A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese

Resumo

A função do gene pode ser obscurecida na perda de função experimentos se houver compensação por outro gene. O modelo de zebrafish fornece um relativamente alto rendimento significa revelar redundância funcional como em embriões vivos.

Resumo

A função do gene durante a embriogênese é normalmente definida por perda de função experimentos, por exemplo, mutagênese alvo (knockout) no mouse. No modelo peixe-zebra, eficazes técnicas de genética reversa têm sido desenvolvidos usando microinjeção de morpholinos gene antisense específicos. Morpholinos alvo um mRNA através da base de emparelhamento específica e função do gene bloco transitoriamente pela tradução inibir ou splicing por vários dias durante a embriogênese (knockdown). No entanto, em vertebrados, como mouse ou peixe-zebra, algumas funções do gene pode ser obscurecida por estas abordagens, devido à presença de outro gene que compensa a perda. Isto é especialmente verdade para as famílias de genes que contém genes irmã que são co-expressos nos mesmos tecidos em desenvolvimento. Em peixes-zebra, a remuneração funcional pode ser testada de uma forma relativamente alto rendimento, por co-injeção de morpholinos que knockdown alvo de ambos os genes simultaneamente. Da mesma forma, usando morpholinos, uma interação genética entre dois genes pode ser demonstrado pelo knockdown de ambos os genes juntos no sub-threshold níveis. Por exemplo, morpholinos pode ser ajustada de tal forma que nem knockdown indivíduo gera um fenótipo. Se, nessas condições, co-injeção de ambos morpholinos causa um fenótipo, uma interação genético é mostrada. Aqui demonstramos como mostrar redundância funcional no contexto de dois fatores de transcrição GATA relacionados. Fatores GATA são essenciais para a especificação de células progenitoras cardíacas, mas isso só é revelada pela perda de ambos os Gata5 e Gata6. Mostramos como a realização de experimentos microinjeção, validar o morpholinos, e avaliar o fenótipo compensado do coração.

Protocolo

Nosso objetivo aqui é testar a redundância funcional de dois fatores de transcrição para a especificação de progenitores de cardiomiócitos. Os fatores são codificados por dois genes relacionados gata5 e gata6 e estamos usando o modelo de zebrafish para entender suas funções relativas ^1. Nossa estratégia é bloquear a função do gene usando morpholinos ^2. Vamos injetar morpholinos para um ou o outro gene em ovos fertilizados, e comparar o fenótipo embrionárias com embriões derivados de ovos injetados simultaneamente com ambos os morpholinos. Para simplificar a avaliação de fenótipos, usamos ovos derivados de peixes que carregam um transgene que expressa GFP em cardiomiócitos.

Etapa 1. Preparando-se para microinjeção.

A) Configurando casais reprodutores de peixes

A noite antes da injeção, os peixes adultos solteiros do sexo masculino e feminino única (3-18 meses de idade) são colocados em pares em tanques criador separadas por um divisor até a manhã seguinte. Normalmente, configurar 10-20 pares de peixes, e estes são acoplados uma vez por semana, independentemente de os ovos serão usados, para manter a fecundidade. Para esta experiência que estamos usando uma cepa repórter, transgênico para cmlc2: EGFP, porque fornece uma leitura simples para identificar cardiomiócitos diferenciação. Na manhã seguinte, uma vez que as luzes estão ligada, a água é trocada, e divisores são puxados de tanques de peixes permitindo que os pares para acasalar e produzir ovos. Produção de ovos pode ser monitorado, e pode iniciar imediatamente ou após um período de uma hora ou mais, dependendo do peixe. Normalmente, após cerca de 20 minutos ininterruptos de acasalamento, os ovos são coletados por meio de uma pipeta ou coador e despejou em 100 milímetros pratos de Petri contendo água do sistema. É importante para monitorar a produção de ovos, a fim de assegurar que os embriões são injetados entre o estágio de célula 1-4. Pela liberação de vários pares de cada vez, é possível escalonar a produção de ovos e, assim, maximizar a quantidade de ovos que podem ser injetadas em um estágio inicial de desenvolvimento. Um bom par de peixe pode gerar mais de 200 embriões, e não faz nenhum sentido prático para coletar milhares de ovos ao mesmo tempo, já que um único investigador não seria capaz de injetá-los com a rapidez necessária antes que se desenvolvam além do estágio de 4 células . Os peixes são estimulados a raça sobre o ciclo de luz, por isso esta é uma experiência que exige um início precoce e os ovos não são normalmente obtidas após o meio dia.

