Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

Resumo

Quantificação de DNA dupla fita-estrias usando formação γH2AX como um marcador molecular tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para a quantificação dos focos γH2AX após a exposição das células à radiação.

Resumo

DNA dupla fita-breaks (LAP), que são induzidos por qualquer processos metabólicos endógenos ou por fontes exógenas, são uma das lesões DNA mais críticos com relação à sobrevivência e preservação da integridade genômica. Uma resposta rápida à indução de LAP é fosforilação da variante histona H2A, H2AX, na serina-139 resíduos, na altamente conservada motivo SQEY C-terminal, formando γH2AX

Protocolo

Preparação de células

1. Queratinócitos humanos (FEP-1811) foram cultivadas em queratinócitos-Serum Médio gratuito (K-SFM; Invitrogen) suplementado com fator de crescimento epidérmico, o extrato de hipófise de bovinos e 20 mcg / ml de gentamicina, a 37 ° CO C e 5% _2.
2. A suspensão única célula foi preparado por destacando com tripsina-EDTA (0,05% v / v)
3. Células foram semeadas em oito bem-Lab Tek slides II MicroChamber (10.000 células / poço) e as lâminas foram incubadas por 3 dias a 37 ° C e 5% de CO _2.

Irradiação

1. As células foram irradiadas no gelo com 2 Gy usando uma fonte de ¹³⁷ Cs (Gammacell irradiador 1000 Elite; Nordion International, ON, Canadá, 20,6 segundos / Gy)
2. Controle não irradiado e 2 Gy células irradiadas foram incubadas por 1 hora a 37 ° C e 5% CO _2.

Imunofluorescência

1. Mídia foi derrubado fora e as células foram lavadas com 300 ul de PBS (w / o Ca ^{2 +} ou Mg ^{2 +)} por poço e foram rodados em um misturador orbital por 5 minutos.
2. O buffer foi derrubado fora e 100μl de recém-preparados 4% (v / v) paraformaldeído foi adicionado a cada poço e as lâminas foram incubadas em temperatura ambiente por 10 minutos.
   Todas as incubações foram realizadas em um cocho de coloração umidificado
3. As células foram então lavadas com PBS (w / o Ca ^{2 +} ou Mg ^{2 +).} Lâminas foram colocadas em um frasco Coplin e rodado em um misturador orbital por 5 minutos. Esta etapa de lavagem foi repetido mais duas vezes.
4. O buffer foi derrubado fora e excesso de PBS foi gentilmente apagados.
5. Células foram permeabilizadas com 100ml Triton X-100 (0,1% v / v) por poço e uma incubação de 10 minutos em temperatura ambiente.
6. Células foram lavadas com PBS (w / o Ca ^{2 +} ou Mg ^{2 +),} conforme descrito nos passos 3 e 4 acima.
7. Ligação não específica de proteínas foi bloqueada com 100 ml de BSA (1% v / v) por poço e 20 minutos de incubação à temperatura ambiente.
8. BSA excesso foi derrubado fora e 100μl do ensino primário monoclonal anti-anticorpo fosfo-histona H2AX (diluído 1:500 em BSA 1%; Millipore), foi adicionado a cada poço para a incubação de uma hora à temperatura ambiente.
9. Células foram lavadas com PBS (w / o Ca ^{2 +} ou Mg ^{2 +)} conforme descrito nas etapas 3 e 4 acima e incubadas com 100μl de anticorpo secundário (Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG diluído 1:500 em BSA 1% ; Invitrogen) por poço por 45 minutos em temperatura ambiente no escuro. (Anticorpo diluído foi mantido no escuro durante todo o procedimento)
10. Células foram lavadas com PBS (w / o Ca ^{2 +} ou Mg ^{2 +),} conforme descrito nos passos 3 e 4 acima. No entanto, a exposição à luz foi minimizado usando papel alumínio.
11. Contracoloração nuclear foi realizado com 100 ml TOPRO3 (diluído 1:500; Invitrogen) por poço e incubação de 10 minutos em temperatura ambiente
12. Células foram lavadas com PBS (w / o Ca ^{2 +} ou Mg ^{2 +)} como descrito na etapa 10 acima.
13. As câmaras foram cuidadosamente removido os slides, o excesso de umidade foi apagado e as lâminas foram secas ao ar.
14. Uma gota de solução anti Prolongar-fade GOLD (Invitrogen) foi adicionado por poço e lâminas foram montadas (22x50 milímetros lamela) e qualquer excesso de líquido ao redor das bordas do slide foi apagado.
15. As lâminas foram mantidas no escuro por mais 30 minutos em temperatura ambiente antes de selar com unha polonês.
16. As lâminas foram armazenadas durante a noite a 4 ° C no escuro antes da análise.

Microscopia / Análise

1. Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscpe utilizados para adquirir imagens utilizando a GFP padrão (para γH2AX - Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de rato) e lasers vermelho distante (para TOPRO-3). Tipicamente, um óleo de 63 x lente objetiva de imersão é usado.
   Imagens são adquiridas em um padrão Z-série com um tamanho de passo de 0,5 micron. A tamanho do passo de 0,5 m foi escolhida para minimizar a perda de apresentar focos em diferentes planos no núcleo. Durante a análise, planos individuais são deconvoluídos e empilhados para produzir uma imagem máxima projetada para minimizar a sobreposição de focos (Top hat-filtro aplicado).
2. Metamorph (dispositivos Molecular, EUA) foi utilizado para analisar o número de focos.
   O programa quantitates o número de focos em cada célula após o limite tem sido aplicado para excluir fundo. As informações são registradas em uma planilha do Microsoft Excel para análise posterior.

Figura 1. Visualização de imunofluorescência γH2AX focos (verde) em queratinócitos humanos não tratados e em células irradiadas com 2 Gy e incubados por uma hora mais 1 a 37 ° C, 5% CO _2. O DNA foi corado com TOPRO-3 (azul). Imagens foram adquiridas utilizando um microscópio Zeiss LSM 510 Meta Confocal. Bar = 10 mM.

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Figura 2. Visualização de imunofluorescência γH2AX focos (verde) em queratinócitos humanos e em células irradiadas com 2 Gy e incubados por uma hora mais 1 a 37 ° C, 5% CO _2. Imagens foram adquiridas utilizando um microscópio Zeiss LSM 510 Meta Confocal utilizando 0,5 m de corte Z-(1-9) para garantir que todos os focos foram adquiridas. As imagens foi então empilhados para quantificação usando Metamorph. O DNA foi corado com TOPRO-3 (azul). O γH2AX empilhados e imagens azuis foram empilhadas para visualização. Bar = 10 mM.

Discussão

Após a exposição à radiação ionizante (raios-γ), forma γH2AX focos rapidamente e os números de focos atingir um máximo entre 30-60 minutos ^2. Portanto, nosso ponto de uma hora o tempo pós-irradiação reflete DSB formação inicial. Temos usado a dose de radiação clinicamente relevantes de 2 Gy para nosso experimento. No entanto, o método pode ser usado para as doses de radiação até 4 Gy para a detecção da formação inicial DSB; sobreposição significativa de focos impede a quantificaçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)	Media	Invitrogen	17005042	Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).
Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)	Chamber Slides	Nalge Nunc international	NUN154534
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
0.5% Trypsin-EDTA x10		Invitrogen	15400-054	Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	Refractive index of 1.42 at 20°C.
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Tissue Culture Dish (150x25mm)	Petridish	BD Biosciences	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices