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Method Article
Métodos assistidos por computador romance de grande escala de aquisição e análise de amostras de imunohistoquímica do pâncreas manchadas são descritos: (1) capturar Slice Virtual de toda a seção, (2) a análise em massa de dados em grande escala, (3) Reconstrução de 2D Slices Virtual ; (4) mapeamento 3D ilhéu, e (5) Análise Matemática.
A ilhota do pâncreas é um órgão único micro-composto de várias células secretoras de hormônio endócrino, tais como células-beta (de insulina), alfa-células (glucagon), e células-delta (somatostatina) que são incorporados nos tecidos exócrinas e compreendem 1 - 2% do pâncreas inteiro. Há uma estreita correlação entre o corpo eo peso do pâncreas. Massa das células beta total também aumenta proporcionalmente para compensar a demanda por insulina no organismo. O que escapa dessa expansão proporcional é a distribuição de tamanho de ilhotas. Animais de grande porte, tais como os seres humanos compartilham distribuições de ilhotas de tamanho similar com camundongos, sugerindo que este órgão tem um micro-determinado limite de tamanho para ser funcional. A incapacidade dos animais de grande porte pancreata para gerar ilhotas proporcionalmente maior é compensado por um aumento no número de ilhotas e por um aumento na proporção de ilhotas maior em sua distribuição geral das ilhotas tamanho. Além disso, ilhotas exibem uma plasticidade impressionante na composição celular e arquitetura entre diferentes espécies e também dentro da mesma espécie em diferentes condições fisiopatológicas. No presente estudo, descrevemos novas abordagens para a análise de dados de imagem biológica, a fim de facilitar a automação de processos analíticos, que permitem a análise de coletas de dados grandes e heterogêneas no estudo de processos biológicos, tais dinâmicas e estruturas complexas. Tais estudos foram prejudicados devido a dificuldades técnicas de amostragem imparcial e gerando grande escala conjuntos de dados precisamente captar a complexidade dos processos biológicos da biologia das ilhotas. Aqui nós mostramos métodos para coletar imparciais "representante" de dados dentro da disponibilidade limitada de amostras (ou para minimizar a coleta de amostras) e as configurações padrão experimental, e analisar com precisão a estrutura tridimensional e complexa do ilhéu. Assistida por computador a automação permite a recolha e análise de conjuntos de dados em grande escala e também assegura a interpretação imparcial dos dados. Além disso, a quantificação precisa da distribuição de tamanho das ilhotas e coordenadas espaciais (ou seja, X, Y, Z-posições), não só leva a uma visualização precisa da estrutura das ilhotas pancreáticas e composição, mas também nos permite identificar padrões durante o desenvolvimento e adaptação às condições alterando através da modelagem matemática. Os métodos desenvolvidos neste estudo são aplicáveis a estudos de muitos outros sistemas e organismos também.
1. Criar Slices Virtual de imunohistoquímica Imagens Stained
2. Assistida por computador Análise Bidimensional
Quantificação de Ilhotas
Análise computacional e Setup Histograma
3. Reconstrução tridimensional de Dois Dimensional imunohistoquímica Stained Imagens Slice Virtual
Reconstrução 3D de Fatias Virtual
4. Mapeamento Islet
Coleta de Pilhas de imagens
Mapeamento Stacks Imagem
5. Resultados representativos:
A preparação de fatias Virtual a partir de uma amostra de pâncreas imunohistoquímica manchada capacita a pessoa a examinar todas as células endócrinas (alfa, beta e delta-células) no pâncreas todo, tanto em conjunto como ilhotas (Figura 1A) e individualmente em canais separados ( Figura 1B). Com o auxílio de programas de computador e scripts, uma análise de massa de dados em grande escala podem ser realizadas sobre essas fatias Virtual. Especificamente, a análise de partículas de máscaras composto (Figura 1C) é a saída como uma tabela contendo estatísticas parâmetros como ilhéu área, perímetro (a distância em torno de uma área), a circularidade (um grau de circularidade, onde 1.0 representa um círculo perfeito), e Feret diâmetro (a maior distância dentro de uma área) para cada ilhota detectado (Figura 1D). A análise de larga escala destes resultados imagens na produção do número de ilhotas total e histogramas distribuição de tamanho, bem como uma comparação detalhada de alfa-, beta-e delta-célula áreas. Além disso, cada Slice Virtual é levado a uma profundidade de aproximadamente 5 mm, e todos do indivíduo 2D Slices Virtual são ainda empilhadas para criar uma reconstrução 3D da amostra de pâncreas inteiro. Mapeamento das ilhotas demonstra outra instância, não só de capturar ilhotas em 3D, mas também de análise assistida por computador detalhadas. Mapeamento de ilhotas consiste na captura de ilhotas distintos (Figura 2A) ea subsequente marcação de alfa, beta-e delta-células em várias Z-aviões (Figura 2B) para visualizar uma ilhota em 3D (Figura 2C, D). Análise matemática automatizado de ilhotas mapeadas exibe sua composição celular e arquitetura, incluindo a célula-distâncias (Figura 2E) e distribuições de probabilidades cumulativas de célula-distância (Figura 2F).
Figura 1. Grande escala de captura e análise da distribuição das ilhotas usando Slice Virtual. A. slices Virtual de uma seção de pâncreas humano. a. Coloração imuno-histoquímica de insulina (verde), glucagon (vermelho), somatostatina (branco) e DAPI (azul). b. Convertidos de 8 bits da máscara após limiarização automática. A área de box é ampliado no BB Visualizações de cada canal. a. delta-células, b. células-beta, c. alfa-células, e d. fundiram imagem composta. C. A análise da partícula efectuadas sobre máscara de composto. Note-se que cada estrutura de ilhotas incluindo grupos de células pequenas é numerado (destaque em azul). D. Estatísticas tabela de vários parâmetros medidos para estruturas individuais, que têm IDs que correspondem às etiquetas mostrado na C.
Figura 2. Análise de Slice Virtual imuno-histoquímica. A. gráfico de dispersão 3D da Figura 1 mostra o tamanho ea forma de distribuição de cada ilhota por parâmetros como área, circularidade e diâmetro Féret. B. gráfico de dispersão 3D da Figura 1 mostra a composição celular das ilhotas e tamanho. C. distribuição de tamanho de Islet da análise seção inteira humana a partir da Figura 1 equipado com uma distribuição lognormal densidade de probabilidade. D. Análise Matemática dos rácios de composição celular (células-beta em verde, as células alfa-delta em vermelho e as células em azul) para cada bin diâmetro das ilhotas eficaz da Figura 1. E. a. Islet distribuição de tamanho de análise de amostragem aleatória imuno-histoquímica (esquerda). Islet distribuição de tamanho de análise fatia virtual (direita). b. Log-normal comparação trama de análise de amostragem aleatória imuno-histoquímica (vermelho) e fatia virtual (azul).
Figura 3. Islet mapeamento e análise matemática da composição celular e arquitetura. A: captura de tela que mostra um único plano focal de uma pilha de reconstrução 3D de imagens de uma ilhota humano carregado em Stereo Investigator (beta-células em verde, alfa-células em vermelho, delta-células em branco, e núcleos em azul) . B: imagens de fluorescência (esquerda) e correspondentes dados mapeados (direita) em três diferentes planos focais mostrado em um intervalo de 10 mM. C: Vista Representante de dados de mapeamento 3D reconstruídas das ilhotas. D: reconstrução 3D do quarto em fatias ilhota com base nas coordenadas obtidas pelo mapeamento das ilhotas. E: A análise matemática da composição celular e arquitetura. Left. Freqüência relativa de célula a célula, as distâncias entre as duas células em uma população única célula. Direita. Freqüência relativa de célula a célula, as distâncias entre as duas populações celulares diferentes. F: Kolmogorov-Smirnov (KS). Esquerda. Probabilidades cumulativas de célula a célula à distância para distribuições alfa-to-alfa, beta-de beta-e delta-to-delta células. Direita. KS distâncias para o correspondente três probabilidades cumulativas.
O assistida por computador visualização de grande escala e quantificação apresentada aqui pagar quatro pontos-chave em estudos de ilhotas pancreáticas: (1) A análise de larga escala de espécimes pancreático oferece uma visão abrangente da distribuição global de ilhotas tamanho e arquitetura da ilhota. (2) A reconstrução em 3D e análise matemática da composição celular e arquitetura facilitar ainda mais a análise do arranjo espacial de células endócrinas dentro de uma ilhota. (3) plasticidade ilhota S...
O estudo é apoiado por EUA Public Health Service Grant DK-081527, 072473 e DK-DK-20595 para a Universidade de Chicago Diabetes Centro de Pesquisa e Treinamento (Core modelos animais), e um presente da Fundação Família Kovler.
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Fluorescent microscope | Microscope | Olympus Corporation | IX-81 | |
Stereo Investigator | Program | MBF Bioscience | ||
MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
Mathematica | Program | Wolfram | ||
Image J | Program | National Institutes of Health | ||
Slidebook | Program | Olympus |
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