Microdissecção de Black Widow Aranha Silk glândulas produtoras de

Resumo

Aqui nós descrevemos uma estratégia eficiente para remover as glândulas produtoras de seda do abdômen da fêmea aranha viúva negra. Este procedimento permite o isolamento rápido da produção de seda sete diferentes glândulas de uma forma altamente purificada, um processo importante para os investigadores a estudar a produção de seda de aranha e montagem de fibra.

Resumo

Aranhas modernas produzir fibras de alta performance de seda com uma ampla gama de funções biológicas, incluindo locomoção captura de presas e de proteção de desenvolver ^1,2 filhos. Aranhas realizar essas tarefas, girando várias tipos de fibras distintas, que têm diferentes propriedades mecânicas. Tal especialização de tipos de fibras ocorreu através da evolução de diferentes glândulas produtoras de seda, que funcionam como biofábricas de pequeno porte. Estes fabricação biofábricas e armazenar grandes quantidades de proteínas da seda para a produção de fibra. Através de uma série complexa de eventos bioquímicos, essas proteínas da seda são convertidos de um líquido em um material sólido em cima de extrusão.

Estudos têm demonstrado que a mecânica sedas de aranha são mais fortes que aço de alta resistência ^3. Análises para entender a relação entre a estrutura ea função dos fios de seda de aranha têm revelado que a seda da aranha é constituída principalmente de proteínas, ou fibroins, que repete bloco dentro suas seqüências de proteínas ^4. Comum assinaturas moleculares que contribuem para a resistência à tração incrível e extensibilidade de sedas de aranha estão sendo desvendados através da análise de cDNAs de seda traduzido. Dadas as propriedades do material extraordinário de aranha sedas, laboratórios de pesquisa em todo o mundo estão correndo para compreender e imitar o processo de fiação para produzir fibras de seda sintética para aplicações comerciais, militares e industriais. Um dos principais desafios a fiação de seda de aranha artificial em laboratório de pesquisa envolve um completo entendimento dos processos bioquímicos que ocorrem durante a extrusão das fibras das glândulas produtoras de seda.

Aqui apresentamos um método para o isolamento de sete de produção de seda diferentes glândulas da aranha viúva-negra cobweaving, que inclui as glândulas ampullate maiores e menores [fabrica dragline e andaimes de seda] ^5,6, tubuliform [sintetiza seda caso do ovo] ^{7 , 8,} flagelliform [função desconhecida em cob-tecelões], agregada [faz seda cola], aciniform [embrulho presa sintetiza e tópicos caso do ovo] ⁹ e piriforme [produz apego seda disco] ^10. Esta abordagem baseia-se anestesiar a aranha com gás de dióxido de carbono, a separação posterior do cefalotórax do abdômen, e microdissecção do abdômen para obter as glândulas produtoras de seda. Após a separação dos diferentes glândulas produtoras de seda, estes tecidos podem ser usados ​​para recuperar macromoléculas diferentes para distintas análises bioquímicas, incluindo quantitativos PCR em tempo real, no norte e oeste blotting, espectrometria de massa (MS ou MS / MS) analisa a identificar seqüências de seda novas proteínas, pesquisa de proteínas que participam na via montagem de seda, ou usar o tecido para cultura de células intactas ou experiências histológica.

Protocolo

1. Anestesiar a aranha e isolamento do abdômen

1. Transferência a aranha a partir de um frasco de vidro em uma caixa de papelão forrada com plástico (Figura 1A). Normalmente, coletamos as aranhas de woodpiles, garagens ou arbustos e abrigá-los no laboratório em frascos de vidro. Porque a aranha não pode subir o revestimento de plástico, ela fornece um método eficiente para transferir a aranha a partir de uma jarra de vidro ou lata de café em um pequeno frasco para fins de anestesia. Ao manusear a aranha, neste ponto, você deve estar usando dois pares de luvas de látex ou luvas de jardinagem para fins de segurança.
2. Enquanto a aranha está na caixa forrada com plástico, a abordagem da aranha a partir de sua parte traseira e deixar o slide aranha dentro do frasco de cultura de plástico. Após a aranha entra no frasco, coloque imediatamente a ficha sobre a parte superior (Figura 1B). Recomendamos o uso de um frasco que é de aproximadamente 101,6 milímetros x 31,75 milímetros (L x D). Isso minimiza a quantidade de gás dióxido de carbono necessário para a etapa de anestesiar.
3. Anestesiar a aranha com a introdução do gás dióxido de carbono em 5-10 libras por polegada quadrada de 10 min (Figura 1C). Esta quantidade de gás só vai bater o spider para fora por cerca de 5 min, então depois de anestesiados você deve imediatamente proceder a passos 1,4-1,5.
4. Coloque o spider anestesiados em um prato dissecção pequenas e utilize uma pinça para posicionar a aranha acima do lado dorsal (ampulheta vermelha virada para baixo).
5. O clipe (caule estreito que liga o cefalotórax e abdômen) pedicelo para liberar o abdômen do resto da aranha (Figura 1D). Armazenar o cefalotórax no freezer durante a noite em uma placa de Petri e descartar após congelados no dia seguinte. Tenha cuidado ao mover o cefalotórax como as presas da aranha estão presentes neste segmento.
6. Aperte o abdômen ao material Sylgard no prato dissecção pequena com um pino único inseto. Insira o pino de insetos através do buraco feito a partir do clipping pedicelo (Figura 1E). Isto pode ser facilmente identificado como o local onde o fluido está surgindo a partir do recorte da pedicelo. Verifique se o fieira (extremo oposto do pedicelo) é orientada em direção ao fundo (mais próximo de você).

2. Remoção do exoesqueleto

1. Fazer a primeira incisão através do exoesqueleto usando um par de microtesoura, começando no buraco do clipping pedicelo. Cortar lateralmente até que o lado dorsal é alcançado em ambos os lados (Figura 1F). Usando um par de fórceps, descascar segmento exoesqueleto anterior e inserir um segundo pino neste local. Após a inserção do segundo pino, vire a bandeja de dissecação caudalmente (ângulo de 90 °) de os cortes iniciais lateral e continue até que a corte fiandeiras são atingidos (Figura 1G). Esta incisão será perpendicular ou vertical para o corte inicial lateral. Não cortar o fieiras quando a incisão vertical é feita (em relação posterior à ampulheta e ele tem uma aparência circular). Deixar de inserir o segundo pino resultará no abdômen girando quando as incisões verticais são realizadas.
2. Submergir o abdômen em dissecar solução tampão (0,1 M de cloreto de sódio, citrato de sódio 0,015 M, 0,1% dietílico Pyrocarbonate).
3. Descasque as restantes exoesqueleto de volta a partir da incisão inicial, lateral. Quando isso estiver concluído, o tecido adiposo deve ser claramente visível (Figura 1H).

