Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

Resumo

Demonstramos no vídeo um método para produzir uma oclusão da artéria cerebral média em ratos adultos utilizando um monofilamento intraluminal. Também mostramos como avaliar a extensão do infarto cerebral por 2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto de coloração (TTC).

Resumo

AVC é a mais comum doença neurológica fatal nos Estados Unidos ^1. A maioria dos acidentes vasculares cerebrais (88%) resultam de bloqueio dos vasos sanguíneos no cérebro (acidente vascular cerebral isquêmico) ^2. Como a maioria dos acidentes vasculares cerebrais isquêmicos (~ 80%) ocorrem no território da artéria cerebral média (MCA) ^3, muitos modelos animais AVC que têm sido desenvolvidos se concentraram nesta artéria. O modelo de monofilamento intraluminal de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) envolve a inserção de um filamento cirúrgico na artéria carótida externa e enfiando-o em direção à artéria carótida interna (ACI), até a ponta oclui a origem do MCA, resultando em uma cessação do fluxo sanguíneo e infarto cerebral subseqüente no território MCA ^4. A técnica pode ser usada para modelar a oclusão permanente ou transitória ^5. Se a sutura é removido após um certo intervalo (30 min, 1 h ou 2 h), reperfusão é alcançada (MCAO transitória), se o filamento é deixado no local (24 h) o procedimento é adequado como um modelo de MCAO permanente . Esta técnica não requer craniotomia, um procedimento neurocirúrgico para remover uma parte do crânio, o que pode afetar a pressão intracraniana e temperatura ^6. Tornou-se o método mais utilizado para imitar permanentes e transitórios de isquemia cerebral focal em ratos e camundongos ^7,8. Para avaliar a extensão do infarto cerebral, que mancha com fatias de cérebro de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) para identificar o tecido cerebral isquêmico ^9. Neste vídeo, demonstramos o método MCAO ea determinação do tamanho do infarto pela coloração TTC.

Protocolo

1. Método MCAO

Este protocolo foi aprovado pelo Institutional Animal Care e Comitês Use em UCSF e Kent State University, e age de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para o uso de animais experimentais.

1. Cortar uma sutura de monofilamento 5-0 (Harvard Apparatus, Holliston, MA) em 20 segmentos mm. Rodada na ponta de cada segmento, por aquecimento, perto de um cauterizador (Braintree Scientific, Inc., Braintree, MA). Medir o diâmetro da ponta usando um micrômetro (Applied Image Inc., Rochester, NY). Usamos uma sutura com um diâmetro da ponta final de 0,21-0,22 mm para um mouse com peso corporal de 25-30 g.
2. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos por autoclave (mínimo 121 ° C, 15 PSI, por 15 min). Higienizar a mesa de cirurgia e equipamentos associados que utilizam etanol 70%.
3. Anestesiar um rato 8-12 semanas de idade (25-30 g) com 5% de isoflurano (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) em 30% O ₂ / 70% N ₂ O usando o sistema V-10 Anestesia (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). Após a indução da anestesia, reduzir o nível de isoflurano e mantê-la em 1,5%.
4. Posicione o mouse na posição supina sobre uma almofada de aquecimento. Introduza uma sonda retal, e monitorar e manter a temperatura corporal entre 36,5-37,5 ° C usando o TR-200 do sistema de temperatura homeotérmicos (Fine Ciência Tools Inc., Foster City, CA).
5. Raspar o pêlo na região do pescoço ventral com tosquiadeiras elétricas (Braintree Científica) para expor a pele. Desinfectar o local da cirurgia por meio de três aplicações de etanol 70%.
6. Sob um microscópio estéreo de dissecação (Nikon, Japão), fazer uma incisão longa um centímetro da linha média do pescoço. Use retratores (Braintree Científica) para expor o campo cirúrgico e identificar a artéria carótida comum direita (CCA), artéria carótida externa (ACE), e da artéria carótida interna (ACI). Dissecar cuidadosamente as artérias livres de ao redor dos nervos e fáscias.
7. Dissecar o ECA ainda mais distalmente e coagular o ECA e sua artéria tireoidiana superior ramo (STA) utilizando um coagulador bipolar (Howard Instrument Inc., Tuscaloosa, AL). Corte o ECA e STA no segmento coagulado.
8. Vagamente empate 8-0 duas suturas de seda ao redor do coto ECA. Aplicar uma pinça vascular (Ferramentas Ciência Fine) na bifurcação da CCA para a ECA e ICA.
9. Fazer uma pequena incisão no final da ECA toco com uma tesoura Vannas estilo de mola (Ferramentas Ciência Fine). Medir e registrar o comprimento de uma sutura de monofilamento 5-0 arredondadas na ponta. Inserir a sutura na incisão e avançar para o grampo. Aperte os dois fio de seda ao redor do lume apenas o suficiente para preservar a mobilidade segura e da sutura de monofilamento na habitação.
10. Retire o grampo da bifurcação. Suavemente antecedência a sutura de monofilamento do lúmen do ECA no ICA por uma distância de 9-10 mm além da bifurcação da CCA para ocluir a origem do MCA. A duração da cirurgia é de cerca de 30-45 min.
11. Suturar a incisão no pescoço e coloque o mouse em uma caixa de 35 ° C de enfermagem para se recuperar da anestesia, e devolvê-lo para a jaula. Geralmente leva 50-10 min para os ratos a recuperar da anestesia. Para executar MCAO transitória, o pesquisador pode re-anestesiar o rato e retirar a sutura de volta para o coto do ECA, após um período de tempo, geralmente entre 0,5-2 h.
12. Vinte e quatro horas após a indução da MCAO, anestesiar o rato com 5% de isoflurano e sacrificá-lo por deslocamento cervical. Decapitar o mouse e recolher o cérebro. Fatia do cérebro coronariamente em quatro fatias de 2 mm com uma matriz cérebro (Braintree Científica) no gelo. Incubar as fatias de cérebro em 2% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) (Sigma-Aldrich) em 1X PBS por 20 min em temperatura ambiente para determinar o tamanho ea extensão do infarto. Corrigir as fatias de cérebro em 10% neutra tamponada de formalina (Sigma-Aldrich) a 4 ° C até de imagem. A extensão do infarto pode ser quantificado, conforme descrito no protocolo JOVE 955 ( https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) ^9.

2. Resultados representante

Os infartos gerada pelo MCAO são vistos no estriado e do córtex dorsolateral. O striatum é mais sensível à isquemia do que o córtex cerebral. Trinta minutos de MCAO irá produzir apenas um infarto no corpo estriado, enquanto que mais de uma hora de MCAO irá danificar o estriado e córtex. Após 24 h MCAO permanente, o percentual total de infarto é de aproximadamente 40 ± 5% do hemisfério ea taxa de mortalidade após a cirurgia é de aproximadamente 10%. Excluímos ratos a partir de estudos ainda se ocorre sangramento excessivo durante a cirurgia, o tempo de operação superior a 90 min, os ratos não conseguem se recuperar da anestesia dentro de 15 min, ou hemorragia é encontrado no cérebro ou fatias na base do círculo de Willis durante o exame post-mortem .

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Figura 1. Imagens representativas de fatias TTC-manchada cérebro (nível coronal 1-4) após 24 h de MCAO permanente. Em tecidos vivos TTC é enzimaticamente reduzido em desidrogenases a 1,3,5-triphenylformazan (TPF), que é de cor vermelha, enquanto em áreas necróticas permanece branca devido à ausência de atividade enzimática tal. Portanto, a área de infarto podem ser identificados por sua cor branca, devido à falta de conversão de TTC para TPF. Nota: TTC é um pouco de calor e luz instável para proteger cortes corados do calor e da luz, tanto quanto possível.

Discussão

MCAO em camundongos é comumente usado para modelo de isquemia cerebral focal em seres humanos. Utilização de camundongos para estudos de acidente vascular cerebral tem se tornado mais freqüentes por causa da disponibilidade de linhagens transgênicas e nocaute. Há alguns detalhes importantes para se notar no protocolo:

1. É essencial para manter a temperatura corporal do rato durante a cirurgia e antes que ele se recupera totalmente da anestesia. Temperatura do corpo tem efeitos sobre a extensão do infarto, diminui a hipotermia e hipertermia aumenta o tamanho do infarto.
2. Enquanto expor e isolar o PCC e ECA, não danificar o nervo vago nas proximidades e traquéia, o que poderia aumentar o tamanho do infarto e viabilidade diminuir.
3. Nunca insira a sutura de monofilamento mais de 10 mm passar a bifurcação. A sutura inserido longe demais pode perfurar a artéria cerebral anterior e resultar em hemorragia cerebral. A resistência pode ser sentida quando a sutura é avançado cerca de 9-10 mm além do ponto de bifurcação. Se isso ocorrer, o pesquisador deve parar o avanço da sutura e confirmar a distância.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Chemical	Baxter Internationl Inc.	95045-588
V-10 Anesthesia system	Equipment	VetEquip	901807
TR-200 Temp Controller	Equipment	Fine Science Tools	21060
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	CLP-9931
Dissecting microscope	Equipment	Nikon Instruments	SMZ745T
Retractor system	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	ACD-014
Bipolar coagulator	Equipment	Howard Instrument	64000
Silk suture	Material	Harvard Apparatus	510479
Monofilament suture	Material	Harvard Apparatus	723351
Vascular clamp	Equipment	Fine Science Tools	00396-01
Vannas scissor	Equipment	Fine Science Tools	15000-08
Brain matrix	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	BS-2000C
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma-Aldrich	T8877
10% neutral buffer formalin	Chemical	Sigma-Aldrich	HT5011