste para 7,6-7,8 pH com NaOH 5N
Fazer nova loja, semanal a 18 ° C.

1M NaCl

20 mM KCl

20 mM CaCl 2

10 mM MgCl 2

HEPES 150 mM

ajustar o pH 7,6-7,8

Armazenar a 4 ° C

1 g / L 3-aminobenzóico Ethyl Ester (MS222)	(Sigma A-5040)
Bicarbonato de sódio 0,7 g / L
Dissolver em água tratada Amquel-
Faça fresco semanal

Progesterona 10 mM (Sigma P-0130) em etanol 100%

Diluir a 1 mM em etanol 100% para um estoque 500x solução / trabalho

Armazenar a -20 ° C

Azul: 0,1% Nilo Azul A	(Aldrich 121.479-5G),
Vermelho: 0,25% Vermelho Neutro	(Sigma N-6634),
Brown: 1% Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Verde (80 mL + 80 azul castanho mL),
Malva (80 vermelho azul + 80 mL mL).
A cor sexta, Orange (80 mL vermelho + 80 mL marrom), também pode ser usado, mas é muitas vezes difícil de distinguir de castanho.