A manipulação experimental de tamanho do corpo para Estimar Relacionamentos Scaling morfológicas em Drosophila</em

Resumo

Relações de escala morfológica captar e descrever a forma do organismo. Nós apresentamos um método para medir as relações de escala morfológica em toda a gama natural de tamanhos de corpo dos insetos totalmente metamórfica. Usando uma simples manipulação da dieta que aumentar a distribuição de tamanhos de traço, permitindo a descrição exata de como a forma e tamanho co-variar.

Resumo

O dimensionamento de partes do corpo é uma característica central da morfologia animais ^1-7. Dentro da espécie, características morfológicas precisam ser corretamente proporcionada ao corpo para o organismo para funcionar; indivíduos maiores normalmente têm partes maiores do corpo e indivíduos menores geralmente têm partes menores do corpo, de modo que a forma do corpo em geral é mantida através de uma variedade de tamanhos de corpo adulto. A exigência de proporções corretas significa que os indivíduos dentro das espécies geralmente apresentam baixa variação no tamanho característica relativa. Em contraste, tamanho característica relativa pode variar drasticamente entre as espécies e é um mecanismo primário pelo qual a diversidade morfológica é produzido. Mais de um século de trabalho comparativo estabeleceu essas intra e interespecífica padrões de ^3,4.

Talvez a abordagem mais amplamente usado para descrever esta variação é calcular a relação de escala entre o tamanho de dois traços morfológicos, utilizando a equação alométrica y = bxα, onde x e y são do tamanho de dois traços, como órgão e tamanho do corpo ^{8 , 9.} Esta equação descreve a relação intra-grupo de escala (por exemplo, espécies população,) entre dois traços que ambos variam em tamanho. Log-transformação desta equação produz uma simples equação linear, log (y) = log (b) + αlog (x) e log-log parcelas do tamanho de diferentes características entre os indivíduos da mesma espécie tipicamente revelam escala linear com intercepto de log (b) e uma inclinação de α, o chamado "coeficiente alométrico ^'9,10. Variação morfológica entre os grupos é descrito por diferenças na escala intercepta relacionamento ou pistas para um par de determinado traço. Conseqüentemente, a variação nos parâmetros da equação alométrica (b e α) elegantemente descreve a variação forma capturado no relacionamento entre órgãos e tamanho do corpo dentro e entre grupos biológicos (ver ^11,12).

Nem todos os traços de escala linearmente com o outro ou com o tamanho do corpo (por exemplo, ^13,14) Assim, as relações de escala morfológicas são mais informativos quando os dados são retirados da vasta gama de tamanhos de traço. Aqui nós descrevemos como simples manipulação experimental da dieta pode ser usado para produzir toda a gama de tamanho do corpo dos insetos. Isto permite uma estimativa da relação de escala total para um dado par de características, permitindo uma descrição completa de covaries como a forma com o tamanho e uma comparação robusto de parâmetros de escala do relacionamento entre os grupos biológicos. Embora nos concentremos em Drosophila, nossa metodologia deve ser aplicado a quase qualquer inseto totalmente metamórfica.

Protocolo

1. Criação e manipulação da dieta para produzir variação no tamanho do corpo e da asa tamanho

Racional e Visão. A expressão das relações de escala em última análise, depende da regulamentação processos de desenvolvimento que produzem variação no órgão final e tamanho do corpo. Estes processos são melhor descritos no trabalho de insetos totalmente metamórfica (ie, holometabolous), como D. melanogaster, onde órgãos crescer como indiferenciado "discos imaginais" dentro do grub-como larva ^11,15-17. Em Drosophila, órgão final e tamanho do corpo são regulados pelo crescimento durante as fases larval; larvas crescem através do primeiro e segundo instar larval até atingirem um peso mínimo viável para a eclosão (MVW _E) para o início do terceiro instar larval ^18. Fome antes da realização MVW _E impede a eclosão dos adultos. No entanto, as larvas que estão sedentos de MVW _E gerar adultos viáveis, embora a um tamanho muito pequeno. Isto é porque reduziu a nutrição durante o desenvolvimento corporal final e reduz tamanho do órgão, e não apenas em moscas, mas em quase todos os animais ^19-21. Ao manipular a disponibilidade de alimentos após MVW _E é atingido, mas antes de pupação ocorre, é possível induzir extrema plasticidade fenotípica no tamanho do corpo que supera em muito outras fontes de variação (por exemplo, a variação genética individual).

1. Os ovos são recolhidos junto da população a ser fenotipados, dividido em lotes de 50 e colocados em frascos contendo 10 ml de alimento voar padrão. Porque oviposição ocorre continuamente, os ovos são coletados a cada 24 horas durante três dias, produzindo três coortes de idade.
2. Quando o mais velho de coorte atinge o estágio errantes ou está apenas começando a pupate, a manipulação da dieta é aplicada. Neste ponto, a coorte mais velha é muito além do MVW _E, o mais jovem de coorte é muito próximo do _E MVW e da coorte restantes está em algum lugar entre esses extremos. Assim, a supressão dos alimentos neste momento irá produzir adultos muito grande a partir da coorte mais velha, adultos muito pequena da coorte mais jovem e de tamanho intermediário adultos da coorte de remanescentes. Para remover as larvas dos frascos, aproximadamente 5 ml de solução de sacarose 40% é adicionado a todos os frascos. Para liberar as larvas, a comida é agitada por 15-20 minutos em uma mesa shaker definida para uma velocidade intermediária.
3. Larvas flutuantes são removidos da solução de sacarose com um pincel (00) fina, colocados em frascos contendo um tampão de algodão molhado e permitiu a pupate. Alternativamente, as larvas podem ser colocados em um aditivo alimentar não digeríveis, como metil-celulose ^22.

2. Estimativa do tamanho do corpo

Racional e Visão. Estudos anteriores indicam que o comprimento do tórax é um menos de procuração ideal para o tamanho total do corpo ^22. Em vez disso, usamos tamanho pupal como uma medida de tamanho do corpo. Tamanho corporal máximo é fixado a cessação da alimentação que antecede a pupação. Como resultado, há uma estreita correlação entre o tamanho da pupa e adulto tamanho corpo ^23.

1. Pupas são dispostas lado ventral para cima em lâminas de vidro para microscópio e fotografada usando uma câmera digital acoplada a um microscópio de dissecação. Cada imagem é capturada, atribuído um código de identificação único e transferidos para um computador através de uma transmissão ao vivo de conectar a câmera digital para o computador.
2. Pupas com imagens são movidas para cada 2 ml contendo 1ml epitubes de alimentos voar, identificado com o código único para cada indivíduo, e puncionada com respiradouro para permitir a troca de gás.
3. Tamanho pupal é estimado como o número de pixels da silhueta pupal. Métricas de outro tamanho também pode ser usado.

3. Traço estimativa do tamanho (asa)

Racional e Visão. Para asas de imagem, usamos uma 'asa grabber' ^24, que puxa e prende a asa de um viver perpendicular voar, anestesiados ao seu corpo. Pressionado entre dois pedaços de vidro, isto permite que a asa a ser trabalhada como um objeto bidimensional.

1. Moscas são anestesiados levemente com CO ₂ e colocado em posição no grabber asa em um microscópio de dissecação equipado com uma câmera digital que é conectado a um computador.
2. A ala é fotografada e guardada sob o código único para cada indivíduo.
3. Tamanho da asa pode ser estimada utilizando o polígono convexo mínimo que circunscreve marginal marcos fixo ou como a contagem de pixels da silhueta da asa.

4. Estimativa de relação de escala

1. Os dados são partilhados com outras gerações, mas separadas por sexo e log-transformada.
2. Relações de escala estão aptos para os dados de tamanho usando Tipo II (ou seja, redução do Eixo Maior) de regressão (ver revisão em ¹²⁾ e os parâmetros estimados para cada grupo.

5. Resultados representativos:

tenda "> Nossa manipulação da dieta irá produzir uma ampla gama de tamanhos de corpo (Figura 1) e tamanhos traço (Figura 2). Plotagem os traços log transformados uns contra os outros revela seu padrão de covariação dentro de um determinado grupo biológico e permite ajustar a relação de escala para o grupo (Figura 3). extração dos parâmetros relação de escala que descrevem como escalas forma com o tamanho do corpo permite a comparação de covaries como a forma com tamanho entre os grupos.

Figura 1. Pupa dos extremos da distribuição de tamanho produzido através de manipulação de dieta após indivíduos alcançar o _E MVW. Imagens reais pupal são mostrados à esquerda com suas silhuetas correspondente para a medição do tamanho pupal à direita. Barra de escala é de 1mm.

Asas figura 2. Tirado extremos da distribuição de tamanho corporal produzida por meio de manipulação da dieta após indivíduos alcançar o _E MVW. Imagens ala real são mostrados à esquerda com suas silhuetas correspondente para a medição do tamanho da asa mostrado à direita. Barra de escala é de 1mm.

Figura 3. Asa-corpo de escala de tamanho de Drosophila melanogaster por sexo. Dados log-transformados para os indivíduos de cada sexo, que foram totalmente alimentado (círculos escuros), uma fome (círculos cinza) ou dois dias (círculos abertos), como larvas. Tipo de linha de regressão II é mostrado para cada sexo. Entre cada faixa etária, o declínio na área de asa média de 0,1 milímetros ~ (~ 7%) e ~ 0,2 milímetros (~ 8%) ocorre, aumentando a gama total de fenótipos observados. As regressões revelam que as fêmeas são ligeiramente hypoallometric para esta relação de escala (inclinação de 0,96), enquanto os machos são ligeiramente hyperallometric (inclinação 1,06).

Discussão

Escala morfológica tem sido objeto de intenso estudo em biologia evolutiva por quase um século. Mais recentemente, a base próxima da regulação do crescimento e ampliação tornou-se cada vez mais importante no desenvolvimento, fisiologia e genética (por exemplo, visualizar em ^{12,15,23-25).} Nossa metodologia permite estimar relações de escala morfológica em toda a gama de traço e tamanhos de corpo. Isso pode ser importante, como o tamanho do traço pode não escala linearmente com o tamanho do corpo (por exemplo, ^13,14). No entanto, isso pode não ser aparente se os animais são criados somente sob condições de laboratório ideal.

Embora o nosso protocolo foi desenvolvido explicitamente para permitir uma estimativa da relação de escala de asa-corpo tamanho em Drosophila, ele pode ser usado com o traço específico de modificação para estimar a relação de escala para qualquer característica morfológica em moscas. Da mesma forma, a manipulação da dieta pode provavelmente ser usado para produzir toda a gama de tamanhos de traço e corpo em outros insetos totalmente metamórfica; aplicações como simplesmente exigir saber quando o MVW _E é atingida e aplicar a manipulação nesse ponto na ontogenia.

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