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Method Article
Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. Pontos de vista de culturas vivas mostram crescimento de neuritos e imagem dos níveis de cálcio usando Fura-2.
Neste vídeo, demonstramos a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. O procedimento começa com a remoção dos cérebros de animais em 70-78 horas após a formação pupário. Os cérebros isolados são mostrados após incubação em breve papaína seguido por várias lavagens em soro livre de meio de crescimento. O processo de dissociação mecânica de cada cérebro em uma queda de 5 ul de mídia em uma lamela é ilustrado. Os axônios e dendritos dos neurônios pós-mitóticas são cisalhado off perto da soma durante a dissociação, mas os neurônios começam a regenerar os processos dentro de algumas horas de placas. Imagens mostram culturas vivas em dois dias. Neurônios continuar a desenvolver processos durante a primeira semana de cultura. Populações neuronais específicas podem ser identificadas em cultura usando GAL4 linhas a dirigir expressão tecido específico de marcadores fluorescentes, como GFP ou RFP. Gravações de células inteiras têm demonstrado que os neurônios cultivados forma funcional, espontaneamente ativa sinapses colinérgicas e GABAérgica. Um segmento pequeno vídeo ilustra a dinâmica do cálcio nos neurônios cultivados usando Fura-2 como um corante indicador de cálcio para monitorar transientes de cálcio espontânea e nicotina respostas evocadas de cálcio em um prato de neurônios cultivados. Estas culturas cérebro pupal são um sistema modelo útil em que as ferramentas genéticas e farmacológicas podem ser usados para identificar os fatores intrínsecos e extrínsecos que influenciam a formação ea função de sinapses central.
Preparações antes do dia da cultura:
No dia da cultura
I. Preparar solução enzimática (ES), em capela de fluxo laminar
II. Faça DDM2 media
No dia da cultura: adicione os seguintes suplementos para fazer DDM2
A 10 ml de DMEM adicionar os suplementos, pouco antes de cultivo:
Nota: Faça o suficiente para todas as culturas DDM2 planejado (cada cérebro banhado em uma lamela em um único prato de 35 milímetros individuais Petri, 1,5 ms dos meios de comunicação / cultura)
Etapa III-VI pode estar em uma bancada de laboratório feito não estéreis e devem ser concluídas em 45 minutos ou menos.
III. Pupas Colecção
Nota: Nós usamos geralmente cérebros de pupas entre 55-78 horas após a formação pupário (APF). É ligeiramente mais difícil de dissecar o cérebro dos mais jovens pupas, as cápsulas cabeça tendem a entrar em colapso, enquanto o nível geral de crescimento de neuritos é ligeiramente mais baixa desde o mais velho pupas. Na cepa do tipo selvagem Canton-S, estes estágios são reconhecidos pelos olhos que são pigmentadas castanho claro a ligeiramente avermelhado, com pouco pigmento em outros lugares.
IV. Decapitação sob microscópio de dissecação
V. A remoção do cérebro de cabeça sob microscópio de dissecação
VI. Remoção dos lobos óptica e tratamento enzimático
Dentro capô estéril de fluxo laminar - todas as etapas onde o tecido é exposto ao ar deve ser feito em capela de fluxo laminar para as etapas restantes.
VII. Lavagem
VIII. Trituração e Plating sob microscópio de dissecação
IX. Células de alimentação
Neurônios colhidos os cérebros de roedores embrionárias / pós-natal podem ser cultivadas em cultura de células primária onde se estendem neurites e formam conexões sinápticas funcionais. Métodos para a preparação dessas culturas estão bem estabelecidas e estudos em culturas de roedores neuronal têm desempenhado um papel fundamental na identificação de genes e fatores ambientais envolvidos na regulação da formação de sinapses e função (Banker e Goslin, 1991). Enquanto os neurônios do inseto a partir de uma variedade de ...
Este trabalho foi financiado pelo NIH para conceder NS27501 DKOD. Suporte adicional para este trabalho foi fornecida por uma concessão para a UC Irvine em apoio DKOD através do Programa Professor HHMI.
Lamelas revestimento: Coloque lamínulas autoclavado numa placa de Petri 60 mm. Ul pipeta 5 de Con A / mix laminina em centro de cada lamela. Lugar em 37 C incubadora por 2 horas. Enxágüe lamínulas 3x com 100 ul de água autoclavada cada. Use a vácuo ligado a uma pipeta Pasteur estéril. Durante o último enxaguamento, pegar a lamela com uma pinça e seco ambos os lados. Transferência a lamela e uma placa de Petri de 35mm. Conservar à temperatura ambiente por até um mês.
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