Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

Resumo

Este vídeo mostra como induzir hipofisite auto-imunes em camundongos SJL e como avaliar sua gravidade pela histopatologia.

Resumo

Hipofisite auto-imune pode ser reproduzida experimentalmente pela injeção de proteínas pituitária misturado com adjuvante em camundongos suscetíveis ^1. Modelos de ratos nos permitem estudar a forma como se desenrolam as doenças, muitas vezes fornecendo uma boa réplica dos mesmos processos que ocorrem nos seres humanos. Para algumas doenças auto-imunes, como diabetes tipo 1A, existem modelos (o mouse NOD) que, espontaneamente, desenvolver uma doença semelhante à contraparte humana. Para muitas outras doenças auto-imunes, no entanto, o modelo precisa ser induzida experimentalmente. Uma abordagem comum a este respeito é injetar o mouse com um antígeno dominante derivado do órgão em estudo. Por exemplo, os investigadores interessados ​​em tireoidite auto-imune injetar camundongos com tireoglobulina ^2, e os interessados ​​em miastenia gravis injetá-las com o receptor de acetilcolina ^3. Se o autoantígeno para uma determinada doença auto-imune não é conhecido, os investigadores injetar um extrato de proteína bruta do órgão alvo da reação auto-imune. Para hipofisite auto-imunes, a auto-antígeno patogênicos (s) continuam a ser identificados ^4, e, assim, uma preparação de proteína bruta pituitária é usado. Neste artigo de vídeo demonstramos como induzir hipofisite auto-imune experimental em camundongos SJL.

Protocolo

Protocolo Experimental

Uma vez que o imunógeno pituitária está preparada (ver artigo companheiro), é administrado por via subcutânea em camundongos SJL (The Jackson Laboratories, estoque 000.686). Uma segunda injeção idêntico é repetido sete dias depois. Ratos são então usados ​​para coletar in vivo e post-mortem resultados.

Etapa 1. A injecção subcutânea de imunógeno em camundongos SJL pituitária

Ratos são os primeiros anestesiados pela injeção de 0,5 ml de 20 mg / ml 2,2,2 tribromoetanol (Avertin, TCI América, T-1420) por via intraperitoneal. Camundongos são injetados por via subcutânea com 100 l da emulsão pituitária que, conforme indicado no companheiro JOVE 2181 artigo, contém 1 mg de extrato de pituitária e 0,25 mg de adjuvante de Freund completo. A emulsão é injetado na região dorsal posterior da perna esquerda ((50 mL) e na região inguinal direita (50 mL). A emulsão pituitária é injetado novamente no dia 7 para os sites oposto (50 ul na região dorsal perna direita traseiras e 50 ul na região inguinal esquerda). Camundongos são monitorados diariamente durante os primeiros 3 dias e depois semanalmente até o dia do sacrifício, que normalmente é 28 dias após a primeira imunização.

Etapa 2. Coleção de resultados no vivo: ensaios de Sangue

O tecido mais utilizado para avaliar os resultados experimentais, enquanto os ratos ainda estão vivos é sangue. O sangue é rotineiramente elaborado 14 dias após a primeira imunização para medir os níveis séricos de anticorpos pituitária ou outros marcadores como as citocinas e quimiocinas.

O sangue é coletado de ratos vivem como se segue. Ratos são realizadas de forma segura pela nuca do pescoço e parte de trás do maxilar está localizado. Uma vez que a parte de trás do maxilar está localizado, 4 mm são lancetas usadas para perfurar o feixe vascular submandibular. Após coletar o sangue, a pressão sobre o lugar sobre a área usando um algodão embebido em álcool para evitar um hematoma. Sangue coletado é centrifugado a 2.000 g por 20 minutos, e armazenadas a -80 ° C até sua utilização.

Etapa 3. Coleção de post-mortem resultados: Pituitária histopatologia

Ratos são tipicamente sacrificado 28 dias após a primeira imunização. A característica fundamental necessário para estabelecer o diagnóstico de HAE é a infiltração da glândula pituitária por hematopoiéticas células mononucleares.

Os ratos são sacrificados, colocando-os em uma câmara de plástico selado que é perfundido com CO _2. Camundongos são mantidos na câmara para um total de 8 minutos. Após a eutanásia, a glândula pituitária é coletado como descrito no artigo do companheiro. A glândula pituitária doente aparece inchada e mais firmemente aderente à dura-máter ao redor. Pinças afiadas são usadas para soltar as meninges ao redor da hipófise. Uma vez que o move livremente pituitária no osso esfenóide, uma extremidade da glândula pituitária é apreendido com uma pinça e da glândula pituitária é cuidadosamente levantada. A glândula é então colocada em um tubo de microcentrífuga contendo ⁵ fixador de Beckstead. A glândula pituitária é fixo durante a noite, embrulhado em papel de lente, e colocado em uma fita cassete. As glândulas são então processadas utilizando o protocolo a seguir:

Número da Estação	Reagente	Tempo em minutos	Temperatura (Celsius)
1	Álcool a 70%	5	25
2	Álcool a 70%	15	25
3	Álcool a 95%	15	25
4	Álcool a 95%	15	25
5	Álcool 100%	15	25
6	Álcool 100%	7,5	25
7	Álcool 100%	7,5	25
8	xileno	20	25
9	xileno	20	25
10	xileno	20	25
11	parafina	30	58
12	parafina	5	58
13	parafina	5	58

Após o processamento, as glândulas pituitárias são embebidos em parafina, e pelo menos cinco seções não consecutivas (5 m de espessura) são cortadas a partir de cada glândula. Após a secção, as glândulas são corados com hematoxilina e eosina, e analisadas para quantificar a infiltração mononuclear. A seção com a infiltração mais grave é selecionado para marcar. A gravidade é marcado por base uma estimativa subjetiva do grau de substituição hipófise anterior ou destruição por células do sistema imunológico: grau 0, nenhuma doença; grau 1, 2% -20% envolvimento; grau 2, 20% -30%; grau 3, 30% -50%; grau 4, 50% -90%; grau 5, mais de 90%. Todas as seções são marcados por dois indivíduos cegos para a fonte das seções.

Discussão

Quatro técnicas têm sido relatadas para induzir hipofisite em animais experimentais. A técnica descrita neste artigo, que é a injeção de proteínas pituitária misturado com adjuvante Freund s, é o mais antigo, que remonta a 1967 ^6, e foi melhorado mais recentemente ^1. Outras técnicas são a injeção de glicoproteínas do vírus da rubéola solúveis em 1992 ^7, a injeção estereotáxica de um adenovírus diretamente na glândula pituitária, em 2002 ^8, eo transplante...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SJL mice (The Jackson Laboratories)		stock 000686
2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin)	TCI America	T-1420
Beckstead’s fixative