B) Preparação de agulhas

1. Use um Puller Micropipeta e um tubo de vidro de 3,5 "capilar para gerar duas agulhas usando a seguinte condição: Calor = 626, Pull = 60 Velocidade = 60, e Time = 250 Usamos agulhas núcleo aberto que não contêm um filamento, porque. nós front-enchê-los de sucção.
2. A ponta de cada agulha é então delicadamente quebrado utilizando uma lâmina de barbear limpo ou fórceps, e, posteriormente, chanfrada em um ângulo de 30 graus por cerca de 20 segundos usando um moedor de micro-EG-4. Esta situação aumenta a ponta e é importante se você injetar através do córion.
3. É importante para obter um consistente agulha tamanho da ponta de diâmetro de cerca de 15 mícron (4 unidades calibrados usando uma ocular de microscópio grade, para poder calibrar um volume de injeção 02/01 nl).
4. As agulhas devem ser preparadas com antecedência, guardado em segurança em um local seguro, e cada um é individualmente calibrado imediatamente antes de iniciar as injeções para garantir volume de injeção consistente (ver secção D para detalhes). Se você tiver sorte, você pode ser capaz de usar uma única agulha para uma experiência completa. No entanto, uma agulha pode facilmente quebrar no meio de um experimento, e você não quer usar esse tempo para puxar agulhas novas.

C) Fazendo placas de injeção

1. Prepare 100 ml de uma solução de agarose 2% da água do sistema, por fervura em forno de microondas.
2. Fria ao toque, e despeje sobre 12ml na tampa invertida de uma placa de Petri de 100mm.
3. Inserir duas lâminas de microscópio, inclinada a cerca de 45 graus, ângulos, para os dois lados da tampa. Uma vez que a agarose solidificou, puxe os dois slides longe da tampa.
4. Isso cria calhas onde os embriões serão colocados e, posteriormente, injetadas. Múltiplas placas podem ser preparados antes do tempo. Eles podem ser armazenados por tempo indeterminado a 4 ° C após a adição de uma camada de etanol 70%, acrescentando que o fundo do prato original, e vedar com parafilme. Lembre-se de lavar bem antes de usar.

D) Estação de microinjeção e calibração da agulha

1. Ligue a fonte de nitrogênio comprimido e PLI-100 microinjetor. O injetor deve ser ajustada para uma pressão de fluxo constante de 18 PSI.
2. Antes de inserir uma agulha, assegurar que o micromanipulador está em uma posição adequada para permitir uma ampla gama de movimento, e que uma agulha inserida não vai atacar a mesa. Inserir um dosas agulhas previamente preparado (ver secção C) para o micromanipulador certificando-se há um selo apertado. Tenha cuidado para não quebrar a agulha.
3. Observe a ponta da agulha sob o microscópio para se certificar de que não está obstruído antes de proceder à calibração.
4. Colocar uma gota (2-3 L) de solução injectável ou ₂ DDH O em um pequeno pedaço de parafilme e preencher cerca de 1,5 mL, puxando-o para dentro da agulha usando o botão de preenchimento. Tenha certeza que você tem a ponta da agulha completamente na solução, e observar a sucção de líquido através do microscópio, para evitar qualquer desenho em bolhas de ar.
5. Coloque uma gota de óleo mineral para a grade de um micrômetro.
6. Ajustar empiricamente o tempo de injeção para garantir que o tamanho da gota é de aproximadamente 1,5 mícron de diâmetro. Que irá gerar um volume de injeção de ~ 1,8 nl. O volume real pode ser ajustado para a sua escolha, mas em um sentido prático, é difícil dizer com precisão calibrar volumes inferiores a 1 nl, e os embriões não podem tolerar volumes acima de 2 nl. Independentemente do tamanho do volume que você escolher, manter o mesmo para todas as suas injeções incluindo controles e ajustar as concentrações de sua solução (em vez do volume de injeção) para titular a quantidade de morfolino injetado.
7. Recalibração é necessária cada vez que uma agulha é substituído, já que a ponta da agulha tamanhos podem variar.

Etapa 2. Validação de morpholinos alvo dois genes distintos

Morpholinos são projetados para atingir o sítio de iniciação de tradução ou sítios de splice de um mRNA alvo bloqueando assim a síntese de proteínas ou de processamento de mRNA adequada. Ao analisar um gene, pela primeira vez, usamos os dois tipos de morpholinos para testar se eles geram o mesmo fenótipo, indicando um knockdown específico. Uma vantagem da emenda-bloqueador é que você pode verificar a knockdown da transcrição normal por RT-PCR, que é especialmente útil se os anticorpos para o gene alvo não estão disponíveis. Vamos ilustrar como um fenótipo consistente cardíaca é atingida para a gata5 e gata6 genes usando morpholinos (gata5 5'UTR seqüência MO: 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3 '; gata5 Splice do site seqüência MO: 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'; gata6 5 'UTR seqüência MO: 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3').

1. Morpholinos são obtidos a partir Gene Ferramentas, LLC (Philomath, OR). Ferramentas Gene vai ajudar você a escolher a melhor seqüência de destino, se você perguntar a sua equipe de apoio. Você só precisa enviar-lhes o número de adesão, e eles vão aconselhar. No entanto, não há garantia de que o morfolino vai funcionar, que é por isso que você precisa estar preparado para validar a atividade. Você também pode verificar se o morfolino está disponível a partir OpenBiosystems. Ferramentas gene fornece estoques de morpholinos sintetizados para OpenBiosystems. Embora não haja nenhuma garantia de novo ele vai trabalhar, eles vendem quantidades menores a um custo menor, o que pode ajudar a diminuir os custos para testar novas metas. Certifique-se de seu morfolino BLAST contra o transcriptoma, usamos o recurso BLAT no navegador UCSC genoma do peixe-zebra (genome.ucsc.edu). É claro que, se um morfolino foi validada (rigorosamente) na literatura, é recomendado que você compra que mesma seqüência.
2. O morfolino é dissolvido em DDH estéril ₂ 0 para uma concentração final de 1 mM e armazenado em temperatura ambiente. NÃO CONGELAR as soluções morfolino, como, por alguma razão, por vezes, as baixas temperaturas podem causar-lhes para agregar e precipitar. Morpholinos são insensíveis a proteases ou nucleases, por isso, enquanto a água que você adiciona é estéril, eles devem ser bastante segura em temperatura ambiente.
3. Antes de injetar, incubar a morfolino a 65 ° C por 5 minutos para assegurar que esteja completamente dissolvido, e deixar arrefecer à temperatura ambiente. NÃO coloque a amostra em gelo. Manter o morfolino à temperatura ambiente até injeção.
4. Para titular um morfolino, nós tipicamente preparar diluições seriadas da concentração de ações em DDH ₂ 0 para produzir concentrações de trabalho de 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM e 0,125 mm. Dependendo da seqüência, usando 1,8 nl de volume de injeção, isto representa aproximadamente 20ng, 10ng, 5ng e 2.5ng de morfolino por injeção. Este é apenas um ponto de partida, uma vez que a tolerância ea eficácia de cada morfolino irão variar e não pode ser previsto. Mais morpholinos não será tolerado muito acima de 20 ng, mas alguns podem ser eficazes em doses bem abaixo de 1 ng. Nossa abordagem é definir a concentração na qual um fenótipo "platôs". Em outras palavras, se um fenótipo definido não é visto de 2,5 ng, mas é similar, usando qualquer quantidade igual ou superior a 5 ng, nós escolheríamos 5 ng como um valor limiar. Claro, ele pode ser útil para titular próxima entre 2,5 ng e ng 5.0, para garantir que você está trabalhando reproduzível para além do limiar, em vez de direita "na fronteira".
5. Preencha a agulha acoplada e calibrado(Veja acima) com a menor concentração de trabalho (mais diluída) morfolino solução. Evitar o excesso de enchimento a agulha, como ele vai simplesmente desperdício de material. Se você preencher apenas 1 ml, não há solução suficiente para 500 injeções.
6. Usando uma pipeta descartável, transferência fertilizado de uma célula de embriões para os bebedouros da placa de microinjeção. Retire o excesso de água para garantir que os embriões caem para o fundo dos vales injeção. Eles não devem flutuar, mas aderem à cama agarose.
7. Posicione a placa de injecção para que o micromanipulador pode descer a ponta da agulha através do córion e na gema injectável. Para posicionar embriões individuais, manipular a placa de injeção de tal forma que a ponta da agulha de injeção empurra ou puxa os embriões para a posição adequada. Tenha cuidado para não quebrar a ponta da agulha ou embriões dano! Isso leva um pouco de prática, mas como uma regra você usa o micromanipulador simplesmente para mover a agulha de injeção no embrião e, em seguida, após a injeção, mais rápida e limpa para fora. Embriões são colocados em posição de injeção movendo a placa usando sua mão livre (mão esquerda se injectar com a mão direita). Para um aluno novo, é útil para a prática de uso de uma solução contendo 0,25% de vermelho de fenol, a fim de visualizar a solução injetada. A confiança é também ganhou pela injeção de uma solução contendo microesferas fluorescentes marcadas (Molecular Probes; F-8794), para confirmar que a solução foi injetada no embrião, em vez do espaço inter-córion. No entanto, após algumas rodadas de prática, estas ajudas estão normalmente já não necessita. É uma boa idéia ocasionalmente injetar no ar, apenas para confirmar que a agulha não estão entupidos e que o volume injetado parece adequado.
8. Embriões injetados são transferidos de volta para uma placa de Petri 100mm com sistema de água e cultivadas em 28.5C. Após a injeção da concentração mínima de serviço, qualquer solução remanescente pode ser expulso ea maior concentração próximo trabalho de morfolino usado para preencher a agulha. Repita para cada concentração de morfolino. Embora seja possível para enxaguar a água usando agulha, ao testar uma morfolino distintas, preferimos mudar agulhas e recalibrar. Certifique-se de manter uma coorte de embriões uninjected para verificar se o lote específico de embriões era saudável e normal.

Etapa 3. Co-injeção de morpholinos em doses individuais limite

O objetivo da titulação realizada acima foi para definir a dose limite para cada morfolino. No melhor cenário, essencialmente 100% do morphants irá exibir um fenótipo definido, se o gene alvo tem uma função essencial. No entanto, você pode esperar alguma variação devido a mis-injeção artefatos. Com a prática, isso não deve ultrapassar 10%. Alguns lotes de embriões (incluindo os controles uninjected) não podem sobreviver bem, caso em que o experimento pode ter de ser descontadas. Enquanto isso, há também variabilidade biológica, uma vez que os embriões individuais podem ser mais ou menos tolerantes ao knockdown. Finalmente, alguns morpholinos pode não apenas ser eficiente o suficiente para conseguir um knockdown (penetrante) robusto. Se um fenótipo é gerada em uma baixa porcentagem de embriões, mas é reprodutível, pode valer a pena testar um morfolino distintas. O objetivo deste experimento seguinte é determinar se um fenótipo totalmente novo é visto quando ambos os genes são alvos simultaneamente. Nós não somos simplesmente à procura de um aumento na porcentagem de embriões que têm um fenótipo morphant, mas sim para a geração de um fenótipo distinto que não é visto em ou acima do nível do limiar ao testar um dos genes individuais.

