Indução e Monitoramento de hipersensibilidade tardia-Type Adoptive em Ratos

Resumo

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por CCR7-efetoras de memória T (TEM) linfócitos. Aqui demonstramos como ativar células antígeno-específicas TEM, induzir DTH adotivos em ratos Lewis e monitorar a resposta inflamatória.

Resumo

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por linfócitos efetores CCR7-T de memória que infiltram o local da injeção de um antígeno contra o qual o sistema imunológico tem sido preparado. A reação inflamatória é caracterizada por vermelhidão e inchaço do local de desafio antigênico. É um modelo conveniente para determinar a eficácia in vivo de imunossupressores. DTH cutânea pode ser induzida ou por transferência adotiva de linfócitos T antígeno-específicos ou por imunização ativa com um antígeno e subseqüente desafio intradérmico com o antígeno para induzir a reação inflamatória da pele em uma área determinada. Respostas DTH pode ser induzida a vários antígenos, para a ovalbumina exemplo, a tuberculina, toxóide tetânico, ou hemocianina limpet buraco da fechadura. Tais reações também pode ser induzida contra autoantígeno, por exemplo, para proteína básica da mielina (MBP) em ratos com encefalomielite auto-imune experimental induzida com MBP, um modelo animal para a esclerose múltipla (1). Aqui demonstramos como para induzir uma reação adotivos DTH em ratos Lewis. Vamos primeiro estimulam as células T específicas ovalbumina in vitro e injetar essas células ativadas por via intraperitoneal em ratos ingênuos. Depois de permitir que as células para equilibrar in vivo por 2 dias, vamos desafiar os ratos com ovalbumina no pavilhão auricular de uma orelha, enquanto a outra orelha wil receber solução salina. A reação inflamatória será visível 3-72 horas depois e espessura de ouvido será medido como uma indicação da gravidade da DTH.

Protocolo

1. Estimulação dos linfócitos T específicos ovalbumina

Descansando células ovalbumina específico T são estimuladas com ovalbumina na presença de ratos irradiados timócitos Lewis (30 Gy) como células apresentadoras de antígenos (APCs), no Médio Estimulação (Prepare em DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitaminas + + 2ME Rat Serum + ovalbumina, nas concentrações finais observou na lista de materiais.)

Preparação do soro de ratos

1. Tomamos soro dos ratos nos sacrificamos como doadores timo.
2. Os ratos são profundamente anestesiado por inalação de halotano e tanto sangue quanto possível é desenhada por perfusão cardíaca (50-10 ml por rato), utilizando 10 seringas ml e 23 G 1 "agulhas, após o que os ratos são imediatamente decapitado para garantir a morte.
3. O sangue é permitida a coagular por 10 min a 37 ° C seguido por 10 min no gelo.
4. O coágulo é removido eo líquido restante fiadas.
5. O soro é coletado, filtrado estéril e armazenado a -20 ° C.

Preparação das células apresentadoras de antígenos

1. Leve o timo de um rato decapitado utilizando instrumentos estéreis e colocá-lo em PBS contendo penicilina e estreptomicina (PBS-PS), sobre o gelo.
2. Leve o timo de um capuz de cultura de tecidos, limpe-o de coágulos sanguíneos e tecido contaminar outras e corte-o em pequenos pedaços em uma peneira de células (Fisher # 08-771-2) colocado em um prato de 10 centímetros de petri contendo 10 ml de PBS- PS.
3. Cada peça é pressionado através do filtro de células usando as costas de um êmbolo da seringa estéril 1 ml. Recolher a suspensão única célula em um tubo de 50 ml no gelo.
4. Lavar o filtro de células com 20-40 ml de PBS mais-PS. Centrifugar a suspensão de 1250g e ressuspender o sedimento em PBS-PS, 5 ml / timo, sobre o gelo.
5. Irradiar esta suspensão (30 Gy) em um irradiador gama e lave-o duas vezes com 50 ml de PBS-PS.
   
   Nota: O melhor doadores timo são ratos adultos jovens, 5-7 semanas de idade. Ratos até 10 semanas pode ser usado, mas o número de células diminui com o tempo. Sexo não é importante, embora algumas pessoas dizem que os homens são melhores doadores timo. Nós sempre usamos fêmeas porque todos os nossos animais são alojados no mesmo quarto e nós não queremos homens e mulheres na mesma sala.
   

Estimulação

1. Lavar os linfócitos T uma vez e contá-las.
2. Contar as células apresentadoras de antígenos.
3. Mix 3 x 10 ⁶ ovalbumina específicas de células T com 150 x 10 ⁶ APCs em um prato de 10 centímetros de petri contendo 10 ml de meio de estimulação.
4. Incubar por 48 horas a 37 ° C.

2. Transferência adotiva dos linfócitos T específicos ovalbumina

1. Os ratos que usamos como destinatários são do sexo feminino 70-10 semanas de idade.
2. Contar os linfócitos T, elas devem ser grandes e redondos. As células apresentadoras de antígenos será morto.
3. Centrifugar os linfócitos T e ressuspenda-los em 10 x 10 ⁶ células / ml em PBS.
4. Injectar 1 ml por via intraperitoneal com 3 seringas ml e 23 G 1 "agulhas.

3. Desafio com antígeno no ouvido

1. Dois dias após a transferência adotiva, injetar 20 l de 1 mg / ml solução ovalbumina (= antígeno relevante) por um ouvido e salinas (ou antígeno irrelevante) na outra orelha. Não filtrar a solução antígeno como você pode perder agregados que aumentam a reação inflamatória.
   
   Nota: Os ratos devem ser anestesiados para evitar movimentos. Se você é destro, segure a orelha entre o polegar eo dedo indicador esquerdo, o dedo indicador estar dentro da orelha e do rato voltado para você.
   
   
2. Injetar a solução no pavilhão da orelha usando 27G ½ "agulhas. Tente injetar todos os ratos exatamente no mesmo lugar.

4. Medição de DTH

1. O ouvido começa a ficar vermelha e inchar como um sinal de inflamação. Medir a espessura de cada orelha com um micrômetro de mola (por exemplo modelo PK-0505 da Mitutoyo).
2. Tome 5-6 medições para cada orelha em cada ponto do tempo e calcular a média.
3. O inchaço máxima deve ocorrer entre 24 e 72 horas.

Discussão

O desafio antigênico também pode ser realizada em outros locais, por exemplo, na pele do dorso (2). Nós, no entanto descobrir que um desafio. Usando o pavilhão da orelha, como mostra este vídeo, permite a medição mais precisa da reação DTH.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	12430-062	500ml
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	1 mM final, in Stimulation medium
Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine	Cambrex/BioWhittaker	17-718R	100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium
Non essential amino acids	Sigma-Aldrich	R7131	NEAA, 1% final, in Stimulation Medium
RPMI vitamins	Sigma-Aldrich	R7256	1% final, in Stimulation medium
beta-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M6250	2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium
Syngeneic rat serum			1% final. See explanation in Protocol.
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5503	10 μg/ml final, in Stimulation Medium.