3. Isolamento das glândulas produtoras de seda

1. Forceps usando começam teasing afastado a camada de gordura (Figura 1H). A gordura vai ter um esbranquiçada à aparência amarelada. Continue até que a maioria da gordura é removida e as glândulas de seda são claramente visíveis. A glândula tubuliform consiste em três pares de muito tempo, os tubos cilíndricos que são abundantes na cavidade abdominal. O ampullate principais, que é encontrado em pares, é uma ampola grande crescente, em forma com uma cauda longa complicado distal e proximal de um duto que diminui de largura medida que se aproxima fiandeiras da aranha. O ampullate menores é muito semelhante na morfologia do ampullate grande, mas é significativamente menores. A glândula flagelliform, ocorrendo também em pares, é redondo e multilobular com uma pequena cilíndrica zig-zag duto que se estende em direção ao fiandeiras. A glândula agregado (encontrado em pares) é uma grande glândula, multilobular que tem um duto excretor muito grande que tem grandes lobos irregular nele. As glândulas aciniform ocorrem em grande número e se assemelham a curto, projeções semelhantes a dedos pequenos. A glândula piriforme é a menor da glândula no abdômen e tem muitas compactado, dutos cilíndricos que se assemelham a um ventilador com muitos pequenos ductos excretores que se estendem até o fiandeiras.
2. Recomendamos a remoção das glândulas, na seguinte ordem: tubuliform, ampullate principais, flagelliform, ampullate menor, agregado, aciniform, e então o piriforme (Figura 2A-B).
3. Começando com o tubuliform, provocar estas glândulas fora do resto do diae glândulas - que deveria estar sentado em cima da outras glândulas (Figura 2A). Há três pares de glândulas tubuliform em uma única aranha. Lhes permitem free float, mas permanecem ligados à sua fiandeiras por seus dutos.
4. Em seguida, provocar longe das glândulas ampullate principais. Existem duas glândulas ampullate principais presentes em uma aranha. Durante o procedimento de remoção, certifique-se os dutos permanecer solidários com as glândulas (Figura 2A).
5. Continuar a provocar o resto das glândulas longe um do outro, trabalhando com cuidado para evitar qualquer punção das glândulas, especialmente agregado e glândulas flagelliform. Cada glândula deve ser livre flutuação todo o caminho até o seu ponto de saída no exoesqueleto ao fiandeiras. Estas glândulas são encontrados também em pares. Retire cada glândula apertando o duto com uma pinça e cuidadosamente puxando até que rompe com o ponto de saída. O ampullate principais, flagelliform, ampullate menor, e as glândulas agregados são encontrados em pares. As glândulas aciniform piriforme e ocorrem em muitos mais pares.
6. Retire cada glândula apertando o duto com uma pinça e cuidadosamente puxando até que rompe com o ponto de saída para baixo pela fieira. Nós normalmente armazenam as glândulas molhada, no entanto, nós não adicionamos buffer adicional.
7. Como as glândulas são removidas, coloque-os em estéreis pré-rotulados tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Glândulas individuais são mostrados na Figura 3A-G. Manter essas glândulas no gelo e depois congelá-los de flash em nitrogênio líquido. Após o congelamento de flash em nitrogênio líquido, colocá-los a -80 ° C para armazenamento.

4. Resultados representante

Ao remover as glândulas diferentes, extremo cuidado deve ser tomado durante o manuseio do flagelliform e glândulas agregado, uma vez que estas duas estruturas podem ser facilmente perfurado e danificados com a pinça. Além disso, é importante notar que morfologicamente as glândulas flagelliform e agregar muito parecidas antes da sua remoção e são frequentemente interligados uns com os outros. Para evitar a contaminação cruzada destes tecidos após a remoção, o dissector deve provocar cuidadosamente estas estruturas separadas. Além disso, após a exposição inicial das glândulas produtoras de seda, as glândulas aciniform piriforme e será o mais difícil de visualizar imediatamente devido ao seu menor tamanho e localização anatômica. Muitas vezes há a presença de muitos ovos. Além disso, cuidado adicional deve ser tomado durante a remoção da glândula piriforme, como este tecido é extremamente pegajoso e, muitas vezes, aderir ao seu fórceps. Quando este procedimento for feito corretamente, é possível obter todas as sete glândulas produtoras de seda a partir de uma única aranha em uma forma altamente purificada. Tipicamente, pode-se recuperar quantidades micrograma de RNA total e proteínas a partir de uma dissecção única aranha. Um exemplo do uso de RNA total de qPCR para examinar os níveis de mRNA de um gene tubuliform fibroína restrito, TuSp1, é mostrada (Figura 4). Experimentos que envolvem proteínas representante lisados ​​coletados das glândulas por exemplo, em solução de digestão tríptica seguido por MS análise (também poderia ser usado para MS / MS análise) ou uma análise da composição de aminoácidos é mostrada (Figura 5-6, respectivamente).