1. Prepare uma mistura de a combinação de morpholinos testado anteriormente, na concentração limite de cada indivíduo morfolino que gerou um fenótipo definidos. Por exemplo, se o limite para cada gene foi de 5 ng, prepare uma solução de trabalho que irá conter 5 ng + 5 ng de cada (10 no total ng). Uma vez que os embriões não podem tolerar muito mais do que 20 ng total de morfolino, é importante, com base nas experiências anteriores, para usar a quantidade mínima de cada um que é suficiente para eficiência-alvo de cada gene.
2. Os controlos devem incluir conjuntos de embriões injetados com cada indivíduo morfolino sozinho na mesma concentração que foi utilizado para a combinação. Volumes de solução injectável deve ser mantida constante (por exemplo, 1,8 nl). A grande vantagem do uso de uma cepa repórter é que você pode avaliar o fenótipo (por exemplo a diferenciação de cardiomiócitos) a qualquer momento e repetidamente. Se os embriões devem ser avaliados para a expressão do gene por hibridização in situ, estágio pareados embriões e controles podem ser fixos em vários momentos após a injecção. Para a nossa experiência, vamos avaliar a expressão GFP como um substituto para a diferenciação de cardiomiócitos, em cerca de 24 hpf.

Etapa 4. Eavaliação de fenótipos

1. Embriões injetados devem ser monitorados, logo após a injeção, e várias vezes durante o dia, para remover qualquer embriões mortos ou moribundos, uma vez que estas podem comprometer a viabilidade do morphants restantes. Para avaliar a expressão do gene repórter, os embriões são analisados ​​utilizando um microscópio de dissecação equipado com capacidade de fluorescência. Nós usamos um microscópio Nikon SMZ1500, com um objetivo ou 1X 1.6X e uma gama de ampliação de 0,75 x para 11.25x. Ao usar um filtro fluorescentes, certifique-se de abrir o diafragma para a configuração totalmente aberta para maximizar a intensidade da luz. Também não se esqueça de usar o filtro correto, dependendo do gene repórter (GFP, RFP, etc.)
2. Embriões normalmente são sedados utilizando uma diluição 1 / 20 em água do sistema de estoque de 4mg/ml metanossulfonato tricaina. As ações são armazenadas congeladas a-20C. Alternativamente, os embriões podem ser sacrificados usando o estoque tricaina 20x. Embriões normalmente pode ser rastreada até mesmo se eles ainda estão no córion. No entanto, particularmente se eles serão fotografados, é uma boa idéia para remover o córions usando uma pinça afiada. Embriões pode ser visto após a colocação em slides depressão na solução tricaina, ou para melhor imobilizá-los para a fotografia colocada em uma pequena gota de metilcelulose de 3%.
3. Observe os fenótipos embrião nos injetados com a combinação de morpholinos comparação com morphants único. Aqui estamos olhando para o padrão de expressão GFP no tubo coração primordial. Neste GFP repórter tensão é expressa exclusivamente em cardiomiócitos através do promotor cmlc2, que permite a análise detalhada da especificação cardíaca e morfogênese tubo de coração.

Resultados representante

Em nosso experimento, ambos os gata5 e gata6 morphants única mostrar reprodutíveis fenótipos cardíaca quando injetadas com níveis de limiar, embora haja considerável variabilidade biológica ^3,4. Por exemplo, a maioria dos gata5 morphants gerar um coração bífida, com expressão GFP localizados em duas regiões. Isso ocorre porque os progenitores não cardíacas para migrar corretamente para fundir na linha média durante a formação do tubo cardíaco. No entanto, alguns dos gata5 morphants geram um tubo coração defeituoso, e em um pequeno número (5%) há uma diminuição significativa na quantidade de células GFP +. Acreditamos que esta reflete a variabilidade biológica, mas também pode ser devido ao fato de que morpholinos não são equivalentes a uma mutação "nulo".

Da mesma forma, o gata6 morphants todos mostram um fenótipo cardíaco, mas há uma gama de fenótipos, incluindo um pequeno número de bífido aquece, e os corações que são morfológica perturbados em comparação com os embriões controle uninjected. Essa variabilidade não é incomum para um fenótipo morfogenéticos cardíaca, desde a formação do coração é um processo dinâmico e pelo menos alguns dos fenótipo cardíaco pode ser devido indiretamente de defeitos morfogenéticos embrionárias. No entanto, mais importante, a gama de defeitos morfogenéticos cardíaca para morphants tanto gata5 e gata6 é consistente e reprodutível, e na maior parte dos embriões gerar substanciais GFP + cardiomiócitos.

Em contraste com a gata5 e gata6 morphants único, embriões esgotado de ambos os fatores mostram uma perda total de expressão GFP, consistente com uma perda de cardiomiócitos. Assim, gata5 gata6 e cada um tem não redundante funções para a morfogênese cardíaca, mas os dois genes são funcionalmente redundantes em um requisito para a geração de cardiomiócitos diferenciados. Nossos estudos anteriores mostraram também uma perda dos primeiros marcadores de cardiomiócitos, incluindo nkx2.5, sugerindo um requisito para a especificação de cardiomiócitos ^3.

Discussão

No experimento descrito aqui, combinamos duas morpholinos, cada qual por si só gerar uma gama de fenótipos distintos, e encontrou um fenótipo totalmente diferente quando foram co-injetados juntos. É claro, precisávamos de uma justificação para fazer esta experiência, em primeiro lugar. Nós suspeitamos que os dois genes pode compensar o outro para uma função mais cedo, nesta especificação caso cardíaca. Isso ocorre porque os genes são altamente relacionados (e capazes de se ligar às seqüências de DNA me...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fish breeder tanks and dividers	Aquatic Habitats
Fish nets	Aquatic Habitats
System water			60mg Instant Ocean” per liter dH2O
100mm Petri dishes	BD Biosciences	351029
Micropipette needle puller	Sutter Instrument Co.	P-97 Flaming/Brown
3.5" glass capillaries	Drummond Scientific	3-000-203-G/X
Razor blade	Personna Medical Care	94-120-71
Micro grinder	Narishige International	EG-4
Gridded microscope eyepiece	Premiere	MF-02
Micrometer	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Ultrapure agarose	Invitrogen	15510-027
Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Scale	Mettler Toledo	AB54-S/FACT
Disposable weigh dishes	Fisher Scientific	2-202-B
Conventional microwave	GE Healthcare
Erlenmeyer flask	Corning	4980
Microscope slides	Fisher Scientific	12-552
Graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6D
Automatic pipette man	BrandTech	2026333
70% ethanol wash solution	Tarr	801VWR
N2 tank	Tech Air
Microinjector	Harvard Apparatus	PLI-100
Micromanipulator	Micro Instruments	LTD
Dissecting microscope	Nikon Instruments	SMZ1500
Parafilm	American National Can	PM-992
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	34155
gata5 splice site morpholino	Genetools, LLC		5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’
gata5 ATG Blocker	Genetools, LLC		5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’
gata6 Long Isoform ATG Blocker	Genetools, LLC		5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’
Disposable Pasteur Pipette	Fisher Scientific	13-678-20B
Tricaine Methanesulfonate	Argent Labs	MS-222
Methycellulose	ICN Biomedicals	155495
Heat Block	Fisher Scientific	11-718-4
Sharp forceps	Dumont		Size 55
Depression Microslides	VWR international	48339-009