Usando uma abordagem comparativa de espécies para investigar o Neurobiology of Responses Paternal

Resumo

A abordagem comparativa permite que os neurocientistas espécies de comportamento para explorar vários fatores neurobiológicos associados com comportamentos específicos vistos como característica de um modelo animal específico. Aproveitando naturalmente diferenças de comportamento entre espécies estreitamente relacionadas, esta técnica não requer técnicas invasivas para manipular a expressão do comportamento.

Resumo

A meta de neurociência comportamental é identificar fatores neurobiológicos subjacentes que regulam comportamentos específicos. Utilizando modelos animais para alcançar esse objetivo, muitas estratégias metodológicas requerem técnicas invasivas para manipular a intensidade do comportamento de interesse (por exemplo, os métodos de lesão, manipulações farmacológicas, técnicas de microdiálise, modelos de engenharia genética animal). A utilização de uma abordagem comparativa de espécies permite aos pesquisadores para aproveitar diferenças que ocorrem naturalmente em estratégias de resposta existentes em espécies estreitamente relacionadas. Em nosso laboratório, usamos duas espécies do gênero Peromyscus que diferem nas respostas paternal. O rato veado macho Califórnia (Peromyscus californicus) apresenta as mesmas respostas dos pais quanto a fêmea enquanto seu primo, o mouse veado comum (Peromyscus maniculatus) exibe praticamente nenhuma resposta nurturing / parental, na presença de filhotes. De interesse específico neste artigo é uma exploração dos fatores neurobiológicos associados com as respostas sociais afiliativo exibido pelo mouse paternal veados Califórnia. Porque a abordagem da neurociência comportamental é multifacetada, os seguintes componentes-chave do estudo serão brevemente abordadas: a identificação de espécies adequadas para este tipo de pesquisa; recolha de dados para análise comportamental; preparação e corte do cérebro; passos básicos envolvidos na imunocitoquímica para a quantificação da imunorreatividade vasopressina; o uso de neuroimagem software para quantificar o tecido cerebral, o uso de uma análise de vídeo para marcar microsequencing comportamento e, finalmente, a análise estatística apropriada para fornecer as interpretações mais informado dos resultados da investigação.

Protocolo

1. Identificação do Modelo Animal

1. O rato de cervos Califórnia (Peromyscus californicus) é um modelo ideal para explorar respostas paternal. Como você vê, este rato noivos os filhotes assim como as mães fazem - eles até se agachar sobre eles de forma que parece que os filhotes são de enfermagem. O comportamento dos camundongos Califórnia é comparado a uma espécie do mesmo gênero, o mouse veado comum (Peromyscus maniculatus), que apresenta pouco interesse em crias, muitas vezes, tentando escapar ou mesmo atacá-los. (Veja a Figura 1 para fotos dessas espécies que interagem com filhotes).
2. Uma vez que o modelo de espécies tem sido identificado em seguida, os vários grupos precisam ser estabelecidos. Neste estudo, os pais biológicos, as virgens sem experiência parenting, e virgens com exposição limitada cachorro (filhote de cachorro-expostos ou pais adotivos) de ambas as espécies são usadas de modo que ambos predispostos e adquiriu características paternal pode ser avaliado. Neste estudo em particular também expostos todos os grupos para um rato de brinquedo cachorro para assegurar que as interações sociais eram específicas para um filhote de cachorro e não um representante de resposta a qualquer coisa colocada na gaiola (Figura 2).
3. Antes de investigar fatores neurobiológicos, é importante para confirmar que as espécies escolhidas apresentam diferenças claras no comportamento de interesse. Neste estudo, os machos são colocados em uma gaiola com um filhote de cachorro por cinco minutos e um etograma comportamento paterno (ver Tabela 1 para exemplo do etograma) é usado para comportamentos pontuação, tais como a latência para a abordagem do filhote e da quantidade de tempo gasto em contato com o filhote. Se as respostas agressivas são observados, o filhote é removido imediatamente. Estas sessões são muitas vezes filmadas para uma análise cuidadosa do comportamento pode ser posteriormente realizado.

2. Preparar Tecido Cerebral

1. Após uma perfusão padrão de cada mouse (protocolo em anexo), os cérebros são removidos de modo que possam ser seccionado na área específica de interesse (cérebro show).
2. Um mouse padrão atlas do cérebro (show atlas) é usado para localizar o núcleo paraventricular do hipotálamo, uma área conhecida por ser rica em células que produzem o neuropeptídeo de interesse neste estudo - vasopressina (AVP).
3. O cérebro é bloqueada e montado sobre um mandril de congelamento para que o tecido vai congelar antes de ser seccionadas com o micrótomo. O cérebro é seccionado em um modo de cortar até marcos específicos são identificados, em seguida, a espessura específicas do cérebro, 30 microns, neste caso, está marcada para as seções do cérebro utilizada para a análise.
4. As seções do cérebro são cuidadosamente colocados em placas bem preenchido com tampão fosfato salina (PBS); (protocolo para PBS em anexo, por favor note que este é apenas um exemplo de um protocolo padrão imunocitoquímica).

3. Imunocitoquímica

1. Ao longo das várias etapas desse processo (ver protocolo em anexo), é importante ter competências precisas de pipetagem para garantir medições precisas de produtos químicos e outros ingredientes importantes para esta técnica (pipetagem estudante show).
2. O primeiro passo neste processo é a lavagem do cérebro que envolve a substituição da PBS nos pratos bem três a cinco vezes, entre cada lavagem as placas assim são colocados em uma rocker por 10 minutos (show estudante substituindo PBS e colocando placas bem em rockers) .
3. As fatias de cérebro são, então, expostos à solução de anticorpo primário e armazenados a 4 ° C durante a noite sobre o rocker (processo seriado).
4. Após outra lavagem, as fatias de cérebro são expostos a um anticorpo secundário durante uma hora sobre o roqueiro à temperatura ambiente, lavadas novamente.
5. Em seguida, os cérebros são expostos a uma solução Avitin-Biotina Complexo de se preparar para a visualização das células neuroquímicas positivo.
6. Para a etapa de visualização final, o cérebro é exposto a DAB. Este é um produto perigoso e deve ser sempre manuseados com cuidado. Como pode ser visto aqui, as fatias de cérebro começam a ficar mais escuro diante de seus olhos (show de processo).
7. Após a exposição DAB, o cérebro passar a última série de lavagens e depois são cuidadosamente colocados sobre lâminas de microscopia subbed e deixa-se secar durante a noite (show a colocação de uma fatia do cérebro em um slide, ver anexo para o protocolo slides subbed).
8. Os slides são então apuradas através de uma série de lavagens de água destilada e álcool, de finalmente ser submerso em Citrosolv antes de ser lamínulas e armazenados em um slidebox para se manter seguro (mostrar vários aspectos deste processo, ver anexo para o processo de compensação).

4. Neuroquantification

1. Após as lâminas secaram, eles podem ser avaliados com software neuroquantification especializados. Aqui BIOQUANT software é utilizada para quantificar as células vasopressina-positivos e fibras no núcleo paraventricular do cérebro do rato (show software na tela ... e microscópio).
2. A área específica de interesse é identificado usando as opções de mediçãodo software para estabelecer o campo visual para neuroquantification. É importante que um tamanho do campo visual consistente é quantificado para cada animal (estudante mostrar fazendo isso).
3. Aqui, a coloração escura corpos vasopressina-imunorreativa de células e fibras são aparentes. Porque é difícil de contar ou rastrear esse tecido, uma característica especial deste software usa thresholding luz para determinar a quantidade total de tecido marcadas positivamente dentro da área especificada de interesse. Este thresholding nos diz como grande parte da área especificada contida vasopressina positivo tecido (mostrar o valor dos dados na tela do computador).

5. Análise comportamental

1. Se mais de um observador será marcar as fitas de vídeo, é importante estabelecer inter-rater confiabilidade para assegurar que os observadores estão marcando o comportamento de uma forma consistente. Para a sessão de pontuação actual, uma folha de pontuação comportamento deve ser preparado para permitir a fácil pontuação de comportamento durante as sessões de observação (ver Tabela 2, por exemplo de planilha de pontuação).
2. Para comportamentos que não são rápidas respostas episódica, uma análise microsequencing pode revelar sutilezas sobre a evolução das respostas específicas. Por exemplo, grooming comportamento consiste de uma cadeia de respostas muito rápidas. Apesar de uma opção é simplesmente registrar a presença e duração de grooming, outra é documentar a cadeia de eventos que acompanham essa resposta. Usando este software microsequencing, observadores marcar a presença de um comportamento particular a cada segundo, conforme solicitado pelo software (software show e vídeo).
3. Após coleta de dados, os parâmetros de interesse são determinados e os escores comportamentais apropriadas são analisados. Exemplos podem ser duração total de tempo gasto em contato com o filhote, ou o número de interrupções na seqüência da preparação (show computador com planilha com os dados inseridos para cada animal).
4. Uma vez que o comportamento é marcado, é importante para confirmar que as duas espécies apresentaram diferentes estratégias de resposta para o comportamento de interesse no estudo. Neste caso, a ratos de cervos Califórnia deve exibir um comportamento mais paternal do que os ratos de cervos comuns. Além disso, várias medidas comportamentais podem ser correlacionados com medidas cérebro para obter uma visão mais informada das influências relevantes.

6. Resultados representativos:

1. Para validar o modelo, os dados devem indicar claramente que as duas espécies realizada de forma diferente com relação ao comportamento de interesse. Aqui você vê que o P. californicus machos passaram mais tempo grooming e agachado sobre os filhotes, duas marcas de respostas paterna (ver Figura 4).
2. A fim de determinar se a variável neurobiologial de interesse é importante nas respostas paternal, a quantidade de vasopressina (AVP)-positivo tecidos foi quantificada de várias áreas cerebrais relevantes, como pode ser visto, o P. paternal animais californicus tinha mais tecido imuno-positivos em várias destas áreas do cérebro. (Ver Figura 5).
3. Em um estudo relacionado com a análise microsequencing, se a hipótese de que os ratos paternal Califórnia apresentaria menos ansiedade do que suas contrapartes virgem e, consequentemente, quando expostos a um odor predador, os pais apresentaram menos interrupções na seqüência da preparação do que os animais virgem (ver Figura 6).

Figura 1: (A) ratos Masculino Califórnia exibiam respostas paternal para com conspecific filhote alien. (B) do mouse veados Masculino exibindo uma abordagem cautelosa (estiramento participar) e resposta de esquiva na presença de um estrangeiro conspecific filhote. Nota: Nestas avaliações interação social, se um homem apresenta respostas agressivas em direção ao cachorro, os pesquisadores logo atingiu o topo da gaiola para distrair os homens. Neste momento a sessão é encerrada e que o filhote é removido, inspecionado para todas as feridas e voltou para a mãe. Em nosso laboratório, isso raramente é observado com P. machos californicus, mas ocasionalmente é observado com P. maniculatus; observação e intervenção imediata, no entanto, evitar que haja danos aos animais.

Figura 2: Um rato Califórnia interagindo com um rato de brinquedo, a maioria tentou mastigar esses estímulos.

Figura 3: O delineamento experimental do estudo, havia cerca de seis animais de cada grupo para cada espécie.

Figura 4: Gráfico do processo de imunocitoquímica.

Figoure 5 respostas paterna na Califórnia e ratos de cervos;. respostas mais paternal (noivo, crouch, abordagem mais rápida) foram observados nos ratos Califórnia. Mais trecho atende (resposta ao estresse) foram observados nos ratos de cervos.

Figura 6. Imunorreatividade vasopressina em áreas do cérebro diferentes das duas espécies. Os ratos Califórnia tinha mais coloração nas células PVN e fibras.

Figura 7: ratos Paternal Califórnia exibiram menos interrupções em suas seqüências de preparação na presença de um predador que o odor das crias grupos expostos e virgem.

Discussão

Este artigo discute três componentes essenciais pensado para ser crítico para a execução bem sucedida de investigações neurociência comportamental: (1) um modelo animal representativo e válido; (2) um protocolo de imunocitoquímica precisas e sensíveis, e (3) a análise a mais (de observação e estatística ) de ambos os dados comportamentais e cérebro. Erros em uma única categoria certamente vai comprometer os resultados de todo o estudo. Assim, após seleção cuidadosa do modelo animal apropriado, um considerável esforço deve ser dirigido para piloto de testes a procedimentos comportamentais e histológicas para assegurar que o comportamento será confiável observadas no estudo, seguido pelo tratamento bem sucedido do cérebro.

Como mencionado anteriormente, o uso de espécies comparativa para identificar mecanismos neurobiológicos de uma resposta particular é uma abordagem metodológica valiosa porque esta técnica não requer a engenharia genética ou dolorosa manipulações cirúrgicas. Assim, esta abordagem metodológica utiliza menos ameaçados, animais intactos. O uso de variações naturais de animais, no entanto, é reforçada pela incorporação de ambientes naturais-como ainda se os animais estão alojados em laboratório. Além disso, se estudos de laboratório pode ser estendido para o campo para continuar a validar a autenticidade das diferenças no comportamento de espécies de interesse, o próximo passo é recomendado. Embora a abordagem comparativa oferece muitas vantagens, uma limitação é a natureza correlativa dos dados e, conseqüentemente, técnicas adicionais, tais como as manipulações farmacológicas devem ser usados ​​para validar ainda mais o papel de alvo sistemas neurobiológicos no comportamento de interesse.

Uma vez que os experimentadores se sentir confiante sobre os procedimentos comportamentais, histológicos e estatística, os cuidados devem ser tomados para que as condições de vida dos animais permanecem constantes para todos os grupos, exceto, é claro, para a manipulação experimental. Mudanças em variáveis ​​tais como horários de luz, níveis de ruído, cuidadores, níveis de umidade e odores em laboratório poderia ter efeitos significativos sobre as respostas dos animais neurobiológicos.

Neste artigo o anticorpo primário foi utilizado para a detecção de vasopressina, mas outros anticorpos primários podem ser usados ​​para uma infinidade de substâncias neuroquímicas de interesse diferentes. Se o pesquisador está trabalhando com um novo anticorpo, é importante a realização de estudos de titulação para determinar a diluição ideal do anticorpo novo. Muitas vezes anticorpo é muito usado (como sugerido pelo fabricante), resultando em tecido que é escuro demais para diferenciar o sinal; ainda mais, o uso excessivo do anticorpo é muito caro.

Finalmente, se mais de uma única análise estatística pode ser usada para fornecer visões alternativas e interpretações dos dados, eles devem ser utilizados. Neste estudo particular, modelos lineares, correlacional, e análises de escalonamento multidimensional foram usados ​​para fornecer os pontos de vista mais informativo dos dados.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Microscópio composto binocular	Motic	BA400
Software Ciência BIOQUANT Vida	Analysis Corporation BIOQUANT Imagem	Versão 8.40.20
Criostato	Microm	HM525
Masterflex Console Easy Drive-Load L / S (bomba de perfusão)	Cole-Parmer Instrument Company	7518-00
24 Cluster Cultura Bem Cell (cultura de tecidos tratados; apirogénico poliestireno; estéril)	Corning Costar	3526
25x75x1mm Lâminas de microscopia	Globe Scientific, Inc.	1324W
Lamínula 22x50mm No.1	Globe Scientific, Inc.	1414-1410
Não estéreis 3mL Pipetas graduadas Transferência Grande Bulb	Microscopia Eletrônica de Ciências	70962-9	&nbps;
Alconox detergente em pó	Alconox	1104
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S9888-1kg	CAS 7647-14-5
Fosfato de sódio monobásico	Espectro	SO130	CAS 10049-21-5
Fosfato de sódio dibásico di-hidratado	Sigma-Aldrich	30412	CAS 10028-24-7
Triton X	Espectro	TR135	CAS 9002-93-1
Permount	Pescador	SP15-500	CAS 108-88-3
Cromo sulfato de potássio	Sigma	C-5926	CAS 7788-99-0
CitriSolv	Fisher Scientific	22-143975
Etanol, alta Garrafas Den.Poly, 200 provas, 24 x 1 litro	Pharmco-AAPER	111000200CSPP
Soro normal de cabra	Vetor	S-1000
Coelho anti reagente específico analito vasopressina	Immunostar, Inc.	20069
Biotinilado anti-IgG de coelho (H + L) purificadas por afinidade,	Vetor	BA-1000
Elite Padrão Vectastain ABC Kit	Vetor	PK-6100
Kit DAB substrato da peroxidase	Vetor	SK-4100
Original gelatina sem sabor (4 contagem de envelopes) 1-oz caixa	Knox		Compra na mercearia local
Peróxido de hidrogênio 3%	CareOne		Compra na farmácia local
Alvejante	Clorox		Compra na mercearia local