Figura 1. Handling, anestesiando, e remoção do exoesqueleto do abdômen de uma aranha viúva negra do sexo feminino. A) Transferência da aranha em caixa de papelão forrada com plástico para facilitar a movimentação da aranha em um frasco pequeno de plástico. B) Spider colocado em um frasco de plástico com tampa. C) A anestesia do aranha com gás dióxido de carbono. D) Separação do cefalotórax do abdômen com microtesoura. E) Imobilização do abdômen na bandeja de dissecação utilizando os pinos de insetos. F) Ver depois de uma incisão lateral é feita com a tesoura e uma parte do exoesqueleto é pealed de volta com uma pinça. G) As incisões feitas perpendicular ao corte inicial lateral. H) Remoção do exoesqueleto e exposição da camada de gordura.

Figura 2. Visualização das sete diferentes glândulas produtoras de seda, enquanto intactas no abdômen da aranha, bem como os tecidos circundantes. A) As imagens do tubuliform, ampullate principais, flagelliform, agregar, tecidos ampullate menores com ampliação de 12X. B) Imagem das glândulas aciniform e piriforme com ampliação de 12X.

Figura 3. Fotografias das sete glândulas produtoras de seda após a sua retirada do abdômen. Todas as imagens foram capturadas em 20X de ampliação com a exceção do aciniform e glândulas piriforme, que foram feitas em 40X. A major)ampullate glândula; B) ampullate maiores e menores (lado direito) para comparação de tamanho; C) tubuliform; D) flagelliform; E) agregado; F) aciniform; G) piriforme.

Figura 4. Os resultados representativos do padrão de expressão do gene de seda, TuSp1, após levantamento da TuSp1 níveis de mRNA em diferentes glândulas produtoras de seda (excepto a glândula piriforme), utilizando quantitativa PCR em tempo real de isolamento (qPCR), seguindo de RNA total de as glândulas.

Figura 5. Exemplo de MS a análise de extratos proteicos obtidos a partir da glândula piriforme seguir em solução de digestão tríptica. Nota: x2 representa duas vezes a ampliação da intensidade do espectro. Massas espectro de íons peptídeo que correspondem às regiões da fibroína PySp1 são mostrados com o símbolo #.

Figura 6. Resultado típico do perfil de composição de aminoácidos das proteínas extraídas da glândula tubuliform. Nota: ASX = Asp e Asn; GLX = Glu e Gln. Coloração azul reflete aminoácidos com grupos de cadeia lateral polar enquanto coloração vermelha representa resíduos de aminoácidos com grupos apolares cadeia lateral.

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Discussão

Nossa metodologia para a microdissecção das glândulas produtoras de seda da aranha viúva-negra oferece um meio eficaz para obter altamente purificada de seda glândulas produtoras. Dissecções podem ser concluídas em 1,5 a 3 horas, resultando em um conjunto completo de sete distintas seda glândulas produtoras de cobweavers. Obtenção altamente purificada de seda glândula-amostras permite os investigadores a capacidade de executar uma ampla gama de estudos bioquímicos, incluindo a identificação de seda novo o...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Electron Microscopy Sciences	SX0420-1	0.1 M in water
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758 - 5 ml	0.1% v/v
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804 - 1 kg	0.015 M in water
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica MZ16
Digital microscope camera	Leica Microsystems	DFC320	Software - Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors	World Precision Instruments, Inc.	500260
Stainless steel forceps	World Precision Instruments, Inc.	501764	Mini Dumont #M5S
Insect pins	Indigo Instruments	33414-2	Insect pins #2
Small or large dissection dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S or DD-90-S	52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm
Drosophila culture vials	Carolina Biological	FR-17-3076	